烏骨藤對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-33/ST2信號(hào)通路的影響*

祝波, 馬武開(kāi), 陳菲菲, 楊玉濤, 安陽(yáng), 高雪琴, 劉振昆, 黃穎**

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550002; 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,貴州 貴陽(yáng) 550001; 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 體檢治未病中心, 貴州 貴陽(yáng) 550001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性、全身性自身免疫性疾病[1],疾病后期可導(dǎo)致軟骨和骨破壞,影響關(guān)節(jié)功能,造成關(guān)節(jié)畸形,嚴(yán)重影響個(gè)人生活質(zhì)量,導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。RA在我國(guó)的發(fā)病率0.42%,女性高于男性[3]。研究表明,RA與遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥反應(yīng)及自身免疫等因素有關(guān),認(rèn)為與輔助T細(xì)胞(Th1、Th2及Th17)及其相關(guān)細(xì)胞因子的異常激活有關(guān)[4]。Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng),并激活巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和γ干擾素(interferon-γ,INF-γ);Th2細(xì)胞激活B細(xì)胞,并產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10;Th17細(xì)胞受轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt(RORt)調(diào)節(jié),主要產(chǎn)生IL-17、IL-22和INF-γ[5]。IL-33是一種前炎性細(xì)胞因子,可通過(guò)生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)軸募集一系列的炎性因子,促進(jìn)機(jī)體炎癥的發(fā)展[6]。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí),IL-33與其受體ST2結(jié)合后通過(guò)相應(yīng)免疫通路參與炎癥、自身免疫心血管疾病的生和發(fā)展[7-8]。目前,西醫(yī)治療RA主要采用糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥及改善病情抗風(fēng)濕藥等藥物[9-10],中醫(yī)藥治療RA有其特色、臨床效果顯著、不良反應(yīng)少及安全性高[11]。烏骨藤具有抗炎、抗腫瘤及抗纖維化等藥理作用[12],常用于治療風(fēng)濕痹痛,但作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠,探討烏骨藤對(duì)CIA大鼠IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)6周齡健康雌性Wistar大鼠,體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(湘)2019-0013。所有大鼠在相同條件下喂養(yǎng),自由飲食、飲水,室溫18～22 ℃。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 烏骨藤片(四川國(guó)康藥業(yè)有限公司,批號(hào)20200914165023)、氟米特片(蘇州長(zhǎng)征一欣凱制藥有限公司,批號(hào)201202)、牛Ⅱ型膠原(美國(guó)Chondrex公司,批號(hào)20021),完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)F-5881)、醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)10000218),IL-4 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)E-EL-R0014c)、IL-17 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)E-EL-R0566c)、INF-γ ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)E-EL-R0009c)、L-33 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號(hào)CSB-E14077r);小鼠單抗β-actin 42 kD(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào)BM0627)、兔多抗sst 241 kD(批號(hào)Df7206)、兔多抗st2 l63 kD(批號(hào)Df2533)、兔多抗IL-33 31 kD(批號(hào)Df8319)均為美國(guó)Affinity公司產(chǎn)品。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 離心機(jī)(湘儀H1650-W)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONEICV-450)、FlexStation3多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices,Flex Station3)、電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司CPA)、水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司TS-1)。

1.2 研究方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 60只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、來(lái)氟米特組及烏骨藤低、中、高劑量組,每組10只。

1.2.2動(dòng)物造模及關(guān)節(jié)炎評(píng)分 除空白組外,其余各組參照文獻(xiàn)[13]方法建立CIA大鼠動(dòng)物模型。用0.1 mol/L冰釋酸5 mL稀釋10 mg牛Ⅱ型膠原溶解過(guò)夜,然后加入等體積的完全氟氏佐劑中,于大鼠尾根皮下多點(diǎn)注射0.3 mL,第7天后以同樣方法再注射1次。第7天開(kāi)始對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行炎癥評(píng)分,評(píng)分之和用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)表示,AI≥4分為關(guān)節(jié)炎癥誘導(dǎo)成功,AI<4分判定為沒(méi)有關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生[14]。

1.2.3給藥 各組大鼠從造模第8天開(kāi)始灌胃給相應(yīng)藥,按人與大鼠體重?fù)Q算,以等效劑量為烏骨藤中劑量、其1/3劑量為低劑量、3倍劑量定為高劑量,烏骨藤低、中、高劑量組分別給予3 570、7 500、15 000 mg/(kg·d)灌胃;來(lái)氟米特組劑量為2 mg/(kg·d),空白組及模型組灌胃等體積生理鹽水,每日灌胃1次,持續(xù)灌胃給藥28 d。

1.2.4實(shí)驗(yàn)取材 取材于第28天末次灌胃后,予烏拉坦腹腔麻醉后行腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min離心15 min,取上清液置-80 ℃冰箱保存;留取雙后肢膝關(guān)節(jié)滑膜組織,取部分滑膜樣本(0.1 g),置入PBS 1 mL 中,4 ℃搗碎勻漿,3 000 r/min離心10 min取上清,-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1一般觀察 動(dòng)物精神、步態(tài)、被毛、活動(dòng)情況、飲食及飲水量、糞便。

