奶山羊CAEV感染血清抗體的消長(zhǎng)規(guī)律

王登峰,古努爾·吐?tīng)栠d,李建軍,洪都孜·波拉提,楊學(xué)云,孟肖瀟,吳建勇

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)/福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆動(dòng)物疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830013)

0 引 言

【研究意義】山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎(Caprine arthritis encephalitis,CAE)是一種山羊慢性傳染病,發(fā)病羊臨床表現(xiàn)為慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、滑囊炎和幼畜腦炎,有時(shí)也發(fā)生間質(zhì)性肺炎、間質(zhì)性乳房炎和腦脊髓炎等臨床癥狀,但大多數(shù)受感染山羊不表現(xiàn)出臨床疾病[1]。【前人研究進(jìn)展】目前尚未見(jiàn)到可一次檢測(cè)各種基因型病原且敏感度較高的分子生物學(xué)檢測(cè)方法[2,5-7]。CAEV感染后,感染動(dòng)物至少針對(duì)4種病毒主要抗原產(chǎn)生抗體:外膜糖蛋白(SU,gp135)和跨膜糖蛋白(TM,gp45)、衣殼(CA,p28)和基質(zhì)(MA,p16)蛋白,一旦感染后抗體持續(xù)存在[8]。迄今為止,CAE血清學(xué)診斷的主要方法是基于三種不同抗原組合之一的血清學(xué)免疫酶分析:全病毒抗原(SU、TM、CA和MA的混合物),或重組TM和CA抗原組合,或SU抗原,其中使用全病毒抗原檢測(cè)被測(cè)動(dòng)物血清中總抗體水平是檢疫上較常用的方法[9]。【本研究切入點(diǎn)】由于山羊感染CAEV后終生帶毒,刺激產(chǎn)生的抗體持續(xù)存在,雖存在多種基因型毒株但其抗原性高度交叉,檢測(cè)病毒刺激產(chǎn)生的特異性抗體成為判斷感染的主要方法[2,10],尋找和設(shè)計(jì)適配各種型和亞型的通用檢測(cè)引物極為困難,需研究感染后抗體產(chǎn)生的時(shí)間和抗體的消長(zhǎng)規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用CAEV山東分離株和參考株(ATCC VR-905)經(jīng)頸靜脈感染關(guān)中奶山羊,收集的血清樣本,運(yùn)用CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX,J701)定期檢測(cè)300 d內(nèi)的動(dòng)物血清抗體,分析感染后可檢測(cè)抗體出現(xiàn)的時(shí)間和抗體水平的消長(zhǎng)規(guī)律,為CAEV總抗體檢測(cè)技術(shù)在檢疫中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 CAEV毒株和試驗(yàn)動(dòng)物

1987～1994年間新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究先后從甘肅、陜西、貴州、四川和山東分離到CAEV病毒,毒株的全基因組序列已提交至GenBank,登錄號(hào)依次為KT749881、KT749879、KT749880、KT214469和KT749878。以gag-pol基因序列為基礎(chǔ)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,確定所有分離株均屬于B1基因型,其gag基因序列的相似性為99.2%～99.9%。奶山羊感染試驗(yàn)中使用山東株(KT749878)和購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心的參考株(ATCC VR-905),其中山東株感染羊作為試驗(yàn)組,參考株感染羊作為參考株對(duì)照組。

從新疆石河子市某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)關(guān)中奶山羊9只(<3月齡),其中公羊5只和母羊4只,所有羊購(gòu)買(mǎi)前10 d經(jīng)試管凝集試驗(yàn)(動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB/T18646—2002)確認(rèn)為布魯桿菌病血清學(xué)陰性。奶山羊購(gòu)買(mǎi)后集中飼養(yǎng),在感染前70 d和10 d分別采集血液樣本,使用CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)和血液DNA中CAEV前病毒p28蛋白基因(p1:5’- ATA GTA GTG CAA GCA GCA GGA-3’;p2:5’-TGC ATT TTG AAC CCT TCT GAT CCC-3’)檢測(cè),確認(rèn)為CAEV感染陰性羊。

1.1.2 主要試劑

CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX CAEV/MVV Total Ab,J701)購(gòu)自IDEXX公司(美國(guó));PrimeScript RT reagent Kit、SYBR premix Ex Taq II購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(DP318)、病毒RNA提取試劑盒(DP315-R)、2×TaqPCR MasterMix(KT201-02)、D2000 DNA Marker(MD114)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

