棉稈固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解與酶活性變化的關聯(lián)分析

李佩琪,孫慶培,王志慧,秦新政,樊永紅

(1.新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】2020年新疆棉花產(chǎn)量達516.1×104t,占全國棉花總產(chǎn)量87.3%,棉花秸稈作為主要的棉花副產(chǎn)品,總量很大[1]。當前處理棉稈的方法主要是直接焚燒后還田和就地粉碎掩埋于棉田[2]。棉稈有機物含量高,同時富含氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素,通過固體發(fā)酵,可以轉化為有機基質(zhì)[3],其中木質(zhì)素和纖維素的降解程度代表了有機基質(zhì)的腐熟程度[4]。木質(zhì)素作為一種物理屏障嵌合在纖維素和半纖維素中,形成致密的基質(zhì),阻礙了秸稈的生物降解與利用[5-6]。秸稈腐熟過程實質(zhì)是微生物反應過程,而微生物反應主要依賴于其分泌的相關降解酶作用。木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)決定著木質(zhì)素降解的途徑、速度和程度。目前已知的木質(zhì)素降解酶主要包括:木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidases/LiP)、錳過氧化物酶(Manganese perxidases/MnP)和漆酶(Laccase/Lac)[7-8]。分析棉稈固體發(fā)酵中木質(zhì)素的降解與木質(zhì)素降解酶活性變化關聯(lián)性,對研究木質(zhì)素降解機理有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前,其他類型的秸稈用于生產(chǎn)有機基質(zhì)已經(jīng)有了很多成功的實例[9-11],在稻草秸稈堆肥過程中,纖維素和半纖維素均在高溫期降解明顯,堆肥結束時分別降解10.07%和3.20%[12]。纖維素和半纖維素在發(fā)酵初期降解最強烈,木質(zhì)素的降解率在發(fā)酵9 d后才略微升高,15 d后半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量分別下降82.49%、97.20%和20.12%[13]。在含有稻草和雞糞的堆肥研究中發(fā)現(xiàn),LiP活性在堆肥的最初7 d逐漸升高,隨后開始下降[14]。在小麥秸稈堆肥中添加腐生真菌使Lac、MnP活性顯著提高至2 000和220 U/L,且Lac活性和MnP活性之間存在明顯的相關性[15],關于木質(zhì)素降解酶的研究更多集中在木質(zhì)素降解酶相關基因結構[16-17]、表達調(diào)控機理[18-19]、以及酶學性質(zhì)[20-21]等?！颈狙芯壳腥朦c】由于棉稈理化結構有其特殊性,實際應用中有關棉稈木質(zhì)素降解關鍵酶作用規(guī)律及其與木質(zhì)素降解的關聯(lián)研究較少。需分析棉花秸稈經(jīng)固體發(fā)酵轉化為有機基質(zhì)過程中的木質(zhì)素降解與木質(zhì)素降解酶活性的關聯(lián)性?！緮M解決的關鍵問題】研究木質(zhì)素在基質(zhì)化過程中降解的生物學特性,對優(yōu)化棉稈生產(chǎn)有機基質(zhì)工藝和提高木質(zhì)素降解效率提供重要依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

棉花秸稈來源于新疆烏魯木齊市,將棉稈自然晾干粉碎成長度約2～3 cm。

1.2 方 法

1.2.1 棉稈固體發(fā)酵

取5 kg粉碎干燥的棉稈,加入4 kg的水,攪拌均勻,在40目透氣尼龍袋中進行腐熟發(fā)酵,根據(jù)溫度變化,分別在第1、3、5、14、18、25 d時從堆體不同部位取樣后混合,低溫粉碎后用于測定各種指標。在堆體內(nèi)外放置溫度計,記錄環(huán)境溫度和發(fā)酵溫度變化。

1.2.2 固體發(fā)酵不同階段棉稈失重率

棉稈失重率以質(zhì)量分數(shù)ωx計,數(shù)值以%表示。

式中,N0為發(fā)酵前棉稈干重;NX為某一發(fā)酵時間的棉稈干重。

1.2.3 固體發(fā)酵不同階段棉稈纖維素、半纖維素的含量

纖維素和半纖維素含量均按照NY/T3494-2019[22]測定。棉稈發(fā)酵樣品干燥、粉碎,過40目篩,通過索氏抽提,先后用去離子水和95%無水乙醇充分去除樣品中的水溶性、醇溶性游離組分。經(jīng)過索氏抽提和干燥處理的樣品進行硫酸水解,經(jīng)濃硫酸酸化將樣品中高聚合度的纖維素和半纖維素降解為低聚合度的寡糖,再通過稀硫酸將低聚寡糖進一步水解成單糖。樣品的酸解溶液過砂芯坩堝濾器后,采用高效液相色譜方法測定其中單糖的含量,確定樣品中的纖維素、半纖維素的含量。纖維素、半纖維素含量均以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示。

纖維素含量(Cel)=Z1.

