芒柄花素對(duì)妊娠期糖尿病大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響

田亞靜，楊雪，汪靜，葛文杰，何玉玲

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期發(fā)生的一種代謝異常性疾病，可導(dǎo)致流產(chǎn)、巨大兒、早產(chǎn)等不良結(jié)局［1-2］。GDM 患者體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），引發(fā)的強(qiáng)烈氧化應(yīng)激是造成胎盤損傷與不良妊娠結(jié)局的主要原因，抗氧化藥物可緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)［3-4］。 核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用，激活Nrf2 可抑制高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［5］，還可上調(diào)抗氧化基因血紅素單加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）/磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO1）表達(dá)水平，有效減輕哮喘小鼠炎癥和氧化應(yīng)激損傷［6］。通過激活Nrf2/HO-1 可改善GDM 小鼠葡萄糖不耐受，抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激，最終改善生殖結(jié)局［7］。因此，筆者推測(cè)Nrf2/HO-1/NQO1是防治GDM的重要作用靶點(diǎn)。芒柄花素又稱刺芒柄花素，是一種異黃酮類化合物，為天然抗氧化劑。研究顯示，芒柄花素能用于多種心腦血管疾病的治療，還可激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，進(jìn)而降低糖尿病腎病大鼠血糖、血脂，抑制其腎組織氧化應(yīng)激損傷［8-9］。本研究以不同劑量芒柄花素處理GDM模型大鼠，旨在探討芒柄花素是否可通過激活Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路來減輕GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF 級(jí)SD 大鼠130 只，雌雄各半，7 周齡左右，體質(zhì)量200～260 g，購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0055。在屏障環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，4只/籠，飼養(yǎng)嚴(yán)格參照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。鏈脲佐菌素（純度≥98%）、Nrf2 抑制劑ML385（純度≥98%）、芒柄花素（純度≥99%）均購自北京索萊寶科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔源抗大鼠β-actin 一抗、兔源抗大鼠Nrf2 一抗、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、兔源抗大鼠HO-1 一抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)羊抗兔二抗、兔源抗大鼠NQO1一抗均購自英國(guó)Abcam 公司。全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)PM4）購自天津微納芯科技有限公司；透射電子顯微鏡（型號(hào)Talos L120C）購自北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)YT-MB96A）購自山東云唐智能科技有限公司；雙膠迷你垂直電泳槽（型號(hào)VE-180）、轉(zhuǎn)印電泳槽（型號(hào)VE-186）購自南京普陽科學(xué)儀器研究所等。

1.2 研究方法

1.2.1 GDM模型建立及分組

參照文獻(xiàn)［10］建立GDM 大鼠模型：選擇空腹血糖（fasting serum glucose，F(xiàn)SG）值正常的SD 大鼠，雌雄比為1∶1合籠過夜，次日檢查陰道栓得到孕鼠56只（記為孕0 d），隨機(jī)抽取47 只于其腹腔內(nèi)注射45 mg/kg 的鏈脲佐菌素，孕3 d 測(cè)量FSG，≥16.7 mmol/L 表示GDM 造模成功。共成功造模45只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、芒柄花素低劑量（50 mg/kg）組［11］、芒柄花素高劑量（100 mg/kg）組［11］、ML385（20 mg/kg）組［12］、芒柄花素高劑量+ML385組，每組9只；另取9只正常妊娠大鼠作為對(duì)照組。芒柄花素和ML385均以生理鹽水溶解至所需濃度，分別采取腹腔注射和灌胃給藥，對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，各組均于孕3 d給藥，1次/d，持續(xù)至孕19 d。

1.2.2 大鼠體質(zhì)量及糖脂代謝指標(biāo)測(cè)定

孕20 d時(shí)以乙醚麻醉大鼠（提前禁食禁水12 h），測(cè)量其體質(zhì)量后采集尾靜脈血，放入全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)FSG、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。

