木薯糖轉運蛋白MeSWEET18的克隆與功能分析

薛晶晶　安飛飛　朱文麗　羅秀芹

關鍵詞：木薯；糖轉運蛋白；功能分析；糖轉運能力；非生物脅迫

中圖分類號：S533 文獻標識碼：A

蔗糖是大多數(shù)植物光合作用的主要碳水化合物，從葉片向各庫器官長距離運輸，促使根、花、果實和種子生長發(fā)育[1]。葉綠體通過光合作用合成蔗糖，蔗糖通過胞間連絲進入韌皮部薄壁細胞組織，由SWEET（sugar will eventually be exportedtransporter） 蛋白卸載至質(zhì)外體， 再通過SUT（sucrose transporter）蛋白轉運至伴胞細胞和篩管分子，然后由定位于篩分子細胞-伴胞復合體上的H⁺共轉運蛋白通過質(zhì)子動力勢將同化物送進韌皮部進入長距離運輸。

SWEET 蛋白屬于MtN3/saliva 基因家族，也稱為MtN3/saliva/SWEET，可以轉運己糖和蔗糖，并介導糖外流到質(zhì)外體，是糖轉運蛋白中的一員，含有2 個MtN3/saliva 跨膜螺旋結構域。已測序的植物基因組中均有發(fā)現(xiàn)SWEET 家族成員。綠色熒光蛋白融合研究發(fā)現(xiàn)，大部分植物SWEETs 家族基因位于細胞質(zhì)膜上[2-3]。根據(jù)SWEETs 蛋白轉運糖的類型不同，所有SWEETs 蛋白都可以分成4 個分支，第一分支和第二分支SWEET 蛋白主要選擇轉運己糖，尤其是葡萄糖；第三分支SWEET蛋白優(yōu)先跨膜轉運蔗糖；第四分支的SWEET 蛋白主要介導果糖的轉運[4]。同SUT 一樣，SWEET可以自身互作形成同聚物，也能相互之間形成異聚體，進而形成更大的通道提高轉運效率[5]。SWEETs 家族基因在植物運輸糖類、生殖和發(fā)育、植物逆境、與病原體互作等方面發(fā)揮著重要作用[6]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物[7]。木薯SWEET 家族共有28 個同源基因，COHN 等[8]發(fā)現(xiàn)地毯黃單胞菌的毒力可以通過轉錄激活因子TAL20Xam668 特異性誘導木薯MeSWEET10a 的表達，并最終導致木薯細菌性枯萎病的蔓延。胡梅珍[9]、薛蓓蓓等[10]對木薯SWEET 家族基因進行生物信息學分析，明確其對己糖的轉運能力以及不同木薯種質(zhì)的表達情況。劉秦等[11]克隆了木薯MeSWEET1 基因，并將其定位于細胞膜上，組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，成熟葉片中相對表達量最高。朱柏光等[12]分析木薯MeSWEET3b 的糖轉運能力，發(fā)現(xiàn)其轉運半乳糖，且受木薯黃單胞菌（Xam）的誘導。未發(fā)現(xiàn)木薯其他SWEET 蛋白的功能研究。木薯MeSWEET18 在不同組織器官中均具有較高的表達水平[13]，可能在木薯的生長發(fā)育及逆境脅迫中起著重要作用。因此，本研究以木薯MeSWEET18（Manes. 15G011300）為研究對象，通過克隆、體外驗證以及非生物脅迫等方法，研究該基因在木薯中的功能，為木薯SWEET 基因家族相關成員的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用生長于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃華南9 號（SC9）品種作為研究材料。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取與cDNA合成 總RNA提取參照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）的操作說明進行，用Dnase I 柱上消化RNA 樣品中殘留的微量DNA。用1 μgRNA 逆轉錄合成第一鏈cDNA。cDNA 第一鏈合成參照RevertAid RT 逆轉錄試劑盒（Thermo）的操作說明進行。

