超聲輔助熱酸提取液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法測定香辛料中6種砷形態(tài)

曹璨，吳志剛

（遼寧省重要技術(shù)創(chuàng)新與研發(fā)基地建設(shè)工程中心，遼寧省分析科學(xué)研究院，沈陽 110015）

香辛料是指具有天然味道或氣味的植物特定部位[1]，如種子、果實(shí)、根、樹皮等制成的調(diào)味料，可單獨(dú)使用也可多種成分混合使用，用以改善食物的口感和味道，是人們烹飪和食品生產(chǎn)加工中不可或缺的材料。香辛料應(yīng)用廣泛，大多數(shù)作為藥食兩用的植物，具有一定藥理作用[2]；香辛料提取物還因具有抗氧化活性和抑菌防腐的作用[3]而應(yīng)用于食品保鮮。隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，土壤、水體、空氣等污染情況對作物影響明顯，特別是作物對有毒有害元素有富集作用，同時加工和提取環(huán)節(jié)也增加了有害元素污染的幾率，增加食品安全風(fēng)險，其中砷元素因毒性較強(qiáng)受到普遍關(guān)注。

砷攝入量或身體蓄積量過高會導(dǎo)致皮膚損傷、神經(jīng)損害、器官衰竭等，而砷元素在不同生物體中的存在形態(tài)各有不同，現(xiàn)已知不同砷形態(tài)中，毒性由大到小依次為亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿，其中亞砷酸鹽和砷酸鹽為無機(jī)砷，一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿以及各類砷糖、砷脂為有機(jī)砷，砷甜菜堿、砷糖和砷脂毒性很小[4]。因此僅以食品中總砷的含量作為評價指標(biāo)，不足以體現(xiàn)食品中砷的毒性，砷形態(tài)分析能夠更準(zhǔn)確地反映食品安全風(fēng)險?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(GB 2762—2022)[5]中谷物、水產(chǎn)、食用菌、調(diào)味品等均有部分品類以無機(jī)砷作限量要求，復(fù)合調(diào)味料中無機(jī)砷限量為0.1 mg/kg，香辛料作為復(fù)合調(diào)味料的主要原料，其總砷含量平均值遠(yuǎn)超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量。目前香辛料相關(guān)研究主要集中在總砷含量測定[2,6]，而無機(jī)砷含量研究報道則很少，僅有田雨等[7]研究了桂皮中4種砷形態(tài)。

砷形態(tài)提取和砷形態(tài)檢測是砷形態(tài)分析必不可少的兩個部分，樣品基質(zhì)不同，采用的提取方式差異很大?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》[8]主要針對大米、水產(chǎn)動物、嬰幼兒輔助食品等，香辛料中含有大量揮發(fā)油和色素等，食品分析方法提取易干擾測定。田雨[7]等采用水-甲醇(1∶1，體積比，下同)溶液提取，液相色譜-原子熒光光譜(LCAFS)法分析，該提取方法需要去除甲醇，較為繁瑣且周期長，LC-AFS 法需要將砷不同形態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氫化物才能夠被檢測器檢測，而砷甜菜堿和砷膽堿等大分子需要紫外在線消解才能檢測，且同時在線檢測6種砷形態(tài)尚有一定難度[9]。液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(LC-ICP-MS)聯(lián)用法對砷形態(tài)提取方式和提取劑的要求接受性廣泛，目前被普遍應(yīng)用[10?11]。

筆者采用超聲輔助熱酸提取、LC-ICP-MS法檢測，分析了香辛料中亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿和砷甜菜堿6種砷元素形態(tài)，為香辛料食品安全風(fēng)險評估提供方法參考。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent1260-Agilent7700x 型，配有MassHunter 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用工作站，美國安捷倫科技有限公司。

微波消解儀：Mars6 型，配有電熱趕酸器，美國CEM公司。

多功能數(shù)字超聲波水浴儀：DCS-250H型，輔光精密儀器(上海)有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：CT14RD型，上海天美生化儀器公司。

電子分析天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg和0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