奶山羊隨機(jī)分成3組,每組3只:試驗(yàn)組感染CAEV山東株、參考株對(duì)照組感染ATCC VR-905和陰性對(duì)照組。使用較高的感染劑量:試驗(yàn)組感染劑量為4.04×108copies/羊,參考株對(duì)照組為5.80×107copies/羊,陰性對(duì)照組靜脈注射同步處理的正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液2 mL。感染前第10 d時(shí)單只羊隔離同等條件飼養(yǎng)。感染后的第8、15、24、28、42、58、71、84、99、113、128、155、170、182、210、243、273、300 d用EDTA-K2抗凝管和血清采集管分別采集頸靜脈血液樣本3～5 mL,每種血樣分成3份。

試驗(yàn)期間對(duì)山羊進(jìn)行臨床記錄,結(jié)束后試驗(yàn)羊全部頸靜脈放血宰殺,采集前肢關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行CAEV前病毒p28基因的擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析,并進(jìn)行病理剖檢,隨后焚燒銷(xiāo)毀處理。

1.2.2 奶山羊感染后CAEV總抗體的檢測(cè)

使用IDEXX公司(美國(guó))生產(chǎn)的CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清中CAEV全病毒特異性抗體的檢測(cè)。

其中,OD450sample為樣本OD450nm值,OD450negative為陰性對(duì)照平均OD450nm值,OD450positive為陽(yáng)性對(duì)照平均OD450nm值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為Value<30%為陰性,30%≤Value<40%為可疑,Value>40%為陽(yáng)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6.0繪制抗體動(dòng)態(tài)曲線圖;抗體水平的組間比較采用方差分析;采用Origin 2018軟件繪制基于非線性曲線模型的抗體動(dòng)態(tài)擬合曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染鑒定

研究表明,在300 d的監(jiān)測(cè)周期內(nèi),未觀察到試驗(yàn)組和參考株對(duì)照組山羊出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)腫大、腦炎等臨床癥狀;試驗(yàn)羊剖檢后也未見(jiàn)肺臟、腦組織、乳腺和關(guān)節(jié)等出現(xiàn)臨床病理變化。監(jiān)測(cè)期結(jié)束后,試驗(yàn)羊宰殺后取前肢關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行CAEV前病毒p28基因擴(kuò)增和序列測(cè)定,試驗(yàn)組和參考株對(duì)照組擴(kuò)增的靶標(biāo)序列分別與感染用山東株、參考株(ATCC VR-905)的相似度大于99.9%,試驗(yàn)羊和參考株對(duì)照羊感染的病毒與設(shè)計(jì)一致,陰性對(duì)照組中靶標(biāo)序列檢測(cè)為陰性。圖1

注：A:奶山羊感染CAEV后抗體水平變化趨勢(shì);B:山東株試驗(yàn)組、參考株對(duì)照組和陰性對(duì)照組抗體水平的組間比較;1:山東株試驗(yàn)組;2:參考株對(duì)照組;3:陰性對(duì)照組;**** 表示P<0.001

2.2 感染后抗體監(jiān)測(cè)

研究表明,感染后第24 d時(shí),試驗(yàn)組1只公羊和參考株對(duì)照組1只母羊和抗體轉(zhuǎn)陽(yáng);第28 d時(shí),試驗(yàn)組無(wú)變化,參考株對(duì)照組再次有1只母羊抗體轉(zhuǎn)陽(yáng);第42 d時(shí)試驗(yàn)組其余2只羊轉(zhuǎn)陽(yáng);參考株對(duì)照組無(wú)變化;第71 d時(shí),試驗(yàn)組均為陽(yáng)性,參考株對(duì)照組第3只羊(公羊)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)。試驗(yàn)組和參考株對(duì)照組山羊抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均為陽(yáng)性,陰性對(duì)照組抗體始終為陰性。

試驗(yàn)組和參考株對(duì)照組山羊感染CAEV后,在抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后至感染后第99 d期間CAEV總抗體OD450值呈快速上升趨勢(shì)。試驗(yàn)組在感染后第99 d時(shí)抗體OD450值達(dá)到頂峰,在余下的200 d監(jiān)測(cè)期間內(nèi)維持在較高值的平臺(tái)期;參考株對(duì)照組抗體平均OD450值在感染后180 d時(shí)達(dá)到頂峰,雖自155 d起抗體平均OD450值均較高并維持至監(jiān)測(cè)結(jié)束,但該期間個(gè)體值差異較大。陰性對(duì)照組的平均OD450值始終較低且判定為抗體陰性的狀態(tài)。在整個(gè)監(jiān)測(cè)周期內(nèi),試驗(yàn)組和參考株對(duì)照組的抗體水平均極顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.001),但兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。圖1

