不同翅型棉蚜體內(nèi)游離氨基酸含量對(duì)比

安哲，馬妍，高雪珂，雒珺瑜，崔金杰，王麗，朱香鎮(zhèn)

（棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng) 455000）

棉蚜Aphis gossypii，屬半翅目蚜科，是棉田危害較為嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，其寄主植物廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)將近200 種植物能夠被棉蚜寄生。棉蚜刺吸取食、傳播病毒和分泌蜜露導(dǎo)致煤污病發(fā)生等危害，都會(huì)造成棉花產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。在國(guó)內(nèi)的棉花種植區(qū)，棉蚜已成為重要的監(jiān)測(cè)害蟲(chóng)之一[2-3]。

氨基酸在昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)中必不可少，是合成蛋白質(zhì)的重要物質(zhì)。游離氨基酸是生物體內(nèi)以游離態(tài)存在的氨基酸的統(tǒng)稱，是蚜蟲(chóng)體內(nèi)合成氮素的唯一來(lái)源，進(jìn)而參與其他生命物質(zhì)的合成[4]。昆蟲(chóng)血淋巴中游離氨基酸的分布通常與昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)相關(guān)，血淋巴中的游離氨基酸通常處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不同昆蟲(chóng)、甚至同一昆蟲(chóng)的不同組織或者不同發(fā)育階段血淋巴中的氨基酸都會(huì)有差異，即使在飼養(yǎng)條件相同的情況下，不同昆蟲(chóng)體內(nèi)游離氨基酸的種類與豐度也會(huì)有變化。研究表明，地理位置的不同會(huì)影響棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)游離氨基酸的含量，且在蛹期，棉鈴蟲(chóng)的游離氨基酸變化顯著[5]。說(shuō)明不同地理位置昆蟲(chóng)體內(nèi)游離氨基酸的差異可以反映環(huán)境因子對(duì)昆蟲(chóng)生理變化的影響。

棉花組織中的氨基酸、糖分是棉蚜的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，這些物質(zhì)與棉株的抗蚜性緊密相關(guān)。已有研究表明，游離氨基酸的含量變化能反映寄主植物與昆蟲(chóng)的相互作用以及昆蟲(chóng)如何適應(yīng)寄主植物的營(yíng)養(yǎng)改變[6]。筆者團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)不同翅型棉蚜的抗性、繁殖力等存在差異：相對(duì)于無(wú)翅蚜而言，有翅型的若蚜期更長(zhǎng)，生殖率較低，但有翅蚜的生殖期與壽命更長(zhǎng)，抗饑餓能力更強(qiáng)，且飛行感覺(jué)系統(tǒng)和尋找宿主的敏銳性更強(qiáng)[7-9]。因此，本研究擬分析不同翅型成蚜和若蚜的游離氨基酸種類和含量的差異，探討游離氨基酸在棉蚜生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

棉蚜為實(shí)驗(yàn)室多代飼養(yǎng)的種群，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為光照時(shí)間14 h/黑暗時(shí)間10 h，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度70%±5%。所用棉花品種為非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種中棉所49，室內(nèi)栽培條件為光照時(shí)間14h/ 黑暗時(shí)間10 h，溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度70%±10%。

1.2 供試化合物

供試化合物有磺基水楊酸、茚三酮緩沖液（三水乙酸鈉、醋酸鉀、苯酚、甲醇、異丙醇、茚三酮、乙酸、抗壞血酸）和4 種全自動(dòng)氨基酸分析儀專用緩沖液A、B、C、D（貨號(hào)：S000007CN、S000008CN、S000013CN、S000014CN，購(gòu)買(mǎi)自塞卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司）。磺基水楊酸、三水乙酸鈉、醋酸鉀購(gòu)買(mǎi)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，苯酚購(gòu)買(mǎi)自天津市大茂化學(xué)試劑公司，甲醇、異丙醇、乙酸購(gòu)買(mǎi)自上海生工生物工程股份有限公司，茚三酮晶體購(gòu)買(mǎi)自上海三愛(ài)思試劑有限公司，抗壞血酸購(gòu)買(mǎi)自索萊寶科技有限公司。所有試劑均為分析純等級(jí)。