1.2.2 MeSWEET18 基因全長cDNA 擴增 以Phytozome12.0 中Manihot esculenta v7.1（cassava）數(shù)據(jù)庫的MeSWEET18 序列設計引物（5'-TTGAAGAAGTTGTTCATTTC-3'和5'-TCAACTCCCTGGCCCTTACT-3'），采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行cDNA 序列的克隆。全長cDNA 的擴增體系含PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL、MeSWEET18-F（10 μmol/L）2.5 μL、MeSWEET18-R（10 μmol/L）2.5 μL、cDNA 模板0.5 μL、無菌水補足至50 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴增產(chǎn)物，回收純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 載體（TransGen）上測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI 網(wǎng)站ORFFinder 軟件對獲得的SC9 cDNA 序列進行開放閱讀框（ORF）預測，同時翻譯成蛋白序列。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）軟件分析該蛋白的分子量與等電點；采用NCBI 在線軟件CDD 分析蛋白的保守結構域； 采用TMHMM Server v.2.0 （ http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）在線軟件進行跨膜結構域分析；運用PSORT 在線軟件對該蛋白進行亞細胞定位預測；運用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件預測該氨基酸序列的疏水性/親水性；利用SOPMA SECONDARYSTRUCTUREPREDICTIONMETHOD（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）在線軟件預測蛋白的二級結構。從NCBI 和Phytozome12.0 數(shù)據(jù)庫下載木薯和擬南芥SWEET 蛋白家族基因，利用MEGA6 軟件，選擇neighbour-joining（NJ）模型，并進行1000 次bootstrap 統(tǒng)計學檢驗，構建包括MeSWEET18 蛋白序列在內(nèi)的木薯和擬南芥SWEET蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 不同生育期的實時熒光定量PCR 分析分別取SC9 形成期（植后4 個月）、膨大期（植后7 個月）及成熟期（植后10 個月）葉片、葉柄、莖桿和塊根作為研究材料。每個材料每個生育期隨機選取3 株，混合保存于–80 ℃冰箱中，3 次重復。利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（Tiangen）提取RNA。然后取1 μg RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA，稀釋10 倍后作為實時熒光定量PCR 分析的模板。

采用Thermo 公司的CFX 實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進行。10 μL反應體系中，包含1 μL 模板、5 μL 2×SYBRPremix、10 μmol/L qPCR-MeSWEET18-F 和qPCRMeSWEET18-R 引物（5'-GGAGTTTGAGAGTCTTCCTTATGTG-3'和5'-GAGTTACATAGACGATTTCCACCAG-3'）各0.4 μL、無菌水補足至10 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，共40 個循環(huán)，循環(huán)完成后進行產(chǎn)物溶解曲線分析。以MeActin 作為內(nèi)參基因（5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'和5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'），以2-△△CT 算法進行基因的相對定量表達。采用Dunnetts 法對同一部位不同發(fā)育期的相對表達結果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 MeSWEET18 的糖轉運特性分析EBY.VW4000 酵母是一種己糖轉運功能缺陷型酵母突變體，此菌株無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶（ura）缺陷型選擇培養(yǎng)基SD-ura 平板上生長，可以在麥芽糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基SD-ura平板上恢復生長[14]。運用包含pDR196 表達載體序列的引物（ 5-ATATACCCCAGCCTCGATGGAAATCTTGAGTTTG-3 和5-CGATAAGCTTGATATCTTATTCCGATGA-TGGAGAT-3 ） 擴增MeSWEET18 的CDS 序列，采用DNA 無縫克隆技術將MeSWEET18 的CDS 序列與酵母表達載體pDR196 進行重組，獲得MeSWEET18-pDR196 表達載體，使用聚乙二醇/醋酸鋰高效酵母轉化法將重組后的MeSWEET18-pDR196 質(zhì)粒轉化到EBY.VW4000 酵母菌中。利用含有2%麥芽糖的SD-ura 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)至OD600 約1.0，然后連續(xù)稀釋至OD600 分別約0.1、0.01、0.001，分別涂布于含有2%麥芽糖、2%葡萄糖、2%果糖等不同糖源的缺陷型選擇培養(yǎng)基SD-ura 平板上，30 ℃，倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察生長情況。

1.2.6 MeSWEET18 在不同糖處理下的表達分析將生長20 d 左右的SC9 水培苗，于黑暗條件下進行不同糖源的暗處理。以未進行處理的SC9 水培苗作為對照，分別添加水、2%蔗糖、2%葡萄糖、2%果糖的溶液中分別培養(yǎng)2 d 和5 d，每個時間點不同處理隨機選取3 株，混合保存于–80 ℃冰箱中，3 次重復，進行實時熒光定量PCR 分析。

