UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵面制品中7種甜味劑

蔣葉靈 侯緒和 呂保櫻

摘 要：應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）實(shí)現(xiàn)發(fā)酵面制品的7種甜味劑（糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖）同時(shí)檢測(cè)。樣品經(jīng)機(jī)械震蕩、超聲萃取，亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅沉淀蛋白，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾預(yù)處理，以Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）和乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫；電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）下采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行分段采集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：7種甜味劑在0.01～0.50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999 1，檢出限為3.0×10-6～3.0×10-4 g/kg，定量限為1.0×10-5～1.0×10-3 g/kg，樣品平均加標(biāo)回收率為84.5%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～8.1%（n = 6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，在各種發(fā)酵面制品檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：甜味劑；發(fā)酵面制品；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）

中圖分類號(hào)：TS213.2 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.03.018

0 引言

發(fā)酵面制品是指以面粉為主要成分，經(jīng)由和面-發(fā)酵-熟制而成的一類食品，包括饅頭、包子、花卷、蒸糕等，是我國北方居民的主要糧食，占其主食的70%以上[1]，其中饅頭是60%以上消費(fèi)者的主食[2]。可見發(fā)酵面制品在人們的生活中占據(jù)著重要的地位。甜味劑能夠增加食品的甜度，增強(qiáng)食品的口感[3]。目前，我國使用的甜味劑主要有安賽蜜、三氯蔗糖、甜蜜素、糖精鈉、紐甜等化學(xué)合成甜味劑?；瘜W(xué)合成甜味劑的長期大量攝入可能會(huì)引起腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成改變，使用量過大可導(dǎo)致血糖高、葡萄糖不耐受等代謝系統(tǒng)疾病，甚至?xí)?dǎo)致脾氣暴躁、性格壓抑、記憶力衰退、阿爾茲海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)異常及致癌[4-7]。在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[8]中規(guī)定發(fā)酵面制品中均不得使用上述化學(xué)合成甜味劑，然而部分商家為了追求經(jīng)濟(jì)效益，存在濫用、違規(guī)使用等不規(guī)范行為。

常用的化學(xué)合成甜味劑檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[9-10]、離子色譜法[11]、高效液相色譜法[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[15-16]等。使用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)需要進(jìn)行衍生化處理后方能使用，操作繁瑣，在食品檢驗(yàn)中適用度不高[17-18]。離子色譜法檢測(cè)合成甜味劑時(shí)對(duì)樣品基質(zhì)要求純凈，而食品基質(zhì)復(fù)雜性高，離子色譜法適用度較差。高效液相色譜法是合成甜味劑檢測(cè)中最為常用的檢測(cè)方法[19]，同時(shí)高效液相色譜法也是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定》（GB 5009.263—2016）[20]和《食品中糖精鈉的測(cè)定》（GB/T 5009.28—2003）[21]規(guī)定使用的測(cè)定方法。但由于發(fā)酵面制品中存在泡打粉等影響因素，存在基質(zhì)干擾引起的假陽性現(xiàn)象[22]，并且在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中也未有將7種合成甜味劑在高效液相色譜法中同時(shí)檢測(cè)的方法。因此，開發(fā)發(fā)酵面制品中合成甜味劑同時(shí)檢測(cè)的新方法是目前亟待解決的問題。本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵面制品的7種甜味劑（糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖）的方法。該方法利用了超高效液相色譜柱效高的特點(diǎn)，分離度高，分析速度快，色譜峰更尖銳使得信噪比增大，從而提高分析靈敏度，解決了復(fù)雜基質(zhì)的多組分同時(shí)測(cè)定的問題。由于UPLC-MS/MS選擇性高、靈敏度好，因此在食品監(jiān)督檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景，并可提高監(jiān)管效率，為市場(chǎng)上此類食品的安全檢測(cè)提供參考，具有一定的社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