半纖維素含量(Hem)=Z2+Z3+Z4+Z5.

式中,Ci為第i種單糖的濃度;V為濾液體積;F為脫水校正因子;木聚糖、阿拉伯聚糖用0.88校正,葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖用0.9校正;Ri為單糖回收率;ω0為抽提前樣品質(zhì)量;ω1為抽提后樣品質(zhì)量;ωef為稱取的不含抽提物的試樣質(zhì)量;Z1為試樣中葡萄聚糖的含量;Z2為試樣中木聚糖的含量;Z3為試樣中半乳聚糖的含量;Z4為試樣中阿拉伯聚糖的含量;Z5為試樣中甘露聚糖的含量。

1.2.4 固體發(fā)酵不同階段棉稈木質(zhì)素含量

木質(zhì)素含量按照NY/T3494-2019測定。總木質(zhì)素含量為酸溶性木質(zhì)素和酸不溶性木質(zhì)素之和。樣品的酸解濾液經(jīng)過320 nm紫外檢測吸光度,計算出酸溶性木質(zhì)素含量。酸不溶性木質(zhì)素則通過高溫灼燒法,在馬弗爐中575 ℃充分灼燒砂芯坩堝濾器收集的殘渣,計算出酸不溶性木質(zhì)素含量。以上二者之和即為樣品中的總木質(zhì)素含量。酸溶性木質(zhì)素、酸不溶性木質(zhì)素含量均以質(zhì)量百分數(shù)(%)表示。

式中,m1為坩堝的質(zhì)量;m2為坩堝和酸不溶性殘渣的質(zhì)量;m3為坩堝和灰分的質(zhì)量;A為濾液在320 nm處的吸光值;N為濾液稀釋倍數(shù);L為比色皿厚度;ε為酸溶木質(zhì)素在320 nm處吸收率;值為25 L/(g·cm)。

1.2.5 固體發(fā)酵不同階段木質(zhì)素降解酶活性

粗酶液的提取:取5 g發(fā)酵棉稈,加入50 mL緩沖溶液(0.1 mol/L酒石酸鈉緩沖液(pH 4.5)和0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5),分別用于不同的木質(zhì)素酶活分析),220 mg/kg振搖浸提1 h,在4℃下10 000 r/min離心10 min,取上清作為待測粗酶液。

錳過氧化物酶(MnP)的測定[23]:反應體系3 mL,0.1 mol/L酒石酸鈉緩沖液(pH 4.5)2.52 mL,10 mmol/L的硫酸錳0.15 mL,10 mmol/L的2,6-DMP (2,6-二甲氧基苯酚) 0.15 mL,粗酶液0.15 mL,混勻,37℃水浴3 min,加入10 mmol/L過氧化氫0.03 mL啟動反應,測定最初3 min內(nèi)469 nm處吸光值的變化,469 nm處2,6-DMP氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為49 600 L/(mol·cm)。酶活定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)的測定[24]:反應體系3 mL,0.1 mol/L酒石酸鈉緩沖液(pH 3)1.5 mL,10 mmol/L的藜蘆醇1 mL,粗酶液0.4 mL,混勻,25 ℃水浴3 min,加入10 mmol/L的過氧化氫0.1 mL啟動反應,測定最初3 min內(nèi)310 nm處吸光值變化,310 nm處藜蘆醇氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為9 300 L/(mol·cm)酶活定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

漆酶(Lac)的測定[25]:反應體系3 mL,0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)1.8 mL,0.5 mmol/L的ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸))0.2 mL,粗酶液1 mL,混勻,28 ℃水浴3 min,測定最初3 min內(nèi)420 nm處吸光值變化,420 nm處ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)為36 000 L/(mol·cm)酶活定義為分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

