響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌P9菌株生孢培養(yǎng)基及條件的研究

馬 爍 劉 瑾 趙 華

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，菌體呈桿狀，可產(chǎn)孢子，是廣泛存在于環(huán)境中的多功能細(xì)菌[1-3]。貝萊斯芽孢桿菌具有來(lái)源廣、易篩選、培養(yǎng)周期短、抗逆性強(qiáng)、能形成芽孢、耐酸、耐堿、耐高溫、產(chǎn)酶豐富等優(yōu)勢(shì)[4-6]。目前，關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在病害防控、抑菌活性物質(zhì)、動(dòng)物病原菌拮抗作用機(jī)制等方面，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域[7-10]。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可分泌豐富的木質(zhì)纖維素降解酶，對(duì)纖維素酶的飼料化應(yīng)用具有重要意義[11]。貝萊斯芽孢桿菌作為一種益生菌，可代替抗生素在水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖中發(fā)揮積極作用[12-13]。本試驗(yàn)采用單因素分析及響應(yīng)面分析方法，確定貝萊斯芽孢桿菌P9最適生孢培養(yǎng)基，對(duì)菌株的生孢培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以提高產(chǎn)酶量以及酶活性，為其在動(dòng)物飼料生產(chǎn)中應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）由天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組內(nèi)提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 值為7.0。固體時(shí)添加瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

DSM培養(yǎng)基[14]：葡萄糖10.0 g/L、L-谷氨酸1.0 g/L、酵母浸粉0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、(NH4)3PO41.0 g/L、MgSO40.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、CaCl20.05 g/L、MnCl20.007 g/L、ZnSO40.01 g/L、FeSO40.01 g/L，pH值為7.0。

SBM 培養(yǎng)基[15]：葡萄糖1.04 g/L、KH2PO46.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.59 g/L、蛋白胨5.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、0.1 mol/L 的 FeSO4·7H2O 1.136 mL、 0.1 mol/L 的ZnSO4·7H2O 300 μL、 0.1 mol/L 的 CaCl29.9 mL、0.1 mol/L的MnCl230 mL，pH值為7.0。

改良NA 培養(yǎng)基[16]：MgSO4·7H2O 0.51 g/L、KCl 0.97 g/L、 CaCl20.2 g/L、 MnSO4·7H2O 3×10-3g/L、FeSO4·7H2O 0.55×10-3g/L，pH值為7.0。

合成生孢培養(yǎng)基[17]： FeCl20.003 6 mmol/L、MgCl20.041 mmol/L、MnCl20.1 mmol/L、NH4Cl 10 mmol/L、NaSO40.75 mmol/L、CaCl21 mmol/L、KH2PO40.5 mmol/L、NH4NO31.2 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、L-谷氨酸10 mmol/L，pH值為7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芽孢率測(cè)定

1.3.1.1 營(yíng)養(yǎng)體的收集

防止菌體生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)結(jié)塊，在搖瓶中加入3～4 顆滅菌的玻璃珠。將3%菌種接種于100 mL 或250 mL LB 培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。所得沉淀用無(wú)菌生理鹽水重懸，混勻，8 000 r/min離心10 min，水洗，重復(fù)上述水洗步驟2次，再次離心得到水洗后的菌體。

1.3.1.2 生孢率計(jì)算

采用無(wú)菌生理鹽水稀釋涂布的方法測(cè)定培養(yǎng)基中的菌體數(shù)。稀釋度為10-6、10-7、10-8菌液涂布于LB固體平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，記錄單菌落數(shù)量，得到的單菌落數(shù)為該稀釋度下的菌體總數(shù)。將所得的培養(yǎng)液于80 ℃條件下水浴20 min，采用無(wú)菌生理鹽水稀釋涂布的方法測(cè)定芽孢數(shù)[18]，稀釋度為10-6、10-7、10-8的菌液涂布于LB 平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，記錄單菌落的數(shù)量，所得的單菌落數(shù)量即為孢子數(shù)。

1.3.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基確定

按照1.3.1所述方法收集4×100 mL培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體用4 mL 生理鹽水重懸、混勻，分別吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接于DSM 培養(yǎng)基、改良NA 生孢培養(yǎng)基、合成生孢培養(yǎng)基、SBM 培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定培養(yǎng)48 h 后各培養(yǎng)基菌體數(shù)與孢子數(shù)，計(jì)算生孢率，確定最適的基礎(chǔ)生孢培養(yǎng)基。

1.3.3 碳源對(duì)菌體生孢率的影響

1.3.3.1 碳源種類對(duì)生孢率的影響

可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖作為唯一的碳源進(jìn)行芽孢率的測(cè)定。收集各碳源培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體使用5 mL生理鹽水重懸、混勻，分別移取1 mL 菌懸液至100 mL 或250 mL 的不同種類的碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定不同培養(yǎng)基中的菌體數(shù)與孢子數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.3.2 碳源含量對(duì)生孢率的影響

