15種中草藥提取物對百香果莖基腐病菌的抑制效果

楊翠鳳，滕崢，劉正魯，韓婷婷，江春分

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000）

0 引言

百香果(Passiflora edulia)是西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)爬藤植物，典型的果汁型熱帶經(jīng)濟(jì)水果，具有豐富的食用價值、藥用價值和觀賞價值[1]，是國內(nèi)熱帶及亞熱帶地區(qū)近年來大力推廣種植栽培的經(jīng)濟(jì)作物之一。百香果莖基腐病是一種毀滅性極強(qiáng)的土傳病害[2]，由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)[3-5]、腐皮鐮刀菌(F.solani)[6-8]、茄孢鐮刀菌(F.solani)[9]等多種鐮刀菌真菌單一或聯(lián)合侵染引起。莖基腐病的發(fā)生貫穿于百香果種植的全過程，植株地上部分5～10 cm 處的莖基部最易受到為害。若該病發(fā)生在植株幼年時期，會導(dǎo)致葉片產(chǎn)生褪色并脫落的現(xiàn)象發(fā)生，造成植株無法完成自身生命活動，最終導(dǎo)致幼苗枯死。若該病發(fā)生在植株成年時期，病斑由最初的水漬狀逐漸發(fā)展為深褐色，發(fā)病區(qū)域的皮層凹陷變軟，直至腐爛，隨著莖基腐病的發(fā)展，病斑向四周擴(kuò)散10～20 cm 的距離范圍，造成皮層與木質(zhì)部分離，影響植物的水分和營養(yǎng)運(yùn)輸，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植物體滅亡；在空氣濕度大的環(huán)境下，染病植株發(fā)病部位常出現(xiàn)橘紅色或紅褐色的病原物和白色絮狀物，為病菌的孢子繁殖體和菌絲體[10-12]。

中草藥提取物也稱植物源提取物，是指采用一定的技術(shù)方法對植物的根、莖、葉、花、果實(shí)進(jìn)行提取，以獲取對植物病原菌具有抑制生長或消滅作用的一類物質(zhì)，用于防治作物病害，又不影響作物的正常生長。中草藥提取物具有安全、高效、環(huán)保等化學(xué)農(nóng)藥無法達(dá)到的優(yōu)點(diǎn)，對外界不會產(chǎn)生毒副作用，可對作物病害進(jìn)行靶向治療[13-14]。中草藥提取物經(jīng)加工可制成植物源殺菌劑使用[15]，用于真菌引起的病害防治研究得到重視[16]。馬偉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，知母、蛇床子等提取物對黃氏根腐病病原菌尖孢鐮刀菌有抑制效果；鄭瑞瑞[18]研究發(fā)現(xiàn)，丁香等提取物對西瓜尖孢鐮刀菌萎蔫病有抑制作用；薛麗芳等[15]研究證明，細(xì)辛提取物可以有效抑制紅蕓豆尖孢鐮刀菌根腐??；姚秉富[19]研究發(fā)現(xiàn)，紫荊澤蘭對尖孢鐮刀菌具有顯著作用；何曉婷等[20]研究發(fā)現(xiàn)，苦楝子等7 種中草藥提取物對三七根腐病菌有抑制作用。筆者探究15 種中草藥提取物對百香果莖基腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果，以期為百香果莖基腐病綠色防治提供科學(xué)有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種為課題組前期分離鑒定并保育的百香果莖基腐病病原菌尖孢鐮刀菌。供試的15種中草藥及提取部位詳細(xì)見表1，均購自百色市右江區(qū)大參林藥店。

表1 15種中草藥名稱及提取部位

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 主要試劑PDA 培養(yǎng)基、無水乙醇(99.7%)、蒸餾水、蔗糖、瓊脂粉等。

1.2.2 主要儀器臺式（數(shù)顯）低速離心機(jī)、電子天平、數(shù)控超聲波清洗器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水真空泵、低溫冷卻液循環(huán)泵、生化培養(yǎng)箱、小型高速粉碎機(jī)、微波爐、超凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 中草藥提取物的制備

將供試的15種中草藥用小型高速粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取中草藥粉末50 g置于250 mL錐形瓶，加入60%乙醇溶液200 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），充分混均后密封靜置48 h。靜置過程中，每24 h 使用數(shù)控超聲波清洗器對浸泡中的中草藥進(jìn)行水浴提取一次，溫度55℃，時間30 min，頻率80 Hz。8層紗布過濾后，使用離心管分裝離心(4000 r/min，10 min)，取上清液。將上清液倒入已預(yù)熱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋(65℃，65 r/min)轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確量取50 mL 60%乙醇溶液，倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中進(jìn)行洗脫，洗脫完畢即可得到濃度為1 g/mL的中草藥提取原液，然后將1 g/mL的中草藥提取原液用25 mm×0.25 μm的有機(jī)系過濾器進(jìn)行過濾除菌，4℃冷藏備用。

