野生大型真菌總黃酮含量比較分析

巫桂芬，嚴(yán)煥丹

（廣西民族師范學(xué)院，廣西崇左 532200）

0 引言

大型真菌是菌物中形成大型子實體的一類菌，在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌綱，少數(shù)屬于子囊菌綱[1]。大型真菌廣泛分布于山林、草原、田野、墻角等。根據(jù)其生境的不同可分為地生真菌、木生真菌、共生真菌。大型真菌的子實體形態(tài)差異較大，有些相似于球形，如樹舌靈芝的最大子實體的直徑可達(dá)到1 m，而有些小型傘菌的菌蓋直徑和子實體的高度僅有幾毫米[2]。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)分布的大型真菌有1萬種以上，其中能食用的真菌有1789種，藥用真菌有798種[3-4]。

黃酮類化合物是天然存在的一大類物質(zhì)，主要以游離態(tài)或糖苷形式存在，是受到廣泛關(guān)注的天然活性化合物之一[5]。多數(shù)的學(xué)者認(rèn)為黃酮類化合物主要是以2-苯基色原酮為基本母核的一系列化合物，現(xiàn)已知的黃酮類化合物有8000余種[6-8]。研究表明，很多大型真菌體內(nèi)含有豐富的黃酮類化合物，這類化合物具有多種生物活性，如抗氧化、抗癌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫能力等[9-11]。黃酮類化合物可用于治療多種疾病，還可用于化妝品、工業(yè)生產(chǎn)中[12-13]。

總黃酮含量的提取常用的方法有熱水提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、酶輔助提取法等[14-15]。熱水提取簡單環(huán)保，但提取率低。有機(jī)溶劑萃取法簡單、成本低、操作方便，應(yīng)用范圍廣，但是操作步驟多，溶劑消耗大[16-17]。超聲波輔助提取法具有操作方便、耗時短、有效成分提取效率高、原料利用率高、污染小等特點[18-20]。分光光度法操作簡單、重復(fù)性好，是總黃酮含量測定最常用的方法[21-22]。

本研究采用超聲波提取法對8種野生大型真菌進(jìn)行總黃酮含量的提取，并采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法進(jìn)行總黃酮含量測定。旨在通過野生大型真菌總黃酮含量的比較分析，為野生大型真菌的開發(fā)利用及黃酮類化合物的生物合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以2020 年10 月在廣西崇左市園博園采摘，參考《中國真菌名目》整理篩選出8種大型真菌作為實驗材料，相關(guān)信息如表1。采回的實驗材料進(jìn)行預(yù)處理，將子實體表面泥土等雜質(zhì)去除干凈，沖洗，晾干表面水分，放入烘箱(70℃，8 h)烘干，粉碎過60目篩后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗材料相關(guān)信息

1.2 儀器設(shè)備與試劑

無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水三氯化鐵、濃硫酸、氨水，上述試劑均為分析純。

電子天平(FA20048)、紫外可見分光光度計(UV759RT)購于上海偌科儀表有限公司，超聲波清洗器(KQ-500DE)購于昆山美美超聲儀器有限公司，離心沉淀器(80-2)購于金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取蘆丁10 mg，加60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(0.20 mg/mL)。參照龍華等[23-24]的方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁含量為0 的處理為空白對照，利用紫外分光光度計于510 nm波長處測定吸光度值。

1.3.2 總黃酮提取液的制備準(zhǔn)確稱取1.00 g的上述大型真菌干粉樣品于100.00 mL錐形瓶內(nèi)，緩慢加入50 mL 60%乙醇，在功率為300 W、溫度60℃條件下超聲提取40 min。提取液以轉(zhuǎn)速為3000 r/min，離心15 min。離心結(jié)束后小心吸取出上清液并加入60%乙醇溶液定容至50 mL，存放于4℃冰箱待測。

1.3.3 總黃酮含量測定精確移取黃酮提取液1.00 mL至10 mL 容量瓶內(nèi)，加入5% NaNO2溶液0.40 mL，搖勻放置6 min；加入10%的Al(NO3)3溶液0.40 mL，搖勻放置6 min；最后加1 mol/mL NaOH 溶液4.00 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，置于最大吸收波長510 nm處測定吸光度值，以蘆丁含量為0的處理為空白對照。總黃酮含量測定計算如式(1)。

式中，C表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算所得到的總黃酮質(zhì)量濃度，n表示所稀釋的溶液倍數(shù)，V表示提取液所定容的體積，m表示大型真菌稱取的質(zhì)量[25-26]。

1.4 方法考察

1.4.1 精密度和重復(fù)性實驗以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及瓦尼纖孔菌分別進(jìn)行精密度和重復(fù)性試驗方法的考察，瓦尼纖孔菌樣品按1.3.2、1.3.3 的方法進(jìn)行提取與測定，并在510 nm 下測吸光度值，重復(fù)測定5 次。分析其瓦尼纖孔菌樣總黃酮的含量。在完全相同的條件下同時進(jìn)行多次蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品測定試驗考察該方法的精密度，在其他條件完全相同的情況下不同時間內(nèi)進(jìn)行多次總黃酮測定試驗考察該方法的重復(fù)性。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算如式(2)[27]。

式中，RSD表示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，S表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，X表示樣品平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差反映了試驗的精密度，標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，測量值偏離平均值越少。