碳源含量設(shè)為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，收集5×100 mL 或5×250 mL 培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別移取1 mL菌液至100 mL或250 mL不同含碳量培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定培養(yǎng)基中的菌體數(shù)和孢子數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.4 氮源對(duì)菌體生孢率的影響

1.3.4.1 氮源種類對(duì)生孢率的影響

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨作為唯一氮源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源制備氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基。收集各氮源培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體用6 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別移取1 mL 菌懸液至100 mL 或250 mL 的不同氮源種類的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定各培養(yǎng)基中的菌體數(shù)和芽孢數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.4.2 不同氮源配比對(duì)生孢率的影響（見表1）

表1 不同氮源配比對(duì)生孢率的影響 單位：%

在已知上述確定條件下，分別挑選作為唯一氮源條件下生孢率最高的兩種氮源，根據(jù)氮源種類的優(yōu)化結(jié)果選擇最優(yōu)和次優(yōu)氮源，并按表1 調(diào)整兩種氮源的配比，酵母浸粉并且以單一的兩種氮源為對(duì)照，制備不同氮源配比的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，收集氮源培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別吸取1 mL 菌懸液添加到100 mL 或250 mL 的不同氮源配比的培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定此時(shí)的菌體數(shù)和芽孢數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.4.3 氮源含量對(duì)生孢率的影響

分別調(diào)整培養(yǎng)基中氮源的含量為0、4%、8%、12%、16%制備不同含氮量的培養(yǎng)基，收集氮源培養(yǎng)液內(nèi)的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別吸取1 mL 菌懸液添加至100 mL/250 mL 的不同含氮量培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h，測(cè)定不同培養(yǎng)基中的菌體數(shù)和芽孢數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.5 金屬離子對(duì)生孢率的影響

1.3.5.1 Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+對(duì)菌體生孢率的影響

分別添加1 mol/L 的CaCl2、MnCl2、FeCl2、ZnCl22、4、6、8 mL，以不添加CaCl2、MnCl2、FeCl2、ZnCl2的培養(yǎng)基為對(duì)照。30 ℃、160 r/mi搖瓶培養(yǎng)48 h，記錄菌體數(shù)和芽孢數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.5.2 Mg2+對(duì)菌體生孢率的影響

分別添加0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的MgCl2，以不添加MgCl2的培養(yǎng)基為對(duì)照，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h后記錄菌體數(shù)和芽孢數(shù)，計(jì)算生孢率。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表2）

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以菌體生孢率為響應(yīng)值（Y），選取3 個(gè)影響最大的因素葡萄糖（X1）、復(fù)合氮源（X2）和Mg2+（X3），利用Design Expert 10.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定培養(yǎng)基成分最佳組合和最優(yōu)值。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)（見表3）

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0軟件，葡萄糖（X1）、復(fù)合氮源（X2）和Mg2+（X3）對(duì)菌體生孢率（Y）的影響進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法研究各個(gè)因素對(duì)菌體生孢率的影響，進(jìn)一步確定培養(yǎng)基成分的最佳組合和最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)Bacillus velezensis P9 產(chǎn)孢量的影響（見圖1）

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖1 可知，Bacillus velezensisP9 在DSM 培養(yǎng)基和SBM培養(yǎng)基生孢率最高，而其中通過(guò)使用SBM培養(yǎng)基進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí)，菌體濃度可達(dá)到162×109/mL。因此選用SBM培養(yǎng)基作為生孢培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 生孢培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖2）

圖2 碳源對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖2 可知，使用葡萄糖作為碳源時(shí)，菌體的生孢率最高，可達(dá)到77.056%，而使用麥芽糖作為碳源時(shí)，生孢率最低，只有58.132%，但此時(shí)菌體濃度較高，可能是由于麥芽糖對(duì)菌株的生長(zhǎng)發(fā)育有很大影響，但并不適合用來(lái)做生孢培養(yǎng)基的碳源。因此本試驗(yàn)采用葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源。

2.2.2 葡萄糖對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖3）

圖3 葡萄糖含量對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖3 可知，當(dāng)葡萄糖含量低于0.2%時(shí)，生孢率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，最大值為78.1%，原因是少量的葡萄糖為菌體生孢提供了能量，使更多的菌體轉(zhuǎn)化為芽孢。隨著葡萄糖含量的增加，菌體濃度變化不大，生孢率下降，可能是因?yàn)檫^(guò)多的葡萄糖為菌體生命活動(dòng)提供了能力，使菌體并未轉(zhuǎn)化成芽孢[19]。因此，生孢培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量為0.2%。