1.2.7 MeSWEET18 在SC9 非生物脅迫下的表達分析 將SC9 莖桿水培20 d 后，分別進行鹽脅迫（8 g/L NaCl）、干旱脅迫（100 mmol/L 甘露醇）、氧化脅迫（10% H2O2）處理，各處理時間分別為0（CK）、12、24、36 h。低溫處理采用15 ℃ 24h，后降至4 ℃ 24 h。分別取葉片、葉柄、莖桿和根4 個部位的樣品，保存于–80 ℃冰箱中，3次重復，進行實時熒光定量PCR 分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prifm 5.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析、作圖以及Dunnetts 檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 MeSWEET18 基因全長CDS克隆及蛋白質(zhì)結構特性分析

通過RT-PCR 擴增及測序，獲得MeSWEET18基因編碼框序列714 bp，編碼237 個氨基酸（圖1），蛋白分子質(zhì)量為25.94 kDa，理論等電點為6.57，不穩(wěn)定系數(shù)為37.50，屬于穩(wěn)定類蛋白。通過NCBI 在線軟件CDD 分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有2個保守結構域，在N 端含有植物SWEET 家族基因共有的保守結構域MtN3_slv，C 端含有PQ-loopsuper family 保守結構域。TMHMM Server v.2.0在線軟件預測顯示，該蛋白含有7 個跨膜結構域，是典型的膜蛋白；PSORT 分析顯示，MeSWEET18定位于液泡的可能性為85.71%；ProtScale 預測表明，MeSWEET18 蛋白屬于親水性蛋白；SOPMA分析顯示，MeSWEET18 蛋白二級結構由44.30%α-螺旋、20.68%延伸鏈、3.38% β-轉角和31.65%無規(guī)則卷曲組成。

2.2 MeSWEET18 的系統(tǒng)進化樹分析

已發(fā)表的擬南芥和葡萄樹SWEET 蛋白進化樹分析結果顯示，SWEET 蛋白可以劃分為4 個亞類[4， 15]。對木薯和擬南芥的SWEET 蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)木薯MeSWEET18 與擬南芥的AtSWEET16 和AtSWEET17 位于同一進化枝上，屬于CladeⅣ，該亞類共含有6 個木薯SWEET基因（圖2）。采用DNAMAN軟件對MeSWEET18、AtSWEET16 和AtSWEET17 氨基酸序列進行比對，結果顯示：MeSWEET18 和AtSWEET16 的同源性達到53.23%，MeSWEET18 和AtSWEET17的同源性達到56.05%，含有2 個明顯的PQ-loopsuperfamily 保守結構域。

2.3 不同生育期MeSWEET18 的表達分析

分析MeSWEET18 在SC9 形成期、膨大期及成熟期葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達情況。結果顯示：MeSWEET18 在葉片中的表達隨著木薯的生長表現(xiàn)為先上升后下降；在葉柄中的表達隨著木薯的生長持續(xù)上升，在成熟期達到最大；形成期和膨大期的莖桿表達無差異，成熟期呈上升趨勢；MeSWEET18 在塊根膨大期表達量最高，隨著木薯生長，表達量低于木薯形成期（圖3）。

2.4 MeSWEET18 的糖轉運特性分析

為了驗證MeSWEET18 的糖轉運特性，將其轉化至己糖轉運缺陷型酵母EBY.VW4000 中，該酵母無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶缺陷型SD-ura 選擇培養(yǎng)基上生長，但是可以在麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上恢復生長（圖4）。結果表明，MeSWEET18 可以轉運果糖，但不能轉運葡萄糖，脫氧-2-葡萄糖的添加對MeSWEET18 無影響。

2.5 MeSWEET18 在不同糖處理下的表達分析

以未進行黑暗處理的SC9 水培苗作為對照，黑暗下分別添加水、2%蔗糖、2%葡萄糖和2%果糖的溶液進行處理2 d 和5 d。黑暗條件下，MeSWEET18 在不同糖處理下的表達水平顯示，黑暗處理2 d 時，水、2%蔗糖、2%葡萄糖和2%果糖處理對MeSWEET18 的表達均有影響；隨著黑暗處理時間延長到5 d，MeSWEET18 的表達在不同糖處理下表達呈極顯著下降趨勢（圖5）。

