巴旦木細菌性穿孔病菌的生物學特性及抑菌藥劑篩選

宋單波,張國新,王 權,劉保軍,黃 濤,韓宏偉,白劍宇,郭慶元

(1.新疆農業(yè)大學農學院,烏魯木齊 830091;2.烏魯木齊海關動植物檢疫處,烏魯木齊 830011;3.新疆林業(yè)科學院經濟林研究所,烏魯木齊 830063)

0 引 言

【研究意義】巴旦木為薔薇科李亞科桃屬喬木,學名為扁桃[1]。巴旦木杏仁含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分[2-3]。而且鎂、鈣和鉀等微量元素的含量也很高[4]。在我國,巴旦木主要分布在新疆、四川,河南和河北等省市[5-6],其中新疆是我國巴旦木的主產區(qū),主要分布在喀什地區(qū)莎車縣和英吉沙縣。近年來,南疆地區(qū)巴旦木,病蟲害的發(fā)生與危害也有所加重。巴旦木細菌性穿孔病主要危害巴旦木的葉片和果實,形成近圓形或不規(guī)則形黑褐色病斑,具黃色暈圈,葉片上的病斑后期干枯脫落,形成穿孔,影響巴旦木的光合作用,造成巴旦木的產量下降和品質降低。研究該病致病病原,分析病原菌生物學特性及室內防控藥劑初選,對田間高效防控藥劑的篩選有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】2004年唐德志等[7]對扁桃病害統(tǒng)計中報道了扁桃細菌性穿孔病主要由黃單胞桿菌造成。趙震宇[8]報道了尾孢屬真菌引起扁桃白斑病,臧旭陽等[9]報道扁桃葉斑病是由3種真菌復合侵染造成,其中鏈格孢菌是扁桃葉斑病的致病優(yōu)勢種,其危害癥狀與細菌性穿孔病極為相似。2020年,在新疆莎車縣巴旦木種植園發(fā)現(xiàn)了一種危害巴旦木的新病害,其發(fā)病癥狀與桃細菌性穿孔病相似,全園株發(fā)病率高達90%以上,果實發(fā)病率在30%以上?！颈狙芯壳腥朦c】巴旦木細菌性穿孔病是2020年在我國新疆發(fā)現(xiàn)的一種新病害,病原為由假單胞菌(Pseudomonassp)侵染引起,由于對該病害侵染循環(huán)規(guī)律的研究尚處于初始階段,在病害防控方面無直接的文獻資料做參考。需開展病原菌生物學特性和室內藥劑篩選,能為病害的高效防控提供指導。【擬解決的關鍵問題】通過病原菌在不同的溫度、pH、NaCl濃度、培養(yǎng)基等條件下生長情況,研究不同藥劑對病原菌的抑制效果,分析病原菌的主要生物學特性,初選出抑菌效果明顯的防控藥劑,為田間病害的高效防控技術的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

XJsc-13,采自喀什地區(qū)莎車縣,經分離純化和準確鑒定的代表菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

NA:5 g/L牛肉膏、5 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl、 15～18 g/L瓊脂、蒸餾水1 L,調pH至7.2。

PDA:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉18～20 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調至7.0。

YEM:甘露醇10 g/L、酵母膏3 g/L、氯化鈉0.2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調至7.2。

LB:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、蒸餾水1 000 mL、pH調制7.0。

SPA:蔗糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.25 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調至7.2。

BPA:蛋白胨5～10 g/L、蔗糖10 g/L、牛肉膏3 g/L、酵母提取物1 g/L、蒸餾水1 000 mL,pH調至7.0。

1.1.3 供試藥劑

查閱相關文獻[10-14]以及生產中常用的殺菌劑,選擇其中的12種作為供試藥劑。表1

表1 供試藥劑名稱、劑型及生產廠家

1.2 方 法

1.2.1 病原菌生物學特性測定

(1)接種液制備

將菌株XJsc-13在NA平板上活化,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用接種環(huán)挑取活化后的單菌落,接種于100 mL的液體培養(yǎng)基NA中,在160 r/min、28℃條件下中震蕩12 h左右,再用分光光度計測定其OD600值,當OD600值達到1.0左右時的菌懸液作為接種液。