純水儀：Milli-Q型，德國默克公司。

砷形態(tài)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(1)亞砷酸鹽，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08666，標(biāo)準(zhǔn)值為(75.7±1.2) μg/g；(2)砷酸鹽，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08667，標(biāo)準(zhǔn)值為(17.5±0.4) μg/g；(3)一甲基砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08668，標(biāo)準(zhǔn)值為(25.1±0.8) μg/g；(4)二甲基砷，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08669，標(biāo)準(zhǔn)值為(52.9±1.8) μg/g；(5)砷甜菜堿，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08670，標(biāo)準(zhǔn)值為(38.8±1.1) μg/g；(6)砷膽堿，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08671，標(biāo)準(zhǔn)值為(28.0±1.1) μg/g。中國計量科學(xué)研究院。

總砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW 08611，標(biāo)準(zhǔn)值為1 000 mg/L，中國計量科學(xué)研究院。

內(nèi)標(biāo)混合溶液：含Li、Sc、Ge、Lu、Rh、Tb、Bi，各元素質(zhì)量濃度均為100 mg/L，美國安捷倫科技有限公司。

混合調(diào)諧液：含Li、Co、Y、Ce、Tl，各元素質(zhì)量濃度均為1 μg/L，美國安捷倫科技有限公司。

磷酸二氫銨、氨水：均為分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

硝酸、30%過氧化氫：均為優(yōu)級純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

乙醇：色譜純，上海沃凱化學(xué)試劑公司。

液氬：沈陽氣體制造有限公司。

高純氦氣：純度大于99.999% (體積分?jǐn)?shù))，沈陽氣體制造有限公司。

實(shí)驗室用水均為一級水，由Milli-Q制備。

茴香、草果、胡椒、肉蔻、辣椒樣品：抽檢樣品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：PRP-X100 型陰離子柱(250 mm×4.1 mm，10 μm，瑞士哈美頓公司)；預(yù)處理柱：PRPX100 柱(25 mm×2.3 mm，瑞士哈美頓公司)；流動相：25 mmol/L NH4H2PO4-乙醇(99∶1)溶液(用氨水調(diào)至pH 為6.7)[11]，過0.45 μm 濾膜后超聲脫氣30 min，流量為1.0 mL/min，等度洗脫10 min；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.2 質(zhì)譜儀

載氣：氬氣，流量為1.08 L/min；補(bǔ)償氣：氬氣，流量為0.3 L/min；等離子氣：氬氣，流量為15 L/min；等離子氣：氬氣，流量為0.9 L/min；氦氣流量：4.1 mL/min (總砷)；采樣深度：8 mm；霧化室溫度：2 ℃；QP 偏轉(zhuǎn)電壓：-2.9 V；調(diào)諧模式：He 碰撞(總砷)，Nogas (砷形態(tài))；分析模式：常規(guī)(總砷)，高靈敏度(砷形態(tài))；積分時間：0.3 s (總砷)，0.5 s (砷形態(tài))；氧化物比率：1.02%；雙電荷比率：1.43%。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 溶液配制

總砷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確量取一定體積的總砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)硝酸溶液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0、1.0、5.0、20.0、60.0、100.0 μg/L的總砷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

6 種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確量取一定體積的6種砷形態(tài)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用1%硝酸溶液逐級稀釋，配制成6 種砷形態(tài)質(zhì)量濃度均為1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

6 種砷形態(tài)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確量取一定體積的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用1%硝酸溶液配制成質(zhì)量濃度為0、1.0、10.0、20.0、60.0、100.0μg/L的砷形態(tài)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

香辛料樣品用水沖洗干凈，再用去離子水反復(fù)清洗，置于潔凈室自然晾干后，用粉碎機(jī)粉成粉末，并過0.18 mm (80目)篩，待用。

測定總砷的樣品預(yù)處理方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)中總砷的測定方法[8]進(jìn)行優(yōu)化，準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g 于微波消解內(nèi)管中，加入硝酸5 mL，于80 ℃電熱趕酸器中預(yù)熱10 min，加入1 mL 30%過氧化氫溶液，微波消解程序見表1。自動冷卻至37 ℃以下，電熱趕酸器溫度設(shè)定為180 ℃，剩余溶液量約為1 mL，用超純水轉(zhuǎn)移并定容至100 mL。同時做試劑空白。

表1 微波消解程序

測定砷形態(tài)的樣品預(yù)處理方法，準(zhǔn)確稱取樣品1 g于50 mL離心管中，加入1%硝酸溶液20 mL，加蓋留少許縫隙，于80 ℃水浴中超聲提取10 min，提取完成后冷卻至室溫，離心15 min (4 ℃，9 000 r/min)，離心后用C18固相萃取柱和0.22 μm有機(jī)濾膜純化上清液。同時做試劑空白。