式中,n為測定時酶液的稀釋倍數(shù);ε為摩爾消光系數(shù);V總為反應總體積;V酶為反應中加入的粗酶液體積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019、Orgin 2021軟件進行數(shù)據(jù)整理、繪圖。在SPSS 26.0軟件中利用Pearson相關性分析法、主成分分析法對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 固體發(fā)酵不同階段溫度變化

研究表明,整個發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,發(fā)酵前期堆體快速升溫,在溫度達到50℃后進入高溫期,最高溫度達到62℃,高溫維持2～3 d后開始降溫,降至室溫后進行翻堆,翻堆后溫度再次上升至54℃,之后溫度再次下降;經(jīng)多次翻堆后發(fā)酵溫度不再上升,靜置發(fā)酵直至結束。將整個發(fā)酵階段分為升溫期(0～3 d),高溫期(4～6 d),熟化期(8～25 d)。取發(fā)酵第1 d(初始階段)、3 d(升溫期)、5 d(高溫期)、18 d(熟化期)、25 d(末期)發(fā)酵樣品作為研究材料。圖1

圖1 棉稈固體發(fā)酵過程中堆體溫度變化

2.2 固體發(fā)酵不同階段棉稈木質(zhì)素、纖維素及半纖維素含量測定

研究表明,整個固體發(fā)酵過程中棉稈失重明顯,尤其是進入熟化期后,棉稈失重率顯著提高(P<0.05)。發(fā)酵之前棉稈木質(zhì)素、半纖維素和半纖維素含量分別為31.51%、29.32%和15.17%,升溫期時其含量幾乎沒有改變,高溫期才逐漸開始減少,此時木質(zhì)素、半纖維素和半纖維素含量分別下降至28.36%、11.48%和30.60%。在發(fā)酵結束后木質(zhì)素含量下降至25.38%,但在整個發(fā)酵過程中含量總體變化較小;纖維素和半纖維素含量變化顯著(P<0.05),分別下降至18.18%和7.75%。表1

表1 固體發(fā)酵棉稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量

木質(zhì)素降解速率在高溫期過后顯著升高,在熟化期持續(xù)升高,直到發(fā)酵結束時達到最大13.84 g/d。半纖維素和纖維素降解速率分別在升溫期和高溫期達到最高,為26和23.95 g/d。圖2

注：IS:初始;WP:升溫期:HP:高溫期;MP:熟化期;FS:末期,下同

2.3 固體發(fā)酵不同階段木質(zhì)素降解酶活性測定

研究表明,發(fā)酵初期堆體溫度逐漸升高,MnP活性在發(fā)酵第3 d上升至4.24 U/g;進入高溫期后酶活下降至3.45 U/g,隨著堆體溫度下降,MnP活性逐步上升;進入熟化期后,MnP活性持續(xù)上升,在發(fā)酵結束時酶活達到最高,為12.91 U/g。圖3

圖3 棉稈發(fā)酵過程中錳過氧化物酶活性變化

LiP活性在發(fā)酵過程中呈先升后降再上升的趨勢,與MnP活性變化趨勢一致。LiP活性在發(fā)酵第3 d由初始的3.81 U/g上升至22.14 U/g,進入高溫期后酶活下降至14.65 U/g;隨著堆體溫度下降,LiP活性逐步上升;進入熟化期,LiP活性持續(xù)上升,在發(fā)酵結束時酶活達到最高,為55.28 U/g。圖4

圖4 棉稈發(fā)酵過程中木質(zhì)素過氧化物酶活性變化

在發(fā)酵初期未檢測到Lac活性,直至高溫期才出現(xiàn)Lac活性,此時Lac活性為0.02 U/g;隨后Lac活性持續(xù)上升,在發(fā)酵結束時酶活達到最高,為0.19 U/g。圖5

圖5 棉稈發(fā)酵過程中漆酶活性變化

2.4 固體發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解酶活性與木質(zhì)素降解相關性

研究表明,LiP、MnP、Lac活性與木質(zhì)素降解速率呈極顯著正相關(P<0.01),隨著這幾種酶活性升高,堆體中木質(zhì)素降解速率不斷加快,木質(zhì)素降解酶對木質(zhì)素的降解影響極大。3種木質(zhì)素降解酶活性與纖維素降解速率也呈顯著相關(P<0.01),與半纖維素降解速率相關性不顯著,木質(zhì)素降解酶活性對纖維素的降解影響較大,對半纖維素的降解影響較小。圖6