1.2.3 胚胎存活率、胎鼠體質(zhì)量及胎盤形態(tài)觀察

糖脂代謝測(cè)定結(jié)束后處死各組大鼠，取1.5 mL 尾靜脈血，于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min 取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩？v向切開腹腔及子宮，從子宮中取出胎鼠和胎盤，對(duì)胎鼠進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱質(zhì)量，得出其平均體質(zhì)量，計(jì)數(shù)存活胚胎數(shù)和總胚胎數(shù)（即總著床點(diǎn)數(shù)），計(jì)算胚胎存活率=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。肉眼觀察各組胎盤的顏色、外觀后剪取約0.8 g 胎盤組織保存在液氮備用，剩余胎盤組織浸入含0.05 mol/L蔗糖的鈣藻酸鹽緩沖液中固定，1 h后浸沒入2.5%戊二醛中于4 ℃下繼續(xù)固定24 h，使用透射電子顯微鏡觀察胎盤超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。

1.2.4 血清及胎盤組織MDA、GSH、SOD和TAC水平檢測(cè)

取1.2.3 中保存在液氮中的胎盤組織，加入高強(qiáng)度RIPA裂解液勻漿，4 ℃、3 000 r/min 離心20 min 取上清液，以BCA法測(cè)定蛋白總濃度后每組取300 μL。取1.2.3 中保存在-80 ℃中的血清于冰水浴中解凍后每組取300μL，按照試劑盒說明書分別檢測(cè)血清及胎盤組織中MDA、GSH、SOD 和TAC水平。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平

自1.2.4 中各組剩余的胎盤組織蛋白樣品液中取50 μg總蛋白上樣，跑電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h后，剪下檢測(cè)蛋白條帶分別孵育兔源抗大鼠β-actin、Nrf2、HO-1、NQO1一抗（稀釋比均為1∶2 000），4 ℃過夜后TBST振蕩洗膜3 次，室溫孵育HRP 偶聯(lián)羊抗兔二抗（1∶1 000），2 h 后TBST振蕩洗膜3次，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并采集蛋白條帶圖像，使用Image J軟件分析定量各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及糖脂代謝水平比較

與對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平均降低（P＜0.05），而ML385 組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC 水平升高（P＜0.05）。與芒柄花素低劑量組比較，芒柄花素高劑量組體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平降低（P＜0.05）。與ML385組比較，芒柄花素高劑量+ML385組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平降低（P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of body weight,blood glucose and blood lipid levels of rats between the six groups表1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血脂水平比較（n=9，±s）

Tab.1 Comparison of body weight,blood glucose and blood lipid levels of rats between the six groups表1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血脂水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與芒柄花素低劑量組比較，d與ML385組比較，P＜0.05；表2—5同。

組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F母體體質(zhì)量/g 306.85±6.20 356.34±7.14a 332.68±5.25b 310.02±4.39bc 372.69±7.81b 351.73±6.92d 154.591＊＊FSG/（mmol/L）3.54±0.38 17.42±3.13a 10.83±2.34b 4.02±0.54bc 26.79±3.48b 15.21±2.95d 115.158＊＊TG/（mmol/L）0.75±0.08 1.48±0.14a 1.13±0.10b 0.81±0.09bc 1.95±0.19b 1.43±0.12d 117.919＊＊TC/（mmol/L）2.70±0.24 5.15±0.56a 3.89±0.40b 2.78±0.29bc 6.26±0.48b 5.08±0.41d 108.771＊＊

2.2 各組胚胎存活率及胎鼠體質(zhì)量比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胚胎存活率降低，胎鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05）。與模型組比較，芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胚胎存活率均升高，胎鼠體質(zhì)量均降低（P＜0.05），而ML385 組大鼠胚胎存活率降低，胎鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05）。與芒柄花素低劑量組比較，芒柄花素高劑量組大鼠胚胎存活率升高，胎鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）。與ML385組比較，芒柄花素高劑量+ML385組大鼠胚胎存活率升高，胎鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Embryo survival rate and fetal weight of rats in each group表2 各組大鼠胚胎存活率及胎鼠體質(zhì)量（n=9，±s）