1.3.2AI 建模后第7天開(kāi)始對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行炎癥評(píng)分,采用5級(jí)評(píng)分法:0分,無(wú)關(guān)節(jié)發(fā)紅;1分,趾關(guān)節(jié)發(fā)紅;2分,趾關(guān)節(jié)和足跖腫腫脹;3分,踝關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)和足跖關(guān)節(jié)腫脹;4分,踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹;每個(gè)關(guān)節(jié)最高分為4分,4個(gè)關(guān)節(jié)累及積分記為每只大鼠的總分,分別計(jì)算各組大鼠灌胃前及灌胃第1、2、3、4周時(shí)AI。

1.3.3血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ的水平 按試劑盒說(shuō)明書操作,先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品,設(shè)置空白對(duì)照,37 ℃溫育90 min,棄去孔內(nèi)液體,加入生物素化抗體工作液,37 ℃溫育60 min,加酶結(jié)合物工作液,37 ℃溫育30 min,洗板5次,加顯色劑,37 ℃避光孵育15 min,加入終止液,上酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度D值,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次,取平均值。

1.3.4大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中sST2、ST2L、IL-33蛋白表達(dá)水平 取出適量膝關(guān)節(jié)滑膜組織低溫勻漿后加蛋白裂解液,在冰上裂解30 min,離心5 min、4 ℃,12 000 r/min,取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),用Bradford法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品,10% SDS-PAGE電泳,設(shè)置恒壓25 V轉(zhuǎn)模。用封閉液(TBST)浸泡PVDF膜,室溫封閉2 h,4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5次,5 min/次,加入稀釋好的二抗,室溫?fù)u床孵育2 h。再用TBST洗膜5次,5 min/次。ECL發(fā)光顯影,用Band Scan分析膠片灰度值。

1.3.5檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中sST2、ST2L、IL-33基因表達(dá)水平 Trizol法提取RNA:取膝關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg,加入Trizol試劑1 mL,用勻漿器萃取組織,移至無(wú)RNase的1.5 mL EP管中,裂解10 min。加入氯仿200 μL,劇烈顛倒混勻數(shù)次,室溫放置5 min。4 ℃,12 000 r/min,8 min,轉(zhuǎn)移上層水相至另一離心管,加入400 μL異丙醇,混勻,室溫靜置10 min。4 ℃,12 000 r/min,離心10 min。棄上清,加入75%乙醇,渦旋混勻,離心5 min(4 ℃,10 000 r/min)。棄上清,室溫干燥5～10 min。加入20 μL DEPC水溶解RNA。取RNA2 μL,用顯微分光光度計(jì)測(cè)量D260、D280、D260/D280值,計(jì)算RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄條件:50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min,用相對(duì)定量Ct值法(2-ΔΔCt法)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence of real-time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),精神狀態(tài)良好,皮毛正常有光澤,活動(dòng)自如,飲食飲水佳。模型組大鼠精神日漸萎靡,行走逐漸困難,毛發(fā)無(wú)光澤,飲水及飲水量減少。來(lái)氟米特組和烏骨藤不同劑量組大鼠的精神狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況和關(guān)節(jié)活動(dòng)能力均優(yōu)于模型組大鼠。

2.2 AI結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠AI明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明造模成功;給藥第2周烏骨藤高劑量組的AI下降,與模型組及來(lái)氟米特組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);從給藥第3周開(kāi)始,各治療組AI較模型組下降(P<0.05),烏骨藤組與來(lái)氟米特組療效相當(dāng)。見(jiàn)圖1。

注:因空白組大鼠關(guān)節(jié)無(wú)腫脹,故在圖中顯示不出來(lái);(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來(lái)氟米特組比較,P<0.05。圖1 各組大鼠AI比較Fig.1 Comparison of AI among groups

2.3 血清IL-4、IL-17A、IL-33及INF-γ水平

與空白組比較,模型組大鼠血清中IL-17A、IL-33、INF-γ表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,烏骨藤各劑量組及來(lái)氟米特組大鼠血清IL-17A、IL-33及INF-γ表達(dá)水平降低(P<0.05),且烏骨藤高、中、低劑量組大鼠血清中IL-17A、IL-33及INF-γ水平呈劑量依耐性減少(P<0.05);與來(lái)氟米特組比較,烏骨藤高劑量組IL-17A、IL-33、INF-γ表達(dá)水平較其降低(P<0.05),烏骨藤中劑量組與其相比療效相當(dāng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,烏骨藤高劑量組IL-4表達(dá)水平較其明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注:(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來(lái)氟米特組比較,P<0.05。圖2 各組大鼠血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ水平比較Fig.2 Comparison of serum IL-4, IL-17, IL-33, and INF-γ levels in various groups of rats

2.4 膝關(guān)節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、L-33基因表達(dá)

與空白組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33mRNA表達(dá)明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組比較,來(lái)氟米特組和烏骨藤高劑量組sST2、IL-33、ST2L表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與來(lái)氟米特組比較,烏骨藤高劑量組sST2mRNA表達(dá)降低更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注:(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來(lái)氟米特組比較,P<0.05。圖3 各組大鼠sST2、ST2L、IL-33mRNA表達(dá)Fig.3 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 mRNA in each group

