靶向抑制NLRP3炎性小體在脊髓損傷中的研究進(jìn)展

朱晶惠，魏棟敏，任淑婷，楊彥玲，趙琳

脊髓損傷是脊柱損傷中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能障礙以及大小便等自主神經(jīng)功能障礙，傷后難以治愈，致殘率高。脊髓損傷后繼發(fā)性損傷會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。損傷后核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是一類免疫細(xì)胞激活后介導(dǎo)胱天蛋白酶1（caspase-1）活化的蛋白質(zhì)復(fù)合物［1］，NLRP3 炎性小體活化可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴形成，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重機(jī)體損害程度。靶向抑制脊髓損傷后NLRP3炎性小體激活，減輕脊髓損傷后機(jī)體的炎癥反應(yīng)、減少并發(fā)癥，是臨床治療脊髓損傷的有效方法。本文闡述了NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)和激活途徑，就脊髓損傷后靶向抑制NLRP3炎性小體激活的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

NLRP3 是一類胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由NOD 樣受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a card domain，ASC）銜接蛋白及pro-caspase-1 效應(yīng)蛋白3部分組成［2］。NLRP3炎性小體C端富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（leucine-rich repeats，LRR）；中間有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD），又稱NACHT 結(jié)構(gòu)域；N 端是吡啶域（pyrin domain，PYD）和半胱天冬蛋白酶募集域（caspase recruitment domain，CARD）。ASC 銜接蛋白同時(shí)具有1 個(gè)CARD 結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)PYD結(jié)構(gòu)域。pro-caspase-1效應(yīng)蛋白只含有1個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域。在機(jī)體損傷時(shí)，PRRs 能快速識(shí)別損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）和病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），受體蛋白可被激活，通過(guò)PYD 介導(dǎo)下游信號(hào)，利用ASC 和procaspase-1 的CARD 域相互作用，形成NLRP3 炎性小體復(fù)合物［3］。

2 NLRP3炎性小體的激活

NLRP3炎性小體的激活需要2條信號(hào)通路的參與。第1條是啟動(dòng)信號(hào)通路：細(xì)胞膜表面Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）能夠識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)分子DAMPs和PAMPs，進(jìn)而激活核因子（NF）-κB信號(hào)通路［4］，在炎性小體前體轉(zhuǎn)錄水平增加其表達(dá)量。第2條是激活信號(hào)通路：NLRP3炎性小體充當(dāng)感受器感受機(jī)體損傷釋放的DAMPs 和病原體釋放的PAMPs 的刺激，但是NLRP3 并非直接與所有激活劑相互作用，而是接受這些激活劑所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)［5］。其激活的信號(hào)通路途徑見(jiàn)圖1?，F(xiàn)階段研究證明，NLRP3 激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)主要包括活性氧（ROS）生成、線粒體功能障礙、離子流失穩(wěn)及溶酶體損傷破裂［6］。

Fig.1 Signaling pathways activated by NLRP3 inflammasome圖1 NLRP3炎性小體激活的信號(hào)通路

3 靶向抑制NLRP3炎性小體對(duì)脊髓損傷的作用

脊髓損傷后NLRP3炎性小體上調(diào)參與炎癥反應(yīng)，白細(xì)胞介素（IL）-18、IL-1β 等炎性因子表達(dá)量增加，并介導(dǎo)了細(xì)胞焦亡［7］。而這些促炎因子與焦亡后釋放的內(nèi)容物均可以作為促炎信號(hào)引發(fā)更大的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生有害物質(zhì)，不利于機(jī)體恢復(fù)。

季英楠等［8］進(jìn)行了大鼠脊髓損傷后NLRP3 炎性小體表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)功能影響的研究，用白細(xì)胞三烯受體抑制劑減少NLRP3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠在組織學(xué)和行為學(xué)上較對(duì)照組損傷明顯減輕。Li 等［9］也證實(shí)抑制NLRP3 活化可以減輕微環(huán)境炎癥反應(yīng)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型極化，改善小鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。因此靶向抑制NLRP3 的激活可以減輕脊髓損傷后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)機(jī)體損傷后感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