樣品：馬拉糕、饅頭、花卷、包子共50批，均購于本地超市和商店。

儀器：超高壓三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（型號(hào)：Agilent 1290-646，安捷倫科技有限公司）；電子天平（型號(hào)：XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Multi Reax渦旋振蕩器（德國海道夫集團(tuán)）；超聲波清洗器（型號(hào)：DTA-42，鼎泰（湖北）生化科技設(shè)備制造有限公司）；冷凍離心機(jī)（型號(hào)：ROTANTA 460R，德國Hettich有限公司）；SYNS00000密理博超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純），均為默克股份有限公司；甲酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純），均為Fisher Scientific；亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純），均為西隴科學(xué)股份有限公司；微孔濾膜，0.22 μm，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

對(duì)照品：糖精鈉（1 mg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：GBW（E）100008-19001）；安賽蜜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100%，Stanford Chemicals，批號(hào)：ASF-785053-AP171106-18）；甜蜜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.12%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號(hào)：G140210）；阿斯巴甜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.50%，Stanford Chemicals，批號(hào)：ASP-841481-AL171106-06）；阿力甜（1 000 μg/mL，TMstandard，批號(hào)：3452006）；紐甜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.14%，Stanford Chemicals，批號(hào)：NT-230025）；三氯蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.41%，Stanford Chemicals，批號(hào)：24714XA-14658-036）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子模式（ESI-）；離子源溫度：350 ℃；霧化氣流速：5 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；霧化器電壓：45 psi；毛細(xì)管電壓：-3 000 V；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.2.2 色譜條件

液相色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A-乙腈、B-純水，流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

1.2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取阿斯巴甜、紐甜、安賽蜜、三氯蔗糖、甜蜜素適量，分別用純水（紐甜用0.1%甲酸水）配制成1.078 6、1.037 0、1.228 0、1.089 4、0.893 1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；精密移取糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，配制成0.760 mg/mL的儲(chǔ)備液；阿力甜儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL）；于4 ℃冰箱中保存。

1.2.4 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

精密吸取1.2.3對(duì)照品儲(chǔ)備液中安賽蜜0.4 mL、糖精鈉2 mL、甜蜜素0.2 mL、阿斯巴甜4 mL、三氯蔗糖4 mL、紐甜0.2 mL，阿力甜對(duì)照品原液0.04 mL定容至20 mL容量瓶中備用。

1.2.5 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

精密移取上述1.2.4混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，加入空白基質(zhì)定容至刻度，搖勻。制得混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，含阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，紐甜：0.518 5 mg/L，安賽蜜：1.228 0 mg/L，三氯蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精鈉：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L。

1.2.6 樣品處理

發(fā)酵面制品實(shí)際樣品處理測(cè)試：分別稱取4份陰性樣品各5 g，各精密加入1.2.4中混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.25 mL，分別加入純水、20%甲醇-水、50%甲醇-水、70%甲醇-水25 mL，分別加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L乙酸鋅溶液2.5 mL，渦旋10 min后定容至50 mL，超聲15 min，經(jīng)7 000 r/min 離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜后，待測(cè)。陰性樣品處理：取2份陰性樣品同法處理，得空白基質(zhì)。

1.2.7 加標(biāo)回收檢測(cè)