2.5 膝關(guān)節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33蛋白表達(dá)

與空白組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,來(lái)氟米特組和烏骨藤高劑量組sST2、ST2L、IL-33蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且兩組sST2、ST2L和IL-33蛋白表達(dá)水平相當(dāng)。見(jiàn)圖4。

注:A為空白組,B為模型組,C為來(lái)氟米特組,D為烏骨藤低劑量組,E為烏骨藤中劑量組,F為烏骨藤高劑量組;(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。圖4 各組大鼠sST2、ST2L、IL-33蛋白表達(dá)水平比較Fig.4 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 proteins in each group

3 討論

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痹癥是以虛為本,以實(shí)為標(biāo)之癥,其病因病機(jī)可概括為素體虛弱,氣血不足,加感風(fēng)、寒、濕等外邪痹阻經(jīng)絡(luò)所致。中醫(yī)治療主要以扶正祛邪通經(jīng)、活血止痛為主[15]。藤類藥物是我國(guó)臨床中藥學(xué)重要組成部分,被廣泛應(yīng)用于治療中醫(yī)痹癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),藤類藥物主要具有鎮(zhèn)痛、消腫和促進(jìn)外周血循環(huán)等作用,主要是由其化學(xué)成分木脂素、生物堿和揮發(fā)油通過(guò)發(fā)揮抗炎、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)反射機(jī)制的作用[16]。烏骨藤又叫通關(guān)藤,出自《貴州民間藥物》,具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活血、散結(jié)消炎止痛之效,是我國(guó)西南地區(qū)常用的民族藥之一[17]。目前治療RA的中藥復(fù)方中也常見(jiàn)此味中藥,但對(duì)其抗炎、抗風(fēng)濕作用機(jī)制鮮有報(bào)道。來(lái)氟米特是免疫抑制劑中的其中一種,對(duì)T細(xì)胞的增殖與活化具有抑制作用,可抑制相關(guān)炎性細(xì)胞因子的分泌,增強(qiáng)免疫抑制[18],因此本研究選用來(lái)氟米特作為陽(yáng)性對(duì)照組。

研究表明,IL-33/ST2信號(hào)通路是免疫功能障礙和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路[19]。ST2可調(diào)節(jié)IL-33的活性,當(dāng)機(jī)體受炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷及應(yīng)激等不良因素入侵時(shí),IL-33作為前炎癥性細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外,與其受體ST2結(jié)合激活下游信號(hào),從而影響多種細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生與分泌,導(dǎo)致Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡失調(diào),促使炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[20-21]。T淋巴細(xì)胞上ST2的表達(dá)被證明可驅(qū)動(dòng)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,負(fù)責(zé)感染和組織修復(fù)期間的炎癥反應(yīng)。ST2耗竭可導(dǎo)致Th1/Th17反應(yīng)增強(qiáng)和抗腫瘤免疫[22]。IL-33與ST2L及IL-1R輔助蛋白(interleukin-1 receptor accessory protein,IL-1RAcP)結(jié)合產(chǎn)生異二聚體受體復(fù)合物,募集髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1R相關(guān)激酶1/4(interleukin-1 receptor-associated kinase1/4,IL-1RAK1/4)、TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAP6),通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和活化B細(xì)胞的核子-κ輕鏈增強(qiáng)(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)途徑使下游轉(zhuǎn)錄因子激活[23]。ST2特異性抗體或sST2可以拮抗IL-33與ST2L受體的結(jié)合抑制下游反應(yīng)。正常情況下,血清sST2含量較低。IL-33/ST2L通路的激活促進(jìn)Th2的免疫炎癥反應(yīng),促進(jìn)sST2表達(dá)增加,負(fù)向調(diào)節(jié)Th2反應(yīng)[20]。當(dāng)IL-33與特定受體ST2結(jié)合后,刺激細(xì)胞因子分泌,包括抗炎因子IL-4、IL-5、IL-13,炎癥刺激因子IFN-γ和TNF-α等增強(qiáng)炎癥反應(yīng),促進(jìn)疾病進(jìn)程的發(fā)展[24]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,烏骨藤能夠下調(diào)CIA大鼠sST2、ST2L、IL-33基因及蛋白表達(dá)水平,呈劑量依耐性降低血清炎癥因子IL-17A、IL-33、INF-γ表達(dá)水平,上調(diào)抑炎因子IL-4水平,提示烏骨藤可能通過(guò)抑制調(diào)控IL-33/ST2信號(hào),減少炎癥因子對(duì)滑膜細(xì)胞的浸潤(rùn),增加抑炎因子,降低AI,進(jìn)而緩解RA的炎癥反應(yīng)。烏骨藤高劑量組與RA一線用藥來(lái)氟米特對(duì)CIA模型鼠治療效果相當(dāng)。本研究為RA的研究和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),表明烏骨藤可能是有效治療RA的藤類藥物,值得進(jìn)一步研究。