3.1 靶向NLRP3啟動(dòng)信號(hào)通路的調(diào)控

NF-κB是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,許多促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的啟動(dòng)子區(qū)域均有其結(jié)合位點(diǎn)，因而NF-κB信號(hào)通路是啟動(dòng)NLRP3 炎性小體活化最主要的通路。Zhao等［10］研究表明芍藥醇可通過(guò)抑制Toll 樣受體/髓樣分化因子88/核因子-κB（Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor-κB，TLR4/MyD88/NF-κB）信號(hào)通路減少大鼠脊髓損傷中NLRP3炎性小體的活化和細(xì)胞焦亡。Liu等［11］研究也證實(shí)山奈酚可以抑制絲裂原活化蛋白激酶/NFκB（mitogen activated protein kinases/NF-κB，MAPKs/NF-κB）信號(hào)通路，減輕大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。Guo等［12］研究提示腺苷酸蛋白活化激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是NF-κB和NLRP3炎性小體信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子，該因子的活化可抑制NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路的激活。紫雛菊苷［13］、雷公藤紅素［14］和長(zhǎng)托寧［15］等中藥提取物均可以通過(guò)對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的抑制，減少NLRP3 炎性小體的表達(dá)以及促炎因子前體的轉(zhuǎn)錄與成熟，進(jìn)而抑制NLRP3組裝和激活，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善。然而NF-κB信號(hào)通路激活具有免疫耐受現(xiàn)象，其信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子功能喪失或調(diào)控關(guān)鍵效應(yīng)的基因突變?cè)鰪?qiáng)均可加重脊髓損傷后的炎癥效應(yīng)。因此，研發(fā)針對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制劑至關(guān)重要。

3.2 靶向NLRP3激活信號(hào)通路的調(diào)控

3.2.1 ROS生成和線粒體功能障礙

ROS 主要來(lái)源于線粒體釋放的線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS），此外，損傷后大量腺苷三磷酸（ATP）的釋放也可以誘導(dǎo)ROS生成，從而激活NLRP3 炎性小體［16］?；A(chǔ)研究中雖已明確ROS 是激活NLRP3 炎性小體的因素之一，但其介導(dǎo)的激活機(jī)制并不明了。Qayyum 等［17］研究表明，mtROS 介導(dǎo)的NLRP3 炎性小體激活可能是由硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）和硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的結(jié)合作用下誘導(dǎo)的，在正常情況下TPX 與TXNIP 緊密結(jié)合，而損傷后ROS的高表達(dá)導(dǎo)致TRX與TXNIP解離，隨后解離的TXNIP與NLRP3 炎性小體結(jié)合并被激活。線粒體損傷釋放mtROS 的同時(shí)，也釋放線粒體DNA到細(xì)胞基質(zhì)中，氧化的線粒體DNA可與黑色素瘤缺乏因子2 相互作用并激活NLRP3 炎性小體［16］。

因此，抑制ROS 生成或維護(hù)線粒體穩(wěn)態(tài)減少其損傷，可減少NLRP3 炎性小體的激活。如N-乙酰-L-半胱氨酸以及白藜蘆醇［18］、阿魏酸鈉［19］、木犀草素［20］等具有抗氧化的藥物均可在脊髓損傷中抑制ROS 生成，減少NLRP3 炎性小體激活，從而減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Lin 等［21］采用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞制備了NLRP3 炎性小體的激活模型，再用亞甲藍(lán)抑制ROS后，NLRP3 炎性小體的表達(dá)量顯著降低，提示ROS 是NLRP3的上游信號(hào)通路。使用ROS 特異性抑制劑或可從源頭減輕NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而Mohamed等［22］研究發(fā)現(xiàn)，即便是在TXNIP缺陷的情況下，IL-1β的成熟與caspase-1的活化并未被完全抑制，這表明可能存在其他激活機(jī)制。

3.2.2 離子流失穩(wěn)

離子流失穩(wěn)包括K+外流、Ca2+動(dòng)員和Na+內(nèi)流，這些生物事件已被確定與NLRP3 炎性小體激活有關(guān)。P2X7 受體（P2X7 receptor，P2X7R）是嘌呤能離子型P2X 受體家族的成員之一，是非選擇性ATP門控陽(yáng)離子通道受體。機(jī)體損傷后細(xì)胞釋放ATP 與P2X7 相互作用，離子通道被打開(kāi)［23］。K+外流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+濃度降低，誘導(dǎo)NIMA 相關(guān)激酶7 與NLRP3的LRR 結(jié)構(gòu)域作用，觸發(fā)NLRP3 炎性小體組裝激活［24］。離子通道打開(kāi)后細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)三磷酸肌醇受體和斯里蘭卡肉桂堿受體通道將Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中［25］。另一方面，溶酶體破裂導(dǎo)致細(xì)胞器膜破裂，細(xì)胞器中的Ca2+釋放也是細(xì)胞質(zhì)中Ca2+增多的一個(gè)重要途徑［26］。細(xì)胞質(zhì)中高濃度的Ca2+促使ASC 寡聚和pro-caspase-1 組裝以激活NLRP3炎性小體，其激活機(jī)制可能是Ca2+通過(guò)瞬時(shí)感受器電位M2 通道滲透作為ROS 內(nèi)源性傳感器而激活NLRP3 炎性小體［25］。Na+內(nèi)流激活NLRP3炎性小體具有K+依賴性，其機(jī)制可能是單鈉尿酸鹽晶體刺激增加了Na+負(fù)荷和細(xì)胞腫脹，然后通過(guò)水內(nèi)流被動(dòng)平衡細(xì)胞，使K+降低到閾值以下，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活。