(2)不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

取制備好的菌懸液0.1 mL接種于盛有NA、LB、SPA、YEM、BPA、PDA液體培養(yǎng)基的試管中,每個試管裝有10 mL液體培養(yǎng)基,每個處理重復3次,以相同培養(yǎng)液接種未培養(yǎng)的菌懸液為對照。

(3)pH對病原菌生長的影響

用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調節(jié)NA液體培養(yǎng)基的pH值,配制不同pH值的NA培養(yǎng)基,pH值分別為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11、12,共13個梯度,每個處理設3次重復。

(4)不同溫度對病原菌生長的影響

將培養(yǎng)溫度分別設定為5、10、15、20、25、28、30、35、40、45和50℃,共11個溫度梯度,每個溫度設3次重復。

(5)不同碳氮源對病原菌生長的影響

以SPA為基礎培養(yǎng)基,把其中的蔗糖分別用麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖等質量的碳代替,把其中的蛋白胨分別用NH4Cl、牛肉膏、酵母膏、草酸銨、賴氨酸、甘氨酸、胰蛋白胨等質量的氮代替,每個處理設3次重復。

(6)NaCl濃度對病原菌生長的影響

在NA培養(yǎng)液中加入NaCl將終濃度分別設定為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%和12%,共13個濃度梯度,每個處理設3次重復。

(7)致死溫度測定

根據不同溫度對病原菌生長影響的測定結果,致死溫度測定區(qū)間設置在45～50℃,設定46、47、48、49和50℃等5個溫度。分別取500 μL病原菌菌懸液加入1.5 mL滅過菌的離心管震蕩混勻后,放入設定好的恒溫水浴鍋中,每個溫度處理10 min后取出,取100 μL涂布到NA培養(yǎng)基平板中,置于28℃培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落生長情況,每個處理設定3次重復,依據菌落的有無判斷病原菌的致死溫度。

以上試驗(除溫度試驗外)在搖床為160 r/min、28℃條件下中震蕩24 h左右,再用分光光度計測定其OD600值。

1.2.2 室內藥劑毒力篩選

(1)含菌平板的制備

將單菌落放入NA培養(yǎng)液中,28℃,160 r/min,恒溫搖床中震蕩24 h后測量其OD600值,然后用滅菌水稀釋到1×10-6cfu/mL,取100 μL菌懸液均勻涂布于凝固后的NA平板表面,晾干后備用。

(2)抑菌率測定

用6 mm的打孔器打取濾紙片,高壓滅菌后晾干備用。將滅菌的濾紙片放入配制好的不同濃度的藥劑中浸泡1 min,用無菌鑷子夾取濾紙片,在容器壁上控出多余的藥液,將含藥濾紙片平鋪在涂布過菌懸液的NA平板中間,每個濃度設3次重復,以浸過無菌水的濾紙片為對照,倒置放于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,采用十字交叉法[15]測量不同藥劑在不同濃度下的抑菌圈直徑,并計算抑菌率,以藥劑有效成分濃度的對數(shù)值為自變量(X),相對抑菌率的機率值為因變量(Y),建立毒力回歸方程計算相關系數(shù)R和EC50[16]。

抑制率(%)=(處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑×100%。

1.3 數(shù)據處理

試驗數(shù)據采用Office 2009和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,用Duncan's法進行處理間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

研究表明,病原菌在NA、YEM、LB、PDA、SPA、BPA上均能生長,但病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長量存在明顯的差異,其中病原菌在LB培養(yǎng)基上的生長量最大,其次為YEM、NA、BPA和PDA、而在SPA培養(yǎng)基上生長量最小。圖1

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 不同pH對病原菌生長的影響

研究表明,病原菌在培養(yǎng)液pH為5～10均能生長,最適pH為7.5,在培養(yǎng)液pH值小于5和高于11病原菌生長幾乎停滯,不利于病原菌的生長。圖2

圖2 不同pH下病原菌生長變化

2.3 不同NaCl濃度對病原菌生長的影響

研究表明,病原菌在NaCl濃度在0%～7%均能生長,NaCl濃度為1%時能促進病原菌的生長,當NaCl濃度達到3%時,病原菌生長開始受到抑制,達到7%時病原菌的生長完全停滯。圖3