2.3 抗體水平動(dòng)態(tài)曲線的非線性擬合

研究表明,奶山羊感染后抗體變化趨勢(shì)整體呈現(xiàn)拋物線狀,但各感染羊自抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后的整個(gè)監(jiān)測(cè)期間其抗體值的95%置信帶最低值和95%預(yù)測(cè)帶最低值均高于陽(yáng)性臨界判定值,抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后的整個(gè)監(jiān)測(cè)周期內(nèi)均可使用檢測(cè)總抗體的方法鑒別感染羊。

CAEV感染組抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后的整個(gè)監(jiān)測(cè)期內(nèi),試驗(yàn)組3只羊的抗體OD450值95%預(yù)測(cè)帶均在0.5～2.3,參考株對(duì)照組1只羊的抗體OD450值95%預(yù)測(cè)帶在0.5～2.6,其它2只羊在0.5～1.5,我國(guó)分離的山東株和參考株(ATCC VR-905)在刺激山羊產(chǎn)生體液免疫方面可能存在差異。圖2

注：山東株試驗(yàn)組:A:1號(hào)羊(公);B:2號(hào)羊(母);C:3號(hào)羊(公);參考株對(duì)照組:D:1號(hào)羊(母);E:2號(hào)羊(公);F:3號(hào)羊(公)

3 討 論

1987～1994年間先后從我國(guó)甘肅、陜西、貴州、四川和山東山羊體內(nèi)分離到CAEV[11-13]。1987～1995年間使用瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)方法(AGID)對(duì)我國(guó)17個(gè)省(區(qū))的13個(gè)山羊品種共計(jì)21 169只(次)山羊的CAEV血清學(xué)調(diào)查,顯示總陽(yáng)性率3.33%,11個(gè)省(區(qū))檢出抗體陽(yáng)性羊[14]。2018年,對(duì)我國(guó)11個(gè)省(區(qū))2 083只山羊的調(diào)查顯示抗體陽(yáng)性率為0.38%,4個(gè)省(區(qū))檢出抗體陽(yáng)性羊[15],有文獻(xiàn)也顯示中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)山羊的血清學(xué)陽(yáng)性率[16]。CAEV在我國(guó)各地羊群中整體流行率仍較低。日本和西班牙南部的個(gè)體陽(yáng)性率和場(chǎng)陽(yáng)性率比例也有文獻(xiàn)報(bào)道[17,18]。該病毒復(fù)制緩慢,經(jīng)多年的隱性感染后最多30%的感染羊出現(xiàn)臨床癥狀[5, 19]。

目前,CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒是用于區(qū)分CAEV感染山羊的主要方法之一。奶山羊感染山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒后總抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)和抗體OD450值結(jié)果顯示:CAEV山東株感染后第24 d時(shí)僅一只羊抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),直至第42 d時(shí)全部轉(zhuǎn)陽(yáng);參考株(ATCC VR-905)感染后第24和28 d時(shí)各有一只羊抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),第三只羊在第42、58 d時(shí)仍為陰性,直至第71 d時(shí)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)。繼續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后在余下的監(jiān)測(cè)期內(nèi)均為陽(yáng)性。抗體水平動(dòng)態(tài)曲線的非線性曲線模型擬合分析也顯示各感染羊自抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后的整個(gè)監(jiān)測(cè)期間其抗體值的95%置信帶最低值和95%預(yù)測(cè)帶最低值均高于陽(yáng)性臨界判定值;研究證實(shí)山羊感染CAEV后的抗體持續(xù)期可以長(zhǎng)達(dá)5年以上[20],抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后的整個(gè)監(jiān)測(cè)周期內(nèi)均可使用檢測(cè)CAEV總抗體的方法進(jìn)行鑒別感染羊。同時(shí),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用該方法對(duì)感染后30和45 d的山羊進(jìn)行檢測(cè)出現(xiàn)50%(3/6)和16.7%(1/6)的山羊判定為抗體陰性,即“假陰性”,山羊CAE檢疫中,使用CAEV/MVV總抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),對(duì)抗體陰性山羊必須進(jìn)行間隔期不少于60 d的2次以上的檢疫才可判定為陰性。

4 結(jié) 論

山羊經(jīng)頸靜脈感染CAEV后45 d時(shí)約85%(5/6)的山羊血清總抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),71 d時(shí)所有感染山羊血清總抗體均轉(zhuǎn)陽(yáng),其后200余天的檢測(cè)期內(nèi)抗體持續(xù)處在較高水平。檢測(cè)山羊血清中CAEV總抗體水平適用于感染動(dòng)物的判定,使用血清中總抗體水平檢疫時(shí),必須進(jìn)行間隔期不少于60 d的2次以上的檢疫方可確診為陰性羊。