注：A錳過氧化物酶;B木質(zhì)素過氧化物酶;C漆酶

發(fā)酵過程中3種木質(zhì)素降解酶活性之間也存在著一定的相關性。在LiP、MnP、Lac中,兩兩之間均呈極顯著正相關(P<0.01),在發(fā)酵過程中3種木質(zhì)素降解酶呈現(xiàn)相互促進作用。但LiP、MnP、Lac活性與溫度波動相關性差異不顯著,3種酶活性的變化與溫度有關,但受溫度的影響較小。 表2

表2 木質(zhì)素降解酶活性變化與木質(zhì)素降解相關性

2.5 棉稈固體發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解的主成分

研究表明,前2個主成分所包含的信息量分別為62.591%、22.800%,累積占總信息量的85.391%,可以代表所有被測變量的絕大多數(shù)信息,主成分1和主成分2對棉稈固體發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解的影響最大,提取這2種主成分進一步做負荷矩陣分析。

主成分1反映了與固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解酶相關的指標,其中MnP的因子載荷為0.957、LiP的因子載荷為0.931和Lac的因子載荷為0.909,3種木質(zhì)素降解酶活性對主成分1的影響最大。隨著酶活性的增加,固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解速率升高,木質(zhì)素含量逐漸減少。主成分2反映了與固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解程度有關的指標,其中半纖維素降解速率的因子載荷為0.918、溫度的因子載荷為0.898、纖維素降解速率的因子載荷為0.690,木質(zhì)素降解程度與發(fā)酵溫度、纖維素和半纖維素降解速率密切相關。由于主成分1對固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解的方差貢獻率顯著高于其他主成分,而MnP活性在主成分1中因子載荷最高,MnP活性是影響棉稈固體發(fā)酵過程中木質(zhì)素降解的最主要因子。表3～4,圖7

表3 總方差的解釋

表4 主成分因子負荷矩陣

圖7 主成分分析碎石圖

3 討 論

3.1 棉稈固體發(fā)酵中木質(zhì)素的降解

溫度作為有機基質(zhì)腐熟的重要參數(shù),影響著秸稈腐熟過程中微生物的代謝活動強弱[26]。作為典型的秸稈固體發(fā)酵過程,研究中棉稈固體發(fā)酵過程也可根據(jù)溫度分為3個階段:升溫期,高溫期,熟化期[27]。在升溫期時,簡單有機物如單糖、蛋白質(zhì)和淀粉等首先被微生物分解,所產(chǎn)生的熱量使堆體溫度升高[28];隨后進入高溫期,在此期間堆溫升高到50℃以上,耐熱微生物占主導地位,可將纖維素、半纖維素和果膠分解為微生物容易利用的碳水化合物[29]。與纖維素和半纖維素不同,木質(zhì)素作為難降解的成分,其含量的變化主要發(fā)生在溫度低于50℃的發(fā)酵后期[30-32],即熟化期。在此階段木質(zhì)素開始被中溫微生物降解,還有許多耐高溫的微生物,如芽孢桿菌等在堆體溫度開始下降時就能降解木質(zhì)素,木質(zhì)素主要在高溫階段后期和熟化期時被降解,期間沒有出現(xiàn)明顯的降解減緩過程[33]。研究顯示,木質(zhì)素降解速率在高溫期后顯著提升,發(fā)酵結束時達到最高,為13.84 g/d,經(jīng)過固體發(fā)酵棉稈中木質(zhì)素含量下降6.13%,纖維素和半纖維素含量分別下降11.13%和7.42%,與前人研究的水稻秸稈和玉米秸稈腐解規(guī)律相似[34]。

