玉米ZmCDPK22基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

邵盤(pán)霞,趙 準(zhǔn),邵武奎,郝曉燕,高升旗,李建平,胡文冉,黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】在植物生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遇到干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫,嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。干旱是制約作物生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一,利用分子生物學(xué)方法和手段探索作物的耐旱機(jī)制,改善作物本身的抗旱能力,對(duì)作物抗旱品種的培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】應(yīng)對(duì)逆境,植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)調(diào)節(jié)生理生化代謝途徑,激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因表達(dá)等來(lái)抵御脅迫,提高逆境脅迫的耐受性[1, 2]。Ca2+在介導(dǎo)生物和非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用,細(xì)胞中的鈣信號(hào)通過(guò)鈣敏感蛋白,如鈣調(diào)蛋白,鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(Calcinerium-B Like,CBL)和鈣依賴(lài)蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)等調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),從而應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫[3, 4]。CDPK作為鈣結(jié)合蛋白之一,其家族的許多成員在植物抵抗干旱脅迫的調(diào)控反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。前人研究報(bào)道CDPK基因具有提高作物抗旱性的作用。擬南芥CDPK相關(guān)基因通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔參與干旱脅迫響應(yīng),過(guò)表達(dá)AtCPK4、AtCPK8、AtCPK10和AtCPK11可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性[5-7]。OsCDPK4在水稻的耐鹽性和干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用,過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)水稻對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性[8];OsCDPK9通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉和滲透調(diào)劑提高水稻干旱脅迫的耐受性[9]。ZoCDPK1在參與生姜響應(yīng)干旱脅迫的信號(hào)通路中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用,在煙草中過(guò)表達(dá)該基因,提高了煙草對(duì)干旱脅迫的耐受性[10]。玉米是我國(guó)重要的作物之一,是重要的飼料和工業(yè)原料,其產(chǎn)量和品質(zhì)受干旱脅迫的制約。在玉米中,已發(fā)現(xiàn)了40個(gè)CDPKs基因[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ZmCDPK1參與玉米低溫脅迫響應(yīng),在低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中期負(fù)調(diào)節(jié)作用[12];ZmCPK11由機(jī)械損傷誘導(dǎo)表達(dá),在酶促反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄水平受亞麻酸和茉莉酸甲酯調(diào)節(jié)[13];雖然已經(jīng)克隆了ZmCDPK、ZmCDPK17、ZmCDPK22、ZmCDPK28和ZmCDPK34等基因,但是在植物中的功能尚未研究[12]。因此探索ZmCDPK22是否響應(yīng)干旱、鹽堿等非生物脅迫及它們發(fā)揮的作用很有必要?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以ZmCDPK22作為研究對(duì)象,從生物信息學(xué)和干旱脅迫表達(dá)兩方面對(duì)該基因的功能進(jìn)行判斷,為研究該基因的功能提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以玉米自交系B73(實(shí)驗(yàn)室保存及繁種)為材料,以葉片含水量模擬干旱脅迫條件,在玉米四葉時(shí)期測(cè)定玉米含水量,采用烘干稱(chēng)重法對(duì)相應(yīng)葉片測(cè)定葉片含水量。用精度為0.001 g的天平對(duì)鮮葉稱(chēng)重,稱(chēng)重后將葉片放入105℃恒溫箱殺青15 min,于80℃下烘干至恒重后稱(chēng)其干重,計(jì)算各葉片含水量,葉片含水量=(鮮重-干重)/鮮×100%。

1.2 方 法

1.2.1ZmCDPK1生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPASy的工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì);應(yīng)用在線工具DeepTMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php/DeepTMHMM)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu);SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/)用于預(yù)測(cè)ZmCDPK22二級(jí)結(jié)構(gòu);應(yīng)用SWISS-MODEL((https://swissmodel.expasy.org/))預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu);Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)用于預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位;SignalP3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于分析信號(hào)肽;通過(guò)NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)分析該基因的保守結(jié)構(gòu)域;MEME(http://meme-suite.org/)預(yù)測(cè)保守基序;使用STRING(https://string-db.org/)在玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行ZmCDPK22互作蛋白預(yù)測(cè);應(yīng)用MEGA-X進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù);通過(guò)NCBI網(wǎng)站下載ZmCDPK22基因起始密碼子上游2 000 bp序列在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析。