2.6 MeSWEET18 在非生物脅迫下的表達分析

將SC9 進行水培培養(yǎng)20 d 后，進行鹽、干旱、氧化以及低溫脅迫，各脅迫處理時間為0、12、24、36 h。采集每個時間點的葉片、葉柄、莖桿和根進行表達分析（圖6）。結果發(fā)現(xiàn)，葉片在鹽脅迫12 h 時表達水平提高了2.07 倍，隨著時間延長至24 h，表達水平較0 h 急速下降至0.05 倍；與0 h 相比，莖桿和根的表達水平在24 h 出現(xiàn)下調(diào)，隨著處理時間延長至36 h，表達水平呈極顯著上調(diào)，分別是0 h 的3.69 倍和5.34 倍。干旱脅迫下，與0 h 相比，葉片和葉柄在處理36 h 時表達水平分別提高了9.89 倍和20.82 倍。氧化脅迫下，MeSWEET18 在SC9 的葉片、葉柄和莖桿的表達均呈顯著下調(diào)，但是根的表達水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，24 h 的表達水平是0 h 的18.01 倍。低溫（15 ℃）處理24 h，MeSWEET18 在葉片、葉柄、莖桿和根的表達呈顯著下降，隨著低溫（4 ℃）處理24 h，MeSWEET18 在莖桿和根中的表達較0 h 呈現(xiàn)上升趨勢。

3 討論

SWEET 轉運蛋白在植物中廣泛存在，參與多種生理過程，如韌皮部裝載、籽粒灌漿、花粉發(fā)育、葉片衰老以及響應生物和非生物脅迫等[16-17]。本研究從木薯SC9 中克隆獲得MeSWEET18 基因序列，完整開放閱讀框為714 bp，編碼237 個氨基酸。系統(tǒng)進化樹分析表明，MeSWEET18 位于CladeⅣ，與擬南芥AtSWEET16 和AtSWEET17屬于同一進化分支。AtSWEET17 在葉片的果糖分配上發(fā)揮著重要作用，ATSWEET17 沉默株系表現(xiàn)為果糖積累功能紊亂、植株發(fā)育不良以及影響種子產(chǎn)量等[18]。對MeSWEET18 的糖轉運能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)其主要轉運果糖，與AtSWEET17主要影響果糖積累的研究結果一致。

擬南芥中過表達AtSWEET16 會促進植株發(fā)芽、生長發(fā)育以及提高植株對凍害的耐受性[19]。石竹DsSWEET17 的表達受外源果糖、葡萄糖、鹽脅迫和滲透脅迫的影響，轉化擬南芥后，能夠促進根的生長[20]。萱草HfSWEET17 在低溫脅迫下表達上調(diào)，過表達煙草能夠提高其抗寒性[21]。茶樹CsSWEET17 的交替剪接受低溫脅迫的誘導，過表達植株顯著降低了低溫脅迫下電解質(zhì)滲出水平[22]。麻風樹JcSWEET16 基因能夠響應葉片的干旱和鹽脅迫，在擬南芥中過表達能夠改良其開花時間和耐鹽水平，但不影響其耐旱性[23]。對木薯SC9 水培苗進行鹽、干旱、氧化和低溫等非生物脅迫，結果發(fā)現(xiàn)MeSWEET18 在葉片、葉柄、莖桿和根等不同部位的表達變化差異顯著，表明MeSWEET18 能夠響應多種非生物脅迫。

外源施加20 mmol/L 蔗糖處理杭白菊，導致CmSWEET17 基因特異表達；過表達CmSWEET17可促進雙節(jié)莖處理的腋芽生長。因此，CmSWEET17 基因可能通過生長素轉運途徑參與了蔗糖誘導的腋芽生長過程[3]。對木薯SC9 的水培苗進行蔗糖、果糖和葡萄糖的黑暗處理，發(fā)現(xiàn)隨著黑暗處理時間的增加，MeSWEET18 的表達呈現(xiàn)顯著下調(diào)，說明MeSWEET18 不僅對果糖脅迫敏感，對其他糖的脅迫也能產(chǎn)生響應。楊官顯等[24]對蘋果MdSWEET17 的研究發(fā)現(xiàn)，其在根和葉片中大量表達。在果實發(fā)育期，MdSWEET17的表達水平與果糖含量呈顯著負相關[18， 24]。研究MeSWEET18 在木薯SC9 形成期、膨大期和成熟期的葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達，結果發(fā)現(xiàn)，其在成熟期的葉片、葉柄和莖桿大量表達，而在塊根中的表達隨著木薯的生長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

在后續(xù)研究中，將測定SC9 不同非生物脅迫下蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖的變化，分析MeSWEET18 啟動子序列中與非生物脅迫、糖信號等相關的順式作用元件。構建過表達載體通過農(nóng)桿菌介導法遺傳轉化木薯，對獲得的過表達株系進行不同的非生物脅迫，分析MeSWEET18 以及糖代謝相關基因的表達趨勢，為研究木薯糖代謝的分子通路提供依據(jù)。