Tab.2 Embryo survival rate and fetal weight of rats in each group表2 各組大鼠胚胎存活率及胎鼠體質(zhì)量（n=9，±s）

組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F胚胎存活率/%98.87±1.12 73.12±4.80a 83.84±2.15b 95.03±1.96bc 64.01±2.07b 75.74±3.39d 200.071＊＊胎鼠體質(zhì)量/g 4.14±0.18 5.81±0.33a 5.04±0.23b 4.25±0.14bc 6.53±0.29b 5.74±0.21d 141.104＊＊

2.3 各組大鼠胎盤形態(tài)比較

對(duì)照組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)正常，無損傷表現(xiàn)。模型組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷：滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)空泡且微絨毛密度降低，與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接松散。與模型組比較，芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)均減輕，芒柄花素高劑量組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)相比芒柄花素低劑量組進(jìn)一步減輕；ML385 組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)加重。與ML385 組比較，芒柄花素高劑量+ML385組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)減輕。見圖1。

Fig.1 Ultrastructure of placental tissue of rats in each group observed by transmission electron microscope(×25 000)圖1 透射電鏡觀察各組大鼠胎盤組織超微結(jié)構(gòu)（×25 000）

2.4 各組血清及胎盤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平升高，GSH、SOD 和TAC 水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠血清及胎盤組織MDA水平均降低，GSH、SOD 和TAC 水平均升高（P＜0.05），而ML385組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平升高，GSH、SOD和TAC 水平降低（P＜0.05）。與芒柄花素低劑量組比較，芒柄花素高劑量組大鼠血清及胎盤組織MDA水平降低，GSH、SOD 和TAC 水平升高（P＜0.05）。與ML385 組比較，芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平降低，GSH、SOD 和TAC水平升高（P＜0.05）。見表3、4。

Tab.3 Serum levels of MDA,GSH,SOD and TAC in rats of each group表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平（n=9，±s）

Tab.3 Serum levels of MDA,GSH,SOD and TAC in rats of each group表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平（n=9，±s）

組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F MDA/（nmol/L）2.81±0.32 4.93±0.45a 3.87±0.38b 2.95±0.31bc 6.01±0.48b 4.82±0.43d 87.584＊＊GSH/（U/L）64.62±5.31 40.85±3.08a 49.97±3.53b 60.11±4.12bc 31.53±1.85b 42.04±2.98d 106.674＊＊SOD/（U/L）91.12±7.54 60.78±4.65a 73.89±5.31b 88.67±6.24bc 48.93±3.86b 63.51±4.38d 82.515＊＊TAC/（μmol/L）15.21±1.43 8.16±0.64a 11.08±0.91b 14.74±1.30bc 4.85±0.46b 8.74±0.65d 156.001＊＊

Tab.4 Levels of MDA,GSH,SOD and TAC in placental tissue of rats in each group表4 各組大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平（n=9，±s）

Tab.4 Levels of MDA,GSH,SOD and TAC in placental tissue of rats in each group表4 各組大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平（n=9，±s）

組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F MDA/（μmol/g）3.80±0.43 11.59±1.07a 7.87±0.92b 4.12±0.50bc 14.86±1.48b 10.93±0.95d 189.401＊＊GSH/（U/mg）35.13±4.02 8.26±1.15a 16.14±2.36b 34.09±3.72bc 1.57±0.22b 9.05±1.17d 281.457＊＊SOD/（U/mg）18.64±1.56 7.06±0.72a 11.89±1.03b 17.03±1.26bc 1.95±0.34b 7.86±0.81d 343.036＊＊TAC/（μmol/g）10.68±1.02 4.51±0.53a 7.08±0.71b 9.97±0.94bc 2.04±0.36b 4.93±0.48d 197.627＊＊

2.5 各組胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），而ML385組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與芒柄花素低劑量組比較，芒柄花素高劑量組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與ML385組比較，芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖2、表5。

Fig.2 Expression of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖2 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白表達(dá)