1.2.2ZmCDPK22表達(dá)模式

按照植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取玉米葉片RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。根據(jù)ZmCDPK22基因的CDS(coding sequence)序列設(shè)計(jì)引物(ZmCDPK22-qF:AGGTCATATTGACTTCGCATCT;ZmCDPK22-qR:GCAACCTTCTTAAGCTTGTTCA)。以ZmUBI(ZmUBI-qF:TGGTTGTGGCTTCGTTGGTT;ZmUBI-qR:GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA)作為內(nèi)參基因,使用BIO-RAD CFX96 Real-Time System qPCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增。應(yīng)用2-ΔΔCT方法分析ZmCDPK22基因的干旱脅迫表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCDPK22基因序列及蛋白理化性質(zhì)分析

研究表明,ZmCDPK22基因全長(zhǎng)為2 216 bp僅含有一個(gè)外顯子,CDS序列長(zhǎng)1 620 bp,編碼539個(gè)氨基酸。ZmCDPK22分子式為C2675H4217N779O798S21,分子量為60 731.91,等電點(diǎn)為6.44;該蛋白中丙氨酸(Ala,A)、谷氨酸(Glu,E)和精氨酸(Arg,R)的含量較高,分別為45個(gè)(8.3%)、43個(gè)(8.0%)和41個(gè)(7.6%),不含吡咯賴(lài)氨酸(Pyl,O)和硒代半胱氨酸(Sec,U);親水性系數(shù)為-0.602,不穩(wěn)定性指數(shù)為50.15,說(shuō)明該蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白由ɑ-螺旋(41.93%)、無(wú)規(guī)則卷曲(39.89%)、延伸鏈(9.28%)和β-折疊(8.91%)組成(圖1A);蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示與該蛋白同源基因三級(jí)結(jié)構(gòu)最高相似度為37.53%。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核,無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。圖1

圖1 ZmCDPK22蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)與三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)

2.2 ZmCDPK22蛋白結(jié)構(gòu)域和基序預(yù)測(cè)

研究表明,ZmCDPK22含STK_CAMK結(jié)構(gòu)域,屬于PK_like亞家族。有18種保守基序,分別為Motif1～Motif18;ZmCDPK22、ZmCDPK15和DoCDPK3不含Motif18基序且先后順序都相同。圖2,圖3

圖2 ZmCDPK22的蛋白結(jié)構(gòu)域

圖3 ZmCDPK22的保守基序

2.3 蛋白互作預(yù)測(cè)

研究表明,ZmCDPK22與10個(gè)蛋白互作,與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(GRMZM2G148539_P02)的互作最強(qiáng),互作系數(shù)為0.618;與呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白相關(guān)基因(RbohC和rboh2)互作較弱,互作系數(shù)為0.600。圖4

圖4 ZmCDPK22蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型

2.4 進(jìn)化樹(shù)與啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件

研究表明,ZmCDPK22與ZmCDPK15的蛋白序列相似度最高,為98.89%,與擬南芥AtCDP17和棉花GhCDPK34的蛋白序列相似度比較低,分別為69.25%和64.62%。利用MEAG-X的鄰接法構(gòu)建玉米、擬南芥、棉花、小麥和水稻等植物相關(guān)CDPK基因的進(jìn)化樹(shù),ZmCDPK22與玉米ZmCDPK15和高粱SbCDPK1的親緣關(guān)系最近,與擬南芥AtCDPK17和棉花GhCDPK34的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。圖5

圖5 ZmCDPK22系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

ZmCDPK22基因啟動(dòng)子區(qū)含有31種順式作用元件,除含有TATA-box和CAAT-box等核心啟動(dòng)元件之外,還含有激素相關(guān)響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、低溫響應(yīng)元件及分生組織表達(dá)等相關(guān)元件。在激素響應(yīng)相關(guān)元件中,茉莉酸甲酯響應(yīng)元件共有6個(gè),脫落酸響應(yīng)元件有2個(gè)。表1