1.4.2 顯色穩(wěn)定性實驗 以瓦尼纖孔菌試驗材料按1.3.2、1.3.3 的方法進(jìn)行總黃酮含量的提取與測定，并根據(jù)物質(zhì)反應(yīng)的時間延后性，每間隔10 min取瓦尼纖孔菌黃酮提取液測定其吸光值，共測量7次，分析總黃酮含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量控制與方法考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0077x+0.0678，R2=0.9861，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光值的線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度和重復(fù)性實驗在510 nm 處測蘆丁吸光度值，所測結(jié)果如表2。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品平均吸光度值為0.366，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.73%(n=5)，說明該方法能比較精確地測定吸光度值且儀器精密度良好。

表2 精密度重復(fù)性實驗結(jié)果

瓦尼纖孔菌總黃酮均值為41.623 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.7%。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液與瓦尼纖孔菌總黃酮含量的RSD均在7%以下，表明儀器精密度良好，該方法重復(fù)性良好，條件合理。

2.1.3 顯色穩(wěn)定性實驗 按照1.3.2 方法提取后，在510 nm處，每隔10 min測定吸光度值，連續(xù)測7次。瓦尼纖孔菌60 min內(nèi)總黃酮含量變化結(jié)果如圖2。瓦尼纖孔菌在0～10 min總黃酮含量變化是較大，說明在這段時間對總黃酮含量進(jìn)行測定所得到的結(jié)果不夠準(zhǔn)確，需等顯色反應(yīng)到一定的時間再進(jìn)行測定；10～30 min總黃酮含量比較平穩(wěn)，沒有太大的波動，這段時間中樣品的總黃酮含量相差僅0.9741 mg/g；在30～40 min 和40～50 min 階段該菌有下降趨勢，特別是在40～50 min有相對較明顯的下降趨勢，此時樣品的總黃酮含量相差1.2987 mg/g；50～60 min 階段該樣品總黃酮含量又恢復(fù)平穩(wěn)狀態(tài)，樣品在這段時間的總黃酮含量僅差0.3247 mg/g。瓦尼纖孔菌在0～60 min 的總黃酮含量相差4.5455 mg/g。樣品總黃酮平均含量為41.9017 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.99%，樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%。由此可以看出，樣品在測定60 min內(nèi)顯色，雖在某些節(jié)點上有一定的下降趨勢，但總體水平仍較為穩(wěn)定。

圖2 瓦尼纖孔菌60 min內(nèi)總黃酮含量變化

2.2 野生大型真菌總黃酮含量分析

由圖3 可知，不同大型真菌總黃酮含量存在差異性，總黃酮平均含量為18.646 mg/g。瓦尼纖孔菌總黃酮含量最高，變形薄孔菌次之，分別為39.740、32.273 mg/g。總黃酮含量最低的是樺附毛孔菌，含量為5.532 mg/g。其中，瓦尼纖孔菌和樺附毛孔菌總黃酮含量相差34.210 mg/g。瓦尼纖孔菌、木蹄層孔菌及變形薄孔菌總黃酮含量分別與其余7種大型真菌存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。膨大革孔菌、迷宮栓孔菌及藥用擬層孔菌之間的總黃酮含量無顯著性差異，忍冬纖孔菌與樺附毛孔菌的總黃酮含量無顯著性差異，表明多孔菌屬部分品種間總黃酮含量存在較大差異。

圖3 大型真菌總黃酮含量分析

3 結(jié)論與討論

本研究采用超聲波輔助提取及亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法對8種不同的野生大型真菌總黃酮含量進(jìn)行提取與分析。結(jié)果表明，該方法的精密度、重復(fù)性良好，8種大型真菌均含有黃酮類化合物，且總黃酮含量存在較大差異性。所測得的總黃酮含量由高到低依次為瓦尼纖孔菌、變形薄孔菌、木蹄層孔菌、迷宮栓孔菌、藥用擬層孔菌、膨大革孔菌、忍冬纖孔菌、樺附毛孔菌。瓦尼纖孔菌和樺附毛孔菌總黃酮含量相差34.210 mg/g，說明同屬不同科或同科不同種間生物體所含的總黃酮含量有差異。同一品種的真菌由于生長年限不同，物質(zhì)積累也存在一定的差異[17]。另外，生長環(huán)境對于生物體內(nèi)黃酮類化合物的積累也有一定的影響。在生物體機(jī)能正常的情況下，其體內(nèi)黃酮類化合物隨著生長時間延長黃酮含量增大[27]。所以在進(jìn)行野生大型真菌總黃酮含量分析時，應(yīng)該根據(jù)真菌的生長“年輪”及其他特征判斷生長時間，選擇時間相當(dāng)?shù)淖訉嶓w進(jìn)行分析，有利于提高分析的準(zhǔn)確性。

野生大型真菌是具有較高研究價值的菌群，物種豐富，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，物質(zhì)資源多樣，且具有廣泛的生物活性，具有廣闊的研究前景。近年來，許多研究人員對野生大型真菌不斷探索，無論是在藥業(yè)、化工業(yè)、化妝品等行業(yè)都具有一定的研究價值。瓦尼纖孔菌（楊黃）是一種新的藥用真菌，國內(nèi)研究者曾經(jīng)在吉林省長白山地區(qū)發(fā)現(xiàn)該菌，目前在左江流域也發(fā)現(xiàn)了該菌種，研究表明瓦尼纖孔菌在黃酮類化合物開發(fā)上具有很大的研究意義和開發(fā)價值。本研究通過對左江流域特色大型真菌總黃酮含量分析，掌握了部分野生大型真菌體內(nèi)黃酮的分布規(guī)律，但由于資源收集受限，實驗材料僅為左江流域部分人工園林秋季收集的野生大型真菌。今后研究應(yīng)在不同季節(jié)收集野生大型真菌，同時擴(kuò)大資源收集范圍，重點收集和探討國家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)野生大型真菌黃酮含量分布規(guī)律，為左江流域特色大型真菌資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。