Tab.5 Relative expression level of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group表5 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平（n=9，±s）

Tab.5 Relative expression level of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group表5 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平（n=9，±s）

組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F Nrf2 0.96±0.11 0.35±0.04a 0.61±0.07b 0.90±0.09bc 0.10±0.02b 0.39±0.05d 205.157＊＊HO-1 1.02±0.14 0.39±0.06a 0.65±0.08b 0.97±0.13bc 0.15±0.04b 0.43±0.07d 120.488＊＊NQO1 1.13±0.19 0.41±0.08a 0.72±0.10b 1.08±0.15bc 0.20±0.05b 0.45±0.06d 95.741＊＊

3 討論

目前，口服降糖藥和胰島素注射是GDM主要治療方案，但長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)母嬰均可造成一定危害［13-14］。本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法誘導(dǎo)建立GDM模型，結(jié)果顯示造模大鼠體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量較對(duì)照組升高，抗氧化活力降低，致使大鼠胎盤萎縮且超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，胚胎存活率明顯降低，表明鏈脲佐菌素可導(dǎo)致孕鼠糖脂代謝紊亂，引發(fā)高強(qiáng)度氧化應(yīng)激，損害胎盤結(jié)構(gòu)及胎鼠正常發(fā)育，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。

GDM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中ROS過量產(chǎn)生及抗氧化能力下降是重要的發(fā)病機(jī)制之一，拮抗患者體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷是防治GDM 的有效手段［3-4，15-16］。芒柄花素是一種天然抗氧化劑，能通過提升機(jī)體抗氧化活力而對(duì)組織器官發(fā)揮保護(hù)作用［8］。它可通過減輕氧化應(yīng)激而改善膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠急性腎功能損傷［17］，還可緩解糖尿病小鼠氧化應(yīng)激損傷，改善其認(rèn)知功能［18］，因而預(yù)測(cè)芒柄花素可能用于防治GDM。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，芒柄花素低劑量和高劑量組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC水平升高，胚胎存活率升高，母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA 水平降低，表明芒柄花素可改善糖脂代謝，降低GDM大鼠血糖及血脂水平，提升其抗氧化活力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕大鼠胎盤結(jié)構(gòu)損傷，促使胎鼠存活，提示芒柄花素能減輕GDM 大鼠氧化應(yīng)激損傷，芒柄花素在GDM的防治中有很好的發(fā)展前景。

Nrf2/HO-1/NQO1是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)，可通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)來參與缺血性腦卒中、GDM 等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，激活該通路可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元ROS 和過氧化產(chǎn)物MDA 生成，提升抗氧化酶活性，通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19］?；謴?fù)GDM小鼠Nrf2/HO-1信號(hào)活性可減輕其體內(nèi)氧化應(yīng)激，改善GDM癥狀及不良妊娠結(jié)局［20］。張馨允等［9］研究表明，芒柄花素可激活Nrf2/HO-1 信號(hào)，減輕糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，ML385組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC水平下降，胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)及胚胎存活率降低，母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA 水平升高，表明抑制Nrf2表達(dá)可增強(qiáng)GDM大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重胎盤結(jié)構(gòu)損傷及不良妊娠結(jié)局。與ML385 組比較，芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC 水平升高，胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)及胚胎存活率升高，母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA水平降低，說明芒柄花素可逆轉(zhuǎn)ML385的作用，提示芒柄花素減輕GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷是通過激活Nrf2信號(hào)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，芒柄花素可改善GDM 大鼠糖脂代謝，降低其血糖血脂，增強(qiáng)抗氧化活性，抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激，減輕其胎盤損傷，提高胎鼠發(fā)育存活率，改善不良妊娠結(jié)局，激活Nrf2/HO-1/NQO1 信號(hào)通路可能是其藥理機(jī)制之一。本文證實(shí)了芒柄花素對(duì)GDM 的防治作用，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但其具體的藥理機(jī)制還不夠深入，Nrf2信號(hào)下游分子調(diào)控機(jī)制不清楚，還需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討。