1.3 樣品收集

取播種后10 d 左右的棉花幼苗，此時(shí)的棉花幼苗僅有2 片幼嫩的子葉，選擇葉片較大較厚的棉株，每株挑放生長(zhǎng)狀況較好的無(wú)翅棉蚜成蟲(chóng)10 頭左右，待其產(chǎn)仔24 h 后，移除棉蚜成蟲(chóng)，待仔蚜生長(zhǎng)至4 齡和成蟲(chóng)1 d 時(shí)分別進(jìn)行取樣，每200 頭為1 個(gè)樣品，有翅蚜與無(wú)翅蚜各100 頭，共收集10 個(gè)重復(fù)。

1.4 游離氨基酸提取與分析

在樣品中加入0.5 mL 2%（體積分?jǐn)?shù)）的磺基水楊酸，在4 ℃下研磨至勻漿狀，靜置提取0.5 h 以上，使用孔徑0.22 μm 的離心式濾膜在10 000 r·min－1下離心10 min，得到過(guò)濾后的上清液，將其上樣至Sykam S7130 氨基酸分析儀（德國(guó)，賽卡姆公司）。在茚三酮緩沖液作用下，按照表1 的氨基酸洗脫程序，將樣品中的游離氨基酸依次從分離柱上洗脫，最終將樣品游離氨基酸色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)比，得到樣品游離氨基酸含量數(shù)據(jù)。

表1 氨基酸分析儀緩沖液洗脫程序

1.5 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)育時(shí)期不同翅型的棉蚜游離氨基酸含量，其差異顯著性使用SPSS 23 中的非參數(shù)比較方法（Kruskal-Wallis 法）進(jìn)行檢驗(yàn)（0.05 水平），使用軟件Graphpad Prism 8.0.2 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的組成

通過(guò)測(cè)定棉蚜游離氨基酸種類及其含量，發(fā)現(xiàn)不同翅型棉蚜的游離氨基酸種類一致，均檢測(cè)到21 種游離氨基酸（表2）。其中，必需氨基酸10 種，包括：蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸；其余11 種（包括氨基酸衍生物）為非必需氨基酸，包括：磷酸絲氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、γ- 氨基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、脯氨酸。

表2 不同翅型棉蚜游離氨基酸種類及其含量

無(wú)翅蚜中，成蚜的游離氨基酸含量除天冬酰胺外均高于若蚜，其中纈氨酸、甲硫氨酸、磷酸絲氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、γ- 氨基丁酸、脯氨酸的含量在2 個(gè)發(fā)育時(shí)期差異顯著。有翅蚜中，成蚜的游離氨基酸含量除酪氨酸外均高于若蚜，其中天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸的含量在2 個(gè)發(fā)育時(shí)期差異顯著。

2.2 不同翅型棉蚜游離氨基酸含量的比較

由表2 數(shù)據(jù)可知，4 齡無(wú)翅若蚜和有翅若蚜的游離氨基酸含量分別為10.29 μg·g－1和10.31 μg·g－1，無(wú)顯著差異；而有翅成蚜的游離氨基酸含量（19.33 μg·g－1）顯著高于無(wú)翅成蚜（12.89 μg·g－1），是無(wú)翅成蚜的1.5 倍。成蚜和4 齡若蚜的必需氨基酸含量、4 齡若蚜的非必需氨基酸含量在2 種翅型間均無(wú)顯著差異，但有翅成蚜的非必需氨基酸含量比無(wú)翅成蚜上升0.65 倍，差異顯著。

在2 個(gè)生育時(shí)期，有翅蚜的亮氨酸和甘氨酸含量均顯著高于無(wú)翅蚜，而有翅蚜的精氨酸含量均顯著低于無(wú)翅蚜。除苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、鳥(niǎo)氨酸外，有翅成蚜的其余種類游離氨基酸的含量均高于無(wú)翅成蚜，其中前者纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、γ- 氨基丁酸和脯氨酸8種游離氨基酸含量顯著高于后者。2 個(gè)發(fā)育時(shí)期不同翅型棉蚜中含量最高的游離氨基酸種類均為天冬酰胺；含量較低的氨基酸是鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲氨酸，均為非必需氨基酸。