1.4 平板抑菌試驗(yàn)

1.4.1 初篩試驗(yàn)制備帶藥培養(yǎng)基（吸取上述提取原液6 mL 加至94 mL 解凍的PDA 固體培養(yǎng)基中混勻后倒平板），中草藥提取物終濃度為60 mg/mL，接種時將菌餅倒置于帶藥平板中央，28℃條件下培養(yǎng)7 d，測定菌絲生長至7 d 的菌落直徑并拍照記錄。每個處理設(shè)3個重復(fù)，以不加藥的PDA培養(yǎng)基為空白對照(CK)。

1.4.2 梯度試驗(yàn)初篩試驗(yàn)中15 種中草藥均有不同程度的抑制效果，為篩選每種中草藥的最佳抑制濃度，制備不同濃度的帶藥培養(yǎng)基，將中草藥提取物終濃度梯度設(shè)置為20、40、60、80、100 mg/mL。以不加藥的PDA培養(yǎng)基為空白對照(CK)，具體配制方法、接種方法及觀察數(shù)據(jù)同初篩試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

按照式(1)～(2)計(jì)算菌落直徑和菌絲生長抑制率。

采用Excel 和SPSS 軟件處理病原菌菌絲生長的相關(guān)數(shù)據(jù)，并將不同中草藥種類的醇提物抑菌率轉(zhuǎn)換為概率值(y)，不同種類中草藥的濃度轉(zhuǎn)換為對數(shù)值(x)，采用回歸法計(jì)算出不同中草藥醇提物對莖基腐病原菌的毒力回歸方程y=ax+b，計(jì)算出抑制中濃度EC50和相關(guān)系數(shù)r。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥提取物抑菌初篩試驗(yàn)結(jié)果

在濃度為60 mg/mL 時，15 種中草藥提取物對百香果莖基腐病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（表2、圖1）。觀察菌絲生長7 d，發(fā)現(xiàn)抑制效果最好的中草藥提取物是丁香，抑菌率達(dá)100%；其次為川芎、高良姜、當(dāng)歸和黃連，抑菌率為97.62%～90.48%；在此濃度下，百部、黃精和地膚子提取液抑菌效果較差，抑菌率分別為56.28%、31.38%、12.77%。該濃度下，15種中草藥提取物的抑菌效果由強(qiáng)至弱為丁香＞川芎＞高良姜＞當(dāng)歸＞黃連＞黃芩＞厚樸＞木香＞板藍(lán)根＞萊菔子＞細(xì)辛＞艾葉＞百部＞黃精＞地膚子。

圖1 60 mg/mL中草藥提取物濃度對尖孢鐮刀菌的抑制效果

表2 60 mg/mL中草藥提取物濃度對尖孢鐮刀菌的抑制效果

2.2 中草藥提取物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果

對15 種中草藥進(jìn)行20～100 mg/mL 濃度梯度試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各中草藥提取物的濃度與抑制率之間存在明顯的線性關(guān)系（表3）。丁香提取物抑制效果最佳，在20～100 mg/mL濃度處理下的抑制率均為100%；川芎、高良姜和萊菔子提取物在濃度為80～100 mg/mL 濃度時，抑制率可達(dá)到100%；當(dāng)歸濃度為100 mg/mL 濃度時，抑制率亦可達(dá)到100%。

表3 中草藥提取物濃度梯度抑制效果

2.3 中草藥提取物室內(nèi)毒力測定

毒力回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，各中草藥提取物的濃度與抑制率之間存在明顯的線性關(guān)系（表4）。毒力回歸方程體現(xiàn)的是中草藥提取物濃度與抑菌率之間的關(guān)系，EC50表示抑菌效果達(dá)到一半時的中濃度，EC50數(shù)值越小越好，意味著達(dá)到相同的抑菌所需的中草藥濃度越低。15種中草藥提取物的EC50值由低到高、抑菌效果由強(qiáng)至弱可表示為丁香＞川芎＞高良姜＞厚樸＞黃連＞木香＞當(dāng)歸＞萊菔子＞黃芩＞細(xì)辛＞艾葉＞板藍(lán)根＞百部＞黃精＞地膚子。