圖3 不同NaCl濃度下病原菌生長變化

2.4 不同碳、氮源對病原菌生長的影響

研究表明,在8種不同碳源的培養(yǎng)基中,病原菌的生長量存在顯著的差異,其中在甘露醇作為碳源的培養(yǎng)液中生長最好,其次是山梨醇和葡萄糖,而以乳糖作為碳源時生長最差。在8種不同氮源的培養(yǎng)基中,酵母膏為最適合病原菌生長的氮源,其次是牛肉膏和蛋白胨,3種氮源生長相對差異不大,在氯化銨作為氮源的培養(yǎng)液中生長較差。圖4

圖4 不同碳、氮源下病原菌生長變化

2.5 溫度對病原菌生長的影響

研究表明,病原菌在5～45℃均能生長,最適生長溫度為28℃,但在15℃以下和35℃以上的溫度條件下病原菌生長受到抑制,在溫度達到50℃時病原菌生長基本停滯。病原菌的致死溫度為50℃。圖5

圖5 不同溫度下病原菌生長變化

2.6 不同殺菌劑對病原菌的抑菌效果

研究表明,12種供試藥劑對病原菌均具有一定抑菌效果,但不同藥劑和同種藥劑不同濃度的抑菌效果都存在差異。0.3%四霉素和1.2%的中生菌素抑菌效果最好,EC50最小分別為2.92、6.47 mg/L,其次是3%噻霉酮和53.8%氫氧化銅EC50分別為20.25、50.94 mg/L,80%波爾多液和30%噻唑鋅對病原菌的抑制效果較差,當濃度達到10 000 mg/L以上才能抑制病原菌。表2

表2 12種殺菌劑對巴旦木細菌性穿孔病病原毒力測定結果

續(xù)表2 12種殺菌劑對巴旦木細菌性穿孔病病原毒力測定結果

3 討 論

研究結果表明,病原菌的最適生長溫度在28℃左右,致死溫度為50℃,最適pH為7.5,最適NaCl濃度為1%。李燕等[17]在對蘋果細菌性枝枯病的病原菌(Pseudomonassyringaepv.Syringa)的生物學特性進行測定時發(fā)現(xiàn)該病原菌最適合在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基+5%蔗糖培養(yǎng)基上生長,最適溫度為27℃,最適合在pH為7.5時生長,在0.5% NaCl的濃度最適合生長,張盧慧等[18]對辣椒細菌性果實條斑病的病原菌阿根廷假單胞菌生物學特性進行測定時,最適合溫度為28℃,最適合在pH為7時生長。研究中巴旦木細菌性穿孔病病原菌與這兩種假單胞菌的生物學特性存在一定的差異,巴旦木細菌性穿孔病病原菌與這兩種病原菌盡管均屬于同一屬,但具體種類不同,與Gross等[19]報道的同屬中不同種之間,以及不同地區(qū)、不同寄主都可能存在差異的結果相吻合。

在供試的12種藥劑的室內抑菌試驗中,0.3%四霉素的毒力最強,其次為1.2%中生菌素和3%噻霉酮,對巴旦木細菌性穿孔病病原菌的抑菌效果最好,可作為田間藥劑防控試驗的備選,但不同的藥劑在不同環(huán)境條件下和不同寄主植物植株上的作用機制不同,防治效果也存在一定的差異,室內藥劑試驗的篩選結果并不代表抑菌效果差的藥劑的田間防治效果也差。在室內藥劑初選試驗的基礎上,還需要結合田間藥劑防控試驗進行進一步的篩選和試驗驗證。

4 結 論

4.1巴旦木細菌性穿孔病的病原菌在不同的溫度、pH、氯化鈉濃度、培養(yǎng)基和碳氮源等生長條件下的生長情況都有著明顯的差異,在供試的8種培養(yǎng)基中,最適培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基,最適生長溫度為28℃,最適合生長pH為7.5,最適氯化鈉濃度為1%,致死溫度為50℃。在以甘露醇為碳源和酵母膏為氮源時生長量最好,在不同的氮源中,病原菌對酵母膏利用最好,在氯化銨作為氮源時,不利于病原菌生長。

4.212種供試藥劑,在一定濃度范圍內均具有一定的抑菌效果,但不同藥劑和同種藥劑不同濃度的抑菌效果都存在差異,0.3%四霉素的毒力最強,其次為1.2%中生菌素和3%噻霉酮。