3 討論與結(jié)論

昆蟲(chóng)生命活動(dòng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開(kāi)游離氨基酸，只有游離氨基酸的含量維持在穩(wěn)定的水平，各種代謝才能穩(wěn)定進(jìn)行[10]。在昆蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中游離氨基酸的含量在不斷地變化，在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及其與寄主植物的互作等方面發(fā)揮作用。

前人研究表明，玉米鐵甲蟲(chóng)Dactylispa setifera在幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)3 個(gè)蟲(chóng)態(tài)中游離氨基酸種類相同，但各種游離氨基酸的含量發(fā)生較大改變[11]。本研究中，2 種翅型成蚜的游離氨基酸含量除天冬酰胺和酪氨酸外均高于若蚜，且纈氨酸、甲硫氨酸、磷酸絲氨酸、絲氨酸、γ- 氨基丁酸、脯氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸和天冬酰胺的含量在2 個(gè)發(fā)育時(shí)期的棉蚜體內(nèi)呈顯著差異，這可能與棉蚜的生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)。其中，除苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、鳥(niǎo)氨酸外，有翅成蚜的其余種類游離氨基酸的含量均高于無(wú)翅成蚜，這可能與有翅成蚜的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

在自然環(huán)境中，為了更好地適應(yīng)環(huán)境，蚜蟲(chóng)通過(guò)翅型的分化來(lái)提高適應(yīng)力[12-14]，不同翅型蚜蟲(chóng)游離氨基酸含量的不同可反映游離氨基酸在蚜蟲(chóng)翅型分化及其生理調(diào)節(jié)中所發(fā)揮的重要作用。研究表明：在特定的條件下，氨基酸可成為昆蟲(chóng)體內(nèi)的能量來(lái)源，昆蟲(chóng)血淋巴中的脯氨酸含量較高，有的甚至達(dá)到血淋巴總量的2%，成為昆蟲(chóng)中比糖元和海藻糖更為重要的能量來(lái)源[15]，且脯氨酸可以作為一種信號(hào)分子，能調(diào)節(jié)線粒體功能，影響細(xì)胞增殖或細(xì)胞死亡，提高細(xì)胞抗性[16]；甲硫氨酸等含硫氨基酸的3 種主要產(chǎn)物谷胱甘肽、同型半胱氨酸和?；撬嶂饕绊戵w外和體內(nèi)免疫反應(yīng)[17]。本研究中棉蚜的游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，相較于無(wú)翅成蚜，有翅成蚜體內(nèi)的脯氨酸與甲硫氨酸含量顯著上升，從而推測(cè)有翅成蚜脯氨酸與甲硫氨酸含量的增加與有翅蚜抗逆性增強(qiáng)聯(lián)系緊密。本研究還發(fā)現(xiàn)有翅棉蚜體內(nèi)的精氨酸含量與無(wú)翅棉蚜相比顯著降低；而精氨酸在生物體內(nèi)主要起調(diào)節(jié)免疫功能，還對(duì)生物體的生長(zhǎng)、繁殖和氮平衡起作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱Nilaparvata lugens體內(nèi)精氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量最高，游離氨基酸總量在3 齡若蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)中較高，可能與褐飛虱的卵巢發(fā)育有關(guān)[19]。據(jù)此推測(cè)，有翅棉蚜體內(nèi)精氨酸含量較無(wú)翅棉蚜低可能與其繁殖力低有關(guān)。

對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)蚜蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，了解其翅型分化的機(jī)理尤為重要，以便通過(guò)控制蚜蟲(chóng)的翅型分化來(lái)縮小蚜蟲(chóng)的傳播范圍。本研究對(duì)不同翅型棉蚜2 個(gè)發(fā)育階段游離氨基酸含量變化進(jìn)行了分析，但相關(guān)的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。