測定提取態(tài)總砷的樣品預(yù)處理方法，將測定砷形態(tài)的待測液和空白溶液分別移取10 mL，按測定總砷的預(yù)處理方法處理。

1.3.3 樣品測定

總砷和提取態(tài)總砷測定時，設(shè)定蠕動泵速度為0.1 r/s，通過三通進(jìn)樣閥在線加入內(nèi)標(biāo)溶液，分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液序列和樣品溶液序列。

砷形態(tài)測定時，將色譜柱通過peek管與霧化器連接，流出液不經(jīng)過三通直接導(dǎo)入霧化器。分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液序列和樣品溶液序列。設(shè)定蠕動泵速度為0.3 r/s，主要用于排除廢液。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用外標(biāo)法建立砷元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與離子計數(shù)間的定量關(guān)系，應(yīng)用WPS office 2019進(jìn)行實(shí)驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和計算，應(yīng)用OriginPro 2021進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理條件優(yōu)化

（1）提取液。測定砷形態(tài)常用的提取液有甲醇-水混合溶液[7]、稀酸溶液[12]、與流動相組成一致的提取液如磷酸鹽緩沖溶液或碳酸鹽緩沖溶液[13?14]等，以流動相作為提取液，配制過程中pH調(diào)節(jié)等步驟較多；用甲醇-水混合溶液提取后，因甲醇含量過高容易造成ICP-MS 儀器錐孔的積碳和焰炬不穩(wěn)，需要氮吹揮干[15]，所需時間較長，且容易引入二次污染，因此筆者選擇稀酸溶液提取。常用的稀酸如硝酸、鹽酸和乙酸等，鹽酸中大量的35Cl 容易與等離子氣中大量的40Ar 形成40Ar35Cl，對砷元素唯一的質(zhì)量數(shù)75As產(chǎn)生強(qiáng)烈的質(zhì)譜干擾，應(yīng)避免使用；乙酸氧化性較弱，更容易保持各形態(tài)的穩(wěn)定性；硝酸氧化性較強(qiáng)，需防止砷形態(tài)被氧化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不宜過高。因此分別以1%、2%、5%的乙酸溶液和0.5%、1%、2%的硝酸溶液作為提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察。

（2）提取溫度。乙酸揮發(fā)性較高，提取溫度不宜過高，以不超過60 ℃為宜，但溫度過低則降低提取速率。分別設(shè)定提取溫度為37、50、60 ℃；硝酸提取溫度過高，容易改變砷元素形態(tài)，分別設(shè)定提取溫度為70、80、90 ℃進(jìn)行考察。

（3）提取方式。稀酸溶液提取常用的提取方式如烘箱熱提取、水浴振蕩熱提取、超聲輔助提取和微波輔助提取等，其中微波提取提取率優(yōu)于水浴振蕩提取[11]，且提取周期明顯縮短。分別選擇烘箱熱提取、超聲輔助提取和微波輔助提取作為提取方式進(jìn)行考察。

以肉蔻樣品為代表，按乙酸和硝酸不同提取劑分別建立3 因素3 水平正交試驗L9(33)，按提取率(提取態(tài)總砷含量與總砷含量的比值)綜合考察，提取條件正交試驗結(jié)果見表2，統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表2 乙酸和硝酸提取條件正交試驗L9(33)結(jié)果

表3 乙酸和硝酸提取條件正交試驗L9(33)統(tǒng)計結(jié)果

由表3 結(jié)果可知，乙酸提取率最高的組合應(yīng)為A3B3C3，硝酸提取率最高的組合應(yīng)為a2b2c2和a2b2c3。分別按最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗，提取率分別為90.2%、98.9%和99.1%，且提取形態(tài)保持穩(wěn)定，但乙酸提取效率低于硝酸提取，因此確定提取條件為1%硝酸在80 ℃超聲提取和微波提取。

不同的提取方式提取速率不同，烘箱加熱提取時間明顯長于其它兩種提取方式，由于不同提取方法提取時間差異很大，無法作為同一因素的不同水平進(jìn)行正交試驗。以上試驗參考了文獻(xiàn)中的提取時間，即無機(jī)砷烘箱加熱提取2.5 h[8]、超聲提取40 min[16]和微波提取10 min[11]，得到最優(yōu)條件后再單獨(dú)考察提取時間。