表1 ZmCDPK22啟動(dòng)子順式作用元件

2.5 ZmCDPK22對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

研究表明,葉片含水量為87%時(shí)ZmCDPK22的表達(dá)量記為1,在不同含水量情況下,ZmCDPK22的表達(dá)量不同。與葉片含水量87%相比,ZmCDPK22的相對(duì)表達(dá)量隨著葉片含水量的降低而逐漸降低,在葉片含水量為78%時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高,在含水量為33%時(shí)相對(duì)表達(dá)量最低。圖6

圖6 ZmCDPK22在葉片不同含水量的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

研究對(duì)ZmCDPK22的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析表明,該基因包含2個(gè)關(guān)鍵的啟動(dòng)子元件,將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與RNA聚合酶連接的TATA-box和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box,ZmCDPK22可以正常轉(zhuǎn)錄。在對(duì)擬南芥和蒺藜苜蓿相關(guān)CDPKs基因的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的研究中發(fā)現(xiàn)一些AtCPKs和MtCDPKs參與植物激素和非生物脅迫信號(hào)的調(diào)節(jié)[14-17]。ZmCDPK22啟動(dòng)子區(qū)還含有多種激素及逆境響應(yīng)元件,推測(cè)該基因可能在多種逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

ZmCDPK22可能參與對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng),尤其是對(duì)病原體的防御和干旱脅迫,研究中通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)ZmCDPK22與RBOH有關(guān)。RBOHs是植物體內(nèi)活性氧生成的主要途徑,在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[18]。在葡萄中,鹽和干旱脅迫處理顯著增強(qiáng)了VvRBOHA、VvRBOHB和VvRBOHC1的表達(dá),外源ABA處理顯著上調(diào)VvRBOHB的表達(dá)[19]。油菜RbohA、RbohD基因在響應(yīng)低溫、鹽、PEG-6000模擬干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用[20]。研究中ZmCDPK22與多個(gè)Rboh蛋白互作,猜測(cè)其可能與Rboh基因有相似或相同的功能。

研究發(fā)現(xiàn)CDPK參與植物非生物脅迫反應(yīng),干旱[21]、鹽[22]、光[23]等多種環(huán)境因子以及生長(zhǎng)素[24]等都能引起CDPK基因的特異性表達(dá)。ZmCDPK9是CDPKs基因家族中一個(gè)新的成員并對(duì)干旱脅迫具有一定的應(yīng)答反應(yīng)[25]。ZmCDPK38基因響應(yīng)干旱脅迫與鹽脅迫,可能在干旱應(yīng)答與鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能[26]。葉片含水量能直接反映作物生長(zhǎng)發(fā)育的實(shí)際狀況,是機(jī)理研究中反映作物水分盈虧程度的最佳指標(biāo),是作物耐旱能力綜合作用的體現(xiàn)和監(jiān)測(cè)作物受脅迫的重要參考[27, 28]。研究測(cè)定了ZmCDPK22基因在不同含水量葉片中的相對(duì)表達(dá)量,在含水量為78%時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高,在含水量為33%時(shí)相對(duì)表達(dá)量最低,ZmCDPK22對(duì)干旱脅迫有一定響應(yīng)。

4 結(jié) 論

從玉米中克隆得到ZmCDPK22基因,該基因編碼539個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為60 731.91,等電點(diǎn)為6.44,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)以及信號(hào)肽,該蛋白定位于細(xì)胞核;ZmCDPK22與10個(gè)蛋白存在互作,屬于PK_like亞家族。其啟動(dòng)區(qū)含有大量的光響應(yīng)和多種激素響應(yīng)等元件。在不同含水量情況下,ZmCDPK22的表達(dá)量不同。與葉片含水量87%相比,ZmCDPK22的相對(duì)表達(dá)量隨著葉片含水量的降低而逐漸降低,該基因?qū)Ω珊得{迫具有一定響應(yīng)。