3.2 棉稈固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解酶的活性變化

木質(zhì)素、纖維素和半纖維素降解酶活性的動態(tài)變化是秸稈發(fā)酵的過程中重要的生物學指標[35]。研究中LiP和MnP活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢,在發(fā)酵初期溫度上升,微生物代謝活力和代謝水平開始逐漸升高,此時微生物主要利用含量有限的、易降解的有機物進行生長繁殖,無法產(chǎn)生大量酶類[36]。進入高溫期后,由于有機質(zhì)降解酶活性與微生物代謝密切相關,高溫期微生物數(shù)量減少,酶活性下降。與纖維素和半纖維素相比,木質(zhì)素更難被微生物分解利用,進入熟化期后,堆體溫度下降,嗜溫微生物重新活躍起來,此時開始分解轉化堆料中殘余的難降解有機物,木質(zhì)素降解酶活性顯著升高[37]。在含有松樹皮和麥稈的堆肥中,LiP活性在較長堆肥時間后才會顯著升高[38],而在木材堆肥過程中,也檢測出LiP活性在發(fā)酵后期升高[39]。不同于LiP和MnP的活性變化,Lac活性在發(fā)酵初期很低,在發(fā)酵進入高溫期后才表現(xiàn)明顯,這可能與過氧化物酶作用下木質(zhì)素降解產(chǎn)物誘導其生物合成有關[40]。研究表明,在整個發(fā)酵過程中,MnP、LiP、Lac活性均隨著發(fā)酵時間的延長逐步上升,在熟化期酶活明顯提高,在發(fā)酵結束時木質(zhì)素降解酶活性達到最高。3種木質(zhì)素降解酶中LiP的活性最高,由于LiP的底物主要是芳香環(huán)化合物,棉稈固體發(fā)酵過程中易降解的木質(zhì)素可能以芳香環(huán)化合物為主。

3.3 棉稈固體發(fā)酵中木質(zhì)素降解及酶活性變化的關聯(lián)分析

秸稈發(fā)酵中木質(zhì)素降解主要依靠木質(zhì)素降解酶,它能夠使木質(zhì)素結構單體間之間的C-O鍵或C-C鍵斷裂,并對側鏈進行一定的修飾,使木質(zhì)素最終分解為低分子物質(zhì)[41]。Lac、MnP、LiP都是直接作用于木質(zhì)素的酶,在木質(zhì)素降解過程中發(fā)揮著關鍵作用[42]。其他類型的酶也對木質(zhì)素的降解具有協(xié)同作用,例如葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的同時為LiP提供過氧化氫,誘導木質(zhì)素降解,而在LiP作用下的木質(zhì)素降解產(chǎn)物能夠誘導Lac的生物合成[43]。碳源濃度的降低能夠誘導菌株產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶[44],Lac和LiP活性也會隨著秸稈腐熟過程中碳氮比的降低而增加[45]。研究的木質(zhì)素降解及酶活性變化的關聯(lián)分析可以看出,木質(zhì)素降解趨勢與固體發(fā)酵不同時期的降解酶活性的變化趨勢基本相同,3種木質(zhì)素降解酶活性之間顯著性相關,3種木質(zhì)素降解酶在發(fā)酵過程中相互協(xié)同降解木質(zhì)素。而溫度和MnP、LiP、Lac活性沒有顯著的相關性,可能是因為木質(zhì)素降解酶活性受其他因子的影響程度更大。MnP活性對棉稈固體發(fā)酵的木質(zhì)素降解的影響最大?？梢酝ㄟ^固體發(fā)酵的過程控制,例如添加MnP的生產(chǎn)菌株,有針對性的提高發(fā)酵后期MnP的活性,以提高棉稈木質(zhì)素的降解速率,促進棉稈固體發(fā)酵轉化的效率。

4 結 論

在棉稈固體發(fā)酵過程中,棉稈木質(zhì)素含量由31.51%顯著降低至25.38%(P<0.05),其含量的變化主要發(fā)生在熟化期。木質(zhì)素降解速率也在高溫期后顯著升高,熟化期持續(xù)升高直至發(fā)酵結束時達到最高13.84 g/d。在整個發(fā)酵過程中,MnP、LiP、Lac活性均隨著發(fā)酵時間的延長逐步上升,在熟化期酶活明顯提高,發(fā)酵結束時活性達到最高,分別為12.91、55.28和0.19 U/g。3種木質(zhì)素降解酶活性均與木質(zhì)素降解速率呈顯著正相關(P<0.01),木質(zhì)素降解酶活性的升高有利于木質(zhì)素的降解。3種木質(zhì)素降解酶活性之間也呈顯著正相關(P<0.01),在發(fā)酵過程中相互協(xié)同降解木質(zhì)素,其中MnP占據(jù)主要的地位。