（4）提取時間。兩種提取方式所選擇的提取時間和對應(yīng)的提取率見表4。

表4 提取時間條件選擇測定結(jié)果

結(jié)果表明，兩種提取方式都隨著提取時長的增加，提取率逐漸提高，至10 min后變化不顯著，兩種提取方式的提取率沒有顯著性差異(p＜0.05)。因微波消解管不能直接離心，需要轉(zhuǎn)移和重新配重，增加實(shí)驗步驟和二次污染概率，因此選擇80 ℃超聲提取10 min作為提取條件。

2.2 色譜條件選擇

參考文獻(xiàn)[11]選擇PRP X-100 色譜柱，同時配合預(yù)處理柱，使用25 mmol/L NH4H2PO4-乙醇(99∶1)溶液作為流動相等度洗脫。對流動相配制步驟進(jìn)行優(yōu)化，選擇先加入乙醇再調(diào)節(jié)混合溶液的pH 值為6.7，減少超聲次數(shù)，避免乙醇純品作為流動相B 與流動相A 在線混合存在的排氣慢、鹽析出以及誤操作導(dǎo)致高濃度有機(jī)相進(jìn)入色譜柱等風(fēng)險，同時加快洗脫速度，實(shí)現(xiàn)9 min 內(nèi)洗脫完全。40 μg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

分別以75As 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、離子計數(shù)為縱坐標(biāo)(y)建立線性回歸方程。以試劑空白的3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限。

6種砷形態(tài)質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表5。結(jié)果表明，6 種砷形態(tài)在1.0～100.0 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 9，檢出限均小于1.0 μg/kg。

表5 6種砷形態(tài)質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 方法精密度試驗

取肉蔻樣品，按照實(shí)驗方法平行測定6次，測定結(jié)果見表6。由表6可知，6種砷形態(tài)測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，表明方法精密度良好。

表6 精密度試驗結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗

向肉蔻樣品中加入1.0 mg/L的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液40 μL，按選定條件平行提取3 次，測定各砷形態(tài)含量并計算平均回收率，結(jié)果見表7。由表7數(shù)據(jù)可知，6 種砷形態(tài)加標(biāo)平均回收率為97.6%～104.7%，表明該提取方法穩(wěn)定，樣品中各砷形態(tài)保持較好，未發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化。

表7 加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=3)

2.6 實(shí)際樣品測定結(jié)果及提取率

用本方法分別測定茴香、草果、胡椒、肉蔻、辣椒5種香辛料中各砷形態(tài)、提取態(tài)總砷和總砷含量，分別計算提取率和砷形態(tài)檢測回收比率(各砷形態(tài)檢測到的含量之和與提取態(tài)總砷含量的比率)，結(jié)果見表8。肉蔻加標(biāo)樣品及對照空白的砷形態(tài)色譜圖見圖2。由分析結(jié)果可以看出，從方法提取率來看，不同品種香辛料提取率在96.7%～102.0%之間，提取效果良好。砷形態(tài)檢測回收比率在96.5%～103.9%之間，表明各砷形態(tài)均被檢出。各香辛料樣品中砷形態(tài)以無機(jī)砷為主，含量占總砷含量的80%以上，食品中污染物限量國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，調(diào)味料總砷不大于0.5 mg/kg，復(fù)合調(diào)味料無機(jī)砷不大于0.1 mg/kg，香辛料的限量要求雖然沒有明確規(guī)定，但以其在飲食中不可或缺的作用以及在復(fù)合調(diào)味料中所占的比重來看，存在一定安全風(fēng)險。

圖2 空白樣品和肉蔻加標(biāo)樣品中砷形態(tài)的色譜圖

表8 5種香辛料樣品中6種砷形態(tài)和總砷的測定結(jié)果、砷形態(tài)檢測回收比率、提取率及無機(jī)砷比率(n=3)

3 結(jié)語

建立了超聲輔助熱酸提取預(yù)處理，LC-ICP-MS法測定香辛料中6 種砷形態(tài)的分析方法，采用正交試驗確定砷形態(tài)提取的最佳條件。由方法學(xué)考證結(jié)果可知，該方法簡便、快速、環(huán)保，提取率高、穩(wěn)定性好，為香辛料中砷形態(tài)檢測提供了分析方法參考。