Kong 等［27］研究證實(shí)酮代謝物β-羥基丁酸（βhydroxybutyric acid，BHB）可以通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體改善大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，BHB是直接通過(guò)阻滯K+外流和ASC 寡聚來(lái)減少NLRP3 炎性小體的激活。尼莫地平是一種典型的Ca2+通道阻滯劑，具有擴(kuò)張脊髓血管的作用，可減少Ca2+內(nèi)流，減輕炎癥程度，減少細(xì)胞焦亡［28］。TWIK相關(guān)的K+通道1（TWIK-Related K+Channel 1，TREK-1）是雙孔鉀離子通道成員之一，該通道開(kāi)放可以介導(dǎo)細(xì)胞超極化，抑制Ca2+通道激活、減少Ca2+內(nèi)流。Fang 等［29］研究證實(shí)缺乏TREK-1 會(huì)使局部炎癥擴(kuò)大，而TREK-1激動(dòng)劑花生四烯酸和亞麻酸可以抑制炎癥反應(yīng)，改善脊髓損傷小鼠運(yùn)動(dòng)功能。木犀草素同樣也具有阻滯Ca2+內(nèi)流、抑制NLRP3小體激活的作用［30］。利魯唑是一種用于治療肌萎縮側(cè)索硬化癥的鈉離子阻滯劑。Wu 等［31］研究證實(shí)利魯唑可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型極化，減少炎癥反應(yīng)，抑制NLRP3 炎性小體的激活。離子流在NLRP3 的激活機(jī)制中具有重要作用，深入了解離子通量與NLRP3 炎性小體之間的分子聯(lián)系為研究脊髓損傷后靶向抑制NLRP3激活提供了新思路。

3.2.3 溶酶體破裂

Abuammar 等［26］研究發(fā)現(xiàn)一些晶體顆粒物，如膽固醇晶體、鈣晶體、二氧化硅晶體等可通過(guò)吞噬作用誘導(dǎo)溶酶體腫脹破裂，致使NLRP3炎性小體被激活。其機(jī)制可能是溶酶體破裂釋放的組織蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）可作為DAMPs被PRRs 識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)NLRP3炎性小體的組裝激活［32］。脊髓損傷后，胞質(zhì)磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipaseA2，cPLA2）被激活，導(dǎo)致溶酶體膜破裂釋放CTSB，參與NLRP3炎性小體的激活。Li 等［33］采用cPLA2 的抑制劑花生四烯酰三氟甲基酮抑制cPLA2 激活，減少溶酶體損傷破裂，恢復(fù)自噬通量，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減少大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞損傷。CA-074-Me 是一種有效的CTSB 抑制劑，可抑制caspase-1 活化，減少NLRP3 炎性小體的活化［34］。也有研究證明阿魏酸鈉可以調(diào)節(jié)溶酶體功能，減少NLRP3炎性小體激活，改善大鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能［19］。因此，減少CTSB的釋放進(jìn)而抑制NLRP3 炎性小體激活可成為治療脊髓損傷的重要靶點(diǎn)。

3.3 其他

OLT1177是一類活性β-磺酰腈化合物，可直接靶向抑制NLRP3 炎性小體NOD 上的ATP 酶結(jié)合位點(diǎn)，抑制NLRP3 炎性小體活化［35］。過(guò)表達(dá)miR-423-5p［36］和miR-451［37］可直接在轉(zhuǎn)錄水平抑制NLRP3 mRNA的表達(dá)水平，減輕大鼠脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。MCC950 是一種針對(duì)NLRP3 炎性小體成分蛋白的特異性抑制劑，在脊髓損傷模型中MCC950可以有效阻斷NLRP3誘導(dǎo)的ASC寡聚來(lái)抑制NLRP3炎性小體的激活，但它不能通過(guò)直接阻斷NLRP3 寡聚或NLRP3-ASC 相互作用來(lái)阻止炎癥小體的形成［38］。Jiang等［39］對(duì)脊髓損傷小鼠的研究表明，BAY 11-7082 和A438079 也可直接靶向抑制NLRP3炎性小體激活，改善炎癥，減輕脊髓損傷。

4 小結(jié)

隨著對(duì)NLRP3炎性小體激活機(jī)制研究的深入，在脊髓損傷中靶向抑制NLRP3 激活機(jī)制的研究也越來(lái)越多。一些基礎(chǔ)和臨床研究均證實(shí)NLRP3 在脊髓損傷后繼發(fā)性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中至關(guān)重要。因而，以抑制NLRP3炎性小體為靶點(diǎn)或許可成為治療脊髓損傷的新方法。雖然一些藥物可以抑制NLRP3 的激活，或可通過(guò)阻斷其信號(hào)通路減少轉(zhuǎn)錄表達(dá)，改善炎癥，促進(jìn)脊髓損傷后感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，但尚需更多的研究來(lái)驗(yàn)證。脊髓損傷中，NLRP3炎性小體的未知激活機(jī)制及信號(hào)通路之間的交聯(lián)反應(yīng)、NLRP3炎性小體及相關(guān)分子如何介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、如何實(shí)現(xiàn)臨床治療的轉(zhuǎn)化，依然需要更深入的探索。