高效液相色譜法同時測定追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷含量*

江 濤，陳麗斯，彭紅英，唐冬蘭，曾 晨，蘇銳輝，湯迎湛，曾利杰

（廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510130）

追風透骨丸由制川烏、香附（制）、川芎、制草烏、麻黃、秦艽、赤芍、天麻、防風等23 味中藥材組方，具有祛風除濕、通經(jīng)活絡、散寒止痛功效，用于治療風寒濕痹、肢節(jié)疼痛、肢體麻木。質(zhì)量標準收載于2020 年版《中國藥典（一部）》［1］，但含量測定項僅測定芍藥苷的含量。對于含23味中藥材的成方制劑，該質(zhì)量標準較簡單，檢測指標較局限，無法全面控制產(chǎn)品質(zhì)量。秦艽為方中臣藥，始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效［3-6］，主要活性成分龍膽苦苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用［7-12］。中藥方劑由多味中藥組成，共同發(fā)揮治療作用［13］，強調(diào)從整體上發(fā)揮作用，僅靠單一成分的檢測不能反映藥品實際質(zhì)量。多指標成分質(zhì)量控制模式已廣泛應用于中藥及中藥制劑，尤其是中成藥復方制劑［14］。為保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定、均一、可控，本研究中建立了同時測定追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷2種活性成分含量的高效液相色譜法，以完善其質(zhì)量控制標準?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有G1311C 型四元梯度泵、G1322A 型在線真空脫氣機、G1329B 型自動進樣器、G1316A 型柱溫箱、G1315D 型二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent Technologies 色譜工作站；KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為480 W，頻率為40 kHz）；XA105 型電子分析天平（精度為十萬分之一），ME204T型電子分析天平（精度為萬分之一），均購自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號為110770-201716，含量為97.6%），芍藥苷對照品（批號為110736-201539，含量為96.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；追風透骨丸（廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，批號分別為A11063，A11064，A11065，A11066，A11067，A11068，A11069，A11070，A11071，A12072，A12073，A12074）；甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇- 0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，龍膽苦苷峰和芍藥苷峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液制備

分別取龍膽苦苷對照品、芍藥苷對照品各適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL 含龍膽苦苷和芍藥苷各40 μg 的混合溶液，即得混合對照品溶液。取樣品適量，研成細粉，過65 目篩，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為480 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方和生產(chǎn)工藝分別制備缺秦艽、缺赤芍、缺秦艽和赤芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1. 龍膽苦苷 2. 芍藥苷A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C-E. 陰性對照品溶液（分別缺秦艽、赤芍、秦艽和赤芍）圖1 高效液相色譜圖1.Gentiopicroside 2.PaeoniflorinA.Mixed reference solution B.Test solution C - E.Negative reference solution（lacking Gentianae Macrophyllae Radix alone，Paeoniae Radix Rubra alone，both Gentianae Macrophyllae Radix and Paeoniae Radix Rubra，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取龍膽苦苷對照品和芍藥苷對照品各20 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，作為對照品貯備液，分別精密吸取上述對照品貯備液1，2，3，5，7，10 mL，置25 mL容量瓶中，加60%甲醇定容，搖勻，配制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y龍= 16.837X龍- 1.848 8（r=0.999 9，n=6），Y芍=26.624X芍+10.640（r=0.999 9，n= 6）。結(jié)果表明，龍膽苦苷、芍藥苷質(zhì)量濃度分別在15.718～157.175 μg/ mL 和16.095～160.949 μg/ mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果龍膽苦苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.35%和0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為A11071）粉末1.0 g，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果龍膽苦苷、芍藥苷含量的RSD分別為0.48%和0.37%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復性試驗下供試品溶液適量，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果龍膽苦苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.51%和0.83%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量（含龍膽苦苷0.867 mg/g、芍藥苷1.225 mg/g）的樣品（批號為A11071）粉末0.4，0.5，0.6 g，各3份，精密稱定，分別精密加入2種對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取12 批樣品粉末各2 份，每份1.0 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品中龍膽苦苷和芍藥苷的含量。結(jié)果樣品中龍膽苦苷和芍藥苷的平均含量分別為0.856，1.174 mg/ g，RSD分別為5.24%，1.91%。詳見表2。

表2 追風透骨丸中龍膽苦苷和芍藥苷含量測定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gentiopicroside and paeoniflorin in Zhuifeng Tougu Pills（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

預試驗中，供試品溶液的制備考察了超聲提取和加熱回流提取2種方式，并在此基礎上采用三因素三水平的正交試驗考察甲醇體積分數(shù)（40%，60%，90%），提取時間（15，30，45 min），溶劑體積（25，50，75 mL）對供試品溶液提取效果的影響。結(jié)果表明，加熱回流提取與超聲提取對含量測定結(jié)果影響不大，故選擇操作方便的超聲提取。正交試驗結(jié)果顯示，對提取得率的影響因素從大到小為甲醇體積分數(shù)＞溶劑體積＞提取時間，最佳提取條件以60%甲醇25 mL、超聲提取30 min為宜。由最佳提取條件制備的供試品溶液的主峰峰面積較大，峰形較好，故最終確定2.2項下供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件選擇

考察了甲醇與不同體積分數(shù)醋酸（0.1%，0.3%，0.5%）和不同體積分數(shù)磷酸（0.1%，0.3%，0.5%）組成的流動相，不同柱溫（26，30，35 ℃），不同檢測波長（230，254 nm），不同品牌色譜柱［Thermo Scientific ODS - 2 HYPERSIL C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Phenomenex synergi C18柱（250 mm×4.6mm，4 μm），Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］等對供試品溶液色譜峰分離效果的影響。結(jié)果表明，以2.1 項下色譜條件進樣測定時，龍膽苦苷和芍藥苷色譜峰峰形均良好，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

3.3 結(jié)果分析

本研究中測定了12 批樣品中龍膽苦苷、芍藥苷2 種成分的含量，結(jié)果表明，各批樣品中龍膽苦苷含量差異相對較大（RSD= 5.24%），芍藥苷含量差異較?。≧SD=1.91%），究其原因可能為不同批次秦艽的質(zhì)量差異導致。中藥材質(zhì)量的影響因素較多，自然環(huán)境因素與人工干預因素如土壤、光照、環(huán)境溫度、降水量、農(nóng)藝措施、采收時間、藥材初加工、儲運方式、藥材摻假等對中藥材品質(zhì)的影響最大［15］。故制訂追風透骨丸中2 種指標成分的合理限度時仍需參考更多批次樣品的含量測定數(shù)據(jù)及藥品的穩(wěn)定性試驗考察數(shù)據(jù)。

3.4 方法評價

所建立的方法操作簡便、結(jié)果準確、重復性及專屬性均良好，能更全面地控制追風透骨丸的質(zhì)量。