稱取5 g不同種類發(fā)酵面制品陰性樣品（代表不同基質(zhì)基底），分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，紐甜：0.518 5 mg/L，安賽蜜：1.228 0 mg/L，三氯蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精鈉：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L）0.125 mL（低濃度水平）、0.250 mL（中濃度水平）、1.000 mL（高濃度水平），按1.2.6方法進(jìn)行前處理，按上述優(yōu)化好的色譜條件操作，對(duì)低、中、高3個(gè)濃度梯度水平的樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別使用5 mg/L各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液依次采用直接進(jìn)樣的方式逐一進(jìn)行測(cè)試，在ESI正離子和ESI負(fù)離子模式下分別進(jìn)行MS2掃描，選擇了響應(yīng)力較強(qiáng)的激基締合體的母離子，而糖精鈉和安賽蜜在ESI正離子狀態(tài)下無法尋找適當(dāng)?shù)哪鸽x子，所以首先使用ESI負(fù)離子方法進(jìn)行測(cè)量。Product Ion 模式中選擇各組分的最佳子離子和碎裂電壓，在MRM模式中選定各組分子離子的碰撞能量。7種甜味劑的質(zhì)譜MRM參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本研究分別考察了Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）、Agilent Poroshell 120 SB-C8（2.1 mm×100.0 mm，2.7 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×50.0 mm，1.8 μm）3種色譜柱，其高效液相色譜圖見圖1。通過圖1可知，3種色譜柱中，Agilent Poroshell 120 SB-C8峰形有拖尾現(xiàn)象，保留時(shí)間為4.6 min，紐甜的峰不尖銳；Agilent SB-C18保留時(shí)間為3.4 min，峰有重疊，分離效果差；Agilent Eclipse Plus C18（簡稱C18）柱峰寬較窄，峰形尖銳，柱效高，分離效果最好。因?yàn)镃18為全硅膠基鍵合18個(gè)碳的烷烴色譜柱，Agilent Poroshell 120 SB-C8為全硅膠基鍵合8個(gè)碳的烷烴色譜柱，而Agilent SB-C18具有較大的二異丁基（SB-C18） 側(cè)鏈基團(tuán)，更適用于低pH值的體系。C18柱適合分離弱極性、中極性相對(duì)較弱的化合物，7種合成甜味劑均為極性相對(duì)偏弱的化合物，而發(fā)酵面制品基本上為弱堿性體系，因此，C18更為適用，本研究選擇其作為本體系用色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

本研究分別對(duì)有機(jī)相和水相的選擇進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)選取甲醇和乙腈作為有機(jī)相，對(duì)兩者作為有機(jī)相的分離效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其基線更低，峰形狹窄而尖銳，出峰時(shí)間較早，可以得到一個(gè)較好的分離效果。主要原因是乙腈在高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）上的吸收小，因此基線較平穩(wěn)。并且乙腈與水相混合壓力較甲醇與水相混合壓力更低，同樣流速下柱壓較低，出峰時(shí)間可以更早。對(duì)于甜味劑的合成，乙腈的洗脫能力較甲醇更強(qiáng)，可以有更好的分離效果。因此，在該體系中選擇乙腈作為有機(jī)相流動(dòng)相較好。以超純水、摩爾濃度分別為10、30、50 mmol/L乙酸銨的4種水溶液作為水相，乙腈為有機(jī)相時(shí)，實(shí)驗(yàn)比較了7種甜味劑標(biāo)樣的定量離子對(duì)響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)弱狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：水相中乙酸銨濃度越高，化合物的響應(yīng)就越低，以純水為水相時(shí)響應(yīng)最高。乙酸銨加入流動(dòng)相主要是起到調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值的作用，本體系測(cè)試中對(duì)pH值影響不大，乙酸銨的加入反而降低了化合物的響應(yīng)，因此，本體系選擇純水作為水相流動(dòng)。綜上所述，本研究采用乙腈-純水作為流動(dòng)相。7種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子對(duì)色譜圖見圖2。由圖2可見，三氯蔗糖和阿斯巴甜的出峰時(shí)間有重疊，但可以通過選擇不同的子離子來進(jìn)行定性和定量分析，互不干擾。

2.3 樣品前處理的選擇

由分析各處理液所得數(shù)據(jù)可知：當(dāng)用甲醇濃度過高的甲醇-水溶液處理甜蜜素和安賽蜜時(shí)，未檢測(cè)到相應(yīng)物質(zhì)。甲醇濃度過高時(shí)，會(huì)造成甜蜜素和安賽蜜溶解度降低導(dǎo)致目標(biāo)檢測(cè)物的損失，降低體系檢測(cè)靈敏度。純水和20%甲醇-水溶液的各組分均能檢出，其中純水的各組分響應(yīng)值大于20%甲醇-水的響應(yīng)值。因此，本研究體系采用純水作為前處理溶液。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將1.2.5的標(biāo)準(zhǔn)使用液用空白基質(zhì)處理的稀釋液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列，再按上述條件進(jìn)行測(cè)試。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各組分線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。結(jié)果表明，7種甜味劑在其對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2值均在0.999 0以上，檢出限以S/N=3、定量限S/N=10進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果滿足要求。