表4 中草藥提取物對百香果莖基腐病菌的毒力回歸方程

3 結(jié)論

中草藥提取物以天然、安全、高效、低毒、無污染等優(yōu)點(diǎn)得到人們的青睞。本研究中，15 種中草藥提取物對尖孢鐮刀菌抑制作用有差異，且抑菌率與濃度正相關(guān)，提取物濃度越高抑制率效果越好，室內(nèi)毒力測定研究結(jié)果表明，15 種中草藥抑菌效果由強(qiáng)至弱為丁香＞川芎＞高良姜＞厚樸＞黃連＞木香＞當(dāng)歸＞萊菔子＞黃芩＞細(xì)辛＞艾葉＞板藍(lán)根＞百部＞黃精＞地膚子，其中丁香、川芎、高良姜EC50分別是1.46、1.66、1.81 mg/mL，抑菌效果最佳。本研究試驗(yàn)結(jié)果可為今后開展中草藥提取物或植物源農(nóng)藥對百香果莖基腐病田間防治試驗(yàn)提供理論參考依據(jù)。

4 討論

植物枯萎、莖腐等病害大多是由土傳真菌鐮刀菌屬致病菌引起，約有70 個種，主要包括茄腐皮鐮刀菌(F. solani)、尖鐮孢菌(F. oxyporum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、輪狀鐮刀菌(F. verticillioides)等[21]，以上鐮刀菌多為產(chǎn)毒真菌，一旦引發(fā)致病，則防治難度大。研究認(rèn)為，引起廣東百香果莖基腐病的病原菌為茄腐皮鐮刀菌(F.solani)[6]，引起廣西百香果莖基腐病的病原菌為尖鐮孢菌(F.oxyporum)[3]，而福建地區(qū)產(chǎn)地則同時分離到了茄腐皮鐮刀菌(F. solani) 和尖鐮孢菌(F.oxyporum)[22-23]。目前對于百香果莖基腐病的防治主要依賴于化學(xué)殺菌劑，相關(guān)生物防治的研究報道相對較少。

中草藥的抑制作用機(jī)理是通過中草藥的有效成分破壞病原菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，從而干擾病原菌的新陳代謝而抑菌。已有研究表明，丁香、川穹、萊菔子、黃連、木香、厚樸、細(xì)辛等提取物對多種植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑菌效果[24]。王樹桐等[25]報道丁香的乙醇提取物對香蕉鐮刀菌枯萎病原菌的抑菌率能夠達(dá)到100%，黃精的乙醇提取物對禾谷鐮刀菌的抑制率達(dá)60%以上。劉耀華等[26]報道地膚的乙醇提取物對尖孢鐮刀菌的抑制率達(dá)70%以上。謝晶等[27]報道川芎的乙醇提取物對柑橘病原菌的抑制明顯。萊菔子提取物對芒果蒂腐病病原菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效果[28]。黃連提取物對小麥赤霉菌、禾谷鐮孢菌、大豆根腐菌抑菌效果顯著[29]。厚樸提取物含有能抑制葡萄根腐病的物質(zhì)[21]。細(xì)辛提取物對紅蕓豆根腐病中的尖孢鐮刀菌有抑制效果[15]。木香提取物對棉花黃萎病病原菌的抑菌效果最好。本試驗(yàn)中，15種中草藥提取物的EC50值由低到高、抑菌效果由強(qiáng)至弱為丁香＞川芎＞高良姜＞厚樸＞黃連＞木香＞當(dāng)歸＞萊菔子＞黃芩＞細(xì)辛＞艾葉＞板藍(lán)根＞百部＞黃精＞地膚子。其中，丁香、川芎、高良姜抑制效果最佳，較低抑制濃度(20、80、80 mg/mL)下能完全抑制病原菌的生長，抑制率達(dá)到100%，EC50分別是1.46、1.66、1.81 mg/mL。

百香果莖基腐病屬鐮刀菌真菌引起的土傳病害，高溫高濕的氣候條件易引起病害暴發(fā)，導(dǎo)致產(chǎn)量驟減和經(jīng)濟(jì)損失。本研究只進(jìn)行了室內(nèi)毒力的測定，今后還應(yīng)結(jié)合田間抑菌試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選并研發(fā)適合在大田生長過程中使用的植物源殺菌劑。此外，中草藥提取物雖然以天然、安全、高效、低毒、無污染等優(yōu)點(diǎn)贏得人們的青睞，但大多研究者似乎只關(guān)注到其良好的抑菌活性物質(zhì)，而其對植株的影響卻鮮為人知，因此，對中草藥提取物抑菌的評價應(yīng)綜合多角度考慮，充分發(fā)揮其作用，為有害生物的綠色防治提供新途徑。