2.4.2 回收率和精密度

表4為不同面制品中7種甜味劑的加標(biāo)回收率和精密度計(jì)算結(jié)果。表4中，添加量為標(biāo)樣計(jì)算數(shù)值，測(cè)得量為根據(jù)本體系優(yōu)化后檢測(cè)方法的測(cè)試結(jié)果，回收率=（測(cè)得量/添加量）×100%。由表4可知，各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的平均加標(biāo)回收率為84.5%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%～8.1%。由此可見，本研究方法加標(biāo)回收測(cè)試有良好的加標(biāo)回收率，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照本研究所建立的方法對(duì)采購的50批樣品（馬拉糕5批、花卷10批、饅頭20批、包子15批）依次進(jìn)行檢測(cè)。其中糖精鈉檢出6批次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.218～180.015 mg/kg；安賽蜜檢出3批次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.749～8.439 mg/kg；阿斯巴甜檢出3批次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.734～1.044 mg/kg；其余組分均未檢出。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[8]規(guī)定，本研究中檢測(cè)的7種甜味劑均不得檢出，表明在市場(chǎng)中流通的發(fā)酵面制品存在非法添加甜味劑的現(xiàn)象，需要加大對(duì)此類產(chǎn)品的監(jiān)管力度。

3 結(jié)論

本研究建立了一種利用UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵面制品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的方法，并對(duì)儀器條件和前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，前處理方法簡便，分析體系測(cè)試分析時(shí)間在6 min以內(nèi)，體現(xiàn)該方法的快捷高效。研究結(jié)果顯示：該方法的線性關(guān)系良好，所有相關(guān)系數(shù)r2值均大于0.999 0，檢出限為3.0×10-6～3.0×10-4 g/kg，定量限為1.0×10-5～1.0×10-3 g/kg。本研究針對(duì)發(fā)酵面制品體系不同基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)，平均回收率為84.5%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～8.1%。該方法在復(fù)雜基質(zhì)基底中有著良好的加標(biāo)回收率，未出現(xiàn)明顯干擾，將其用于快速檢測(cè)發(fā)酵面制品中的7種甜味劑，可大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為安全監(jiān)管發(fā)酵面制品中的甜味劑的檢測(cè)提供了技術(shù)支持，具有很好的社會(huì)效益。

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Simultaneous determination of 7 sweeteners in fermented flour

product by UPLC-MS/MS

JIANG Yeling1， HOU Xuhe*2， LYU Baoying2

（1.Guilin Food and Drug Quality Inspection Institute， Guilin 541200， China; 2. Medical School，Guangxi

University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract：This study adopted ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）to detect 7 sweeteners（sodium saccharin， aspartame， acesulfame-K， neotame， alitame， saccharin sodium and chlorinated sucrose）in fermented dough products simultaneously. The samples were pre-treated by mechanical shaking， ultrasonic extraction， precipitation of proteins with ferricyanide potassium and zinc acetate， and filtration through a 0.22 μm membrane. The Agilent Eclipse Plus C18 column（2.1 mm ×50.0 mm， 1.8 μm）was washed with a gradient of acetonitrile-water. Multiple reaction monitoring（MRM）mode was used for segmented collection under negative electrospray ionization（ESI-）. The results showed that the seven sweeteners had good linear relationships within the concentration range of 0.01 to 0.50 μg/mL， with correlation coefficients r2 greater than 0.999 1. The detection limit was 3.0 × 10-6 to 3.0 × 10-4 g/kg and the quantitation limit was 1.0 × 10-5 to 1.0 × 10-3 g/kg. The average recoveries of the samples were 84.5% to 96.5% with relative standard deviations of 1.3% to 8.1%（n=6）. The experiment results show that this method is fast， accurate， reproducible， and can be widely applied to the detection of various fermented flour products.

Key words： sweeteners; fermented flour products; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

（責(zé)任編輯：于艷霞 羅小芬）