2.3 氮源對(duì)菌體生孢率的影響

2.3.1 氮源對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖4）

圖4 氮源對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖4 可知，使用酵母浸粉或牛肉膏作為培養(yǎng)基氮源，生孢率較高，使用酵母浸粉時(shí)生孢率最高，使用牛肉膏時(shí)菌體濃度較大。使用硫酸銨作為培養(yǎng)基氮源時(shí)，生孢率和菌體數(shù)較低，因此，可采用酵母浸粉與牛肉膏進(jìn)行復(fù)配制備復(fù)合氮源進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基的氮源進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2 氮源配比對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖5）

圖5 氮源配比對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖5 可知，菌體濃度隨著牛肉膏濃度的降低而降低。當(dāng)牛肉膏∶酵母浸粉=1∶1 時(shí)生孢率最大，為79.7%，綜合考慮菌體濃度和生孢率，選用牛肉膏∶酵母浸粉=1∶1作為生孢培養(yǎng)基的氮源。

2.3.3 氮源含量對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖6）

圖6 氮源含量對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

按照1∶1 的配比分別添加0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的牛肉膏和酵母浸粉作為生孢培養(yǎng)基的氮源。由圖6 可知，隨著氮源含量增加，菌體濃度具有一定的增加趨勢(shì)，最后趨于平穩(wěn)，但是生孢率會(huì)隨著氮源含量的增加先增后減。這可能是氮源濃度過(guò)大時(shí)，并不能刺激菌體產(chǎn)生芽孢所需要的酶，反而為菌體的其他生命活動(dòng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)?shù)春枯^少時(shí)，不能為菌體轉(zhuǎn)化為孢子的過(guò)程提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而且影響了菌體的其他活動(dòng)，因此，牛肉膏∶酵母浸粉比例為1∶1，含量為0.8%作為生孢培養(yǎng)基的氮源[20]。

2.4 金屬離子對(duì)菌體生孢率的影響

2.4.1 Ca2+對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖7）

圖7 Ca2+對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖7可知，隨著Ca2+水平增加，菌體濃度和生孢率均有所增加，當(dāng)Ca2+水平增加到6×10-3mol/L時(shí)生孢率達(dá)到最大，為93.21%，繼續(xù)增加Ca2+濃度，生孢率開始下降。因此，添加6 mL 1 mol/L CaCl2溶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.2 Mn2+Bacillus velezensisP9產(chǎn)孢量的影響（見圖8）

圖8 Mn2+對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖8 可知，隨著Mn2+水平的增加，菌體的生孢率也增加，當(dāng)Mn2+水平增加至8×10-3mol/L 時(shí)生孢率達(dá)到最大，為91.53%。因此，本試驗(yàn)添加8 mL 1 mol/L 的MnCl2溶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.3 Fe2+對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖9）

圖9 Fe2+對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖9可知，不添加Fe2+進(jìn)行生孢培養(yǎng)時(shí)，生孢率和菌體濃度均最大，其中生孢率為93.25%，菌體濃度為1.88×109/mL，隨著Fe2+水平增加，培養(yǎng)液中的菌體濃度和生孢率持續(xù)下降，表明Fe2+可能并不能起到促進(jìn)菌體生孢的作用。因此后續(xù)試驗(yàn)不添加Fe2+。

2.4.4 Zn2+對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖10）

圖10 Zn2+對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖10 可知，不添加Zn2+進(jìn)行菌體的生孢培養(yǎng)時(shí)，Bacillus velezensisP9 生孢率最大，為91.15%。隨著Zn2+濃度增加，菌體生孢率持續(xù)下降，而菌體濃度無(wú)明顯變化，可能是Zn2+對(duì)菌體生孢并無(wú)有益影響。因此，后續(xù)不添加Zn2+進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.5 Mg2+對(duì)Bacillus velezensisP9 產(chǎn)孢量的影響（見圖11）

圖11 Mg2+對(duì)Bacillus velezensis P9產(chǎn)孢量的影響

由圖11可知，當(dāng)MgCl2質(zhì)量濃度小于8 g/L時(shí)，隨著Mg2+水平增加，菌體的生孢率增加，當(dāng)MgCl2質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/L時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)的生孢率為94.65%，繼續(xù)增加Mg2+水平，生孢率開始下降，可能是過(guò)量的Mg2+會(huì)對(duì)菌體生芽孢產(chǎn)生抑制作用。因此，本試驗(yàn)添加MgCl2的質(zhì)量濃度為8 g/L。

2.5 爬坡試驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖濃度為2g/L，復(fù)合氮源濃度為8 g/L，Mg2+濃度為8 g/L時(shí)，生孢效果達(dá)到最優(yōu)。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析結(jié)果（見表4、表5）

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

通過(guò)Design Expert 10.0軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，得到擬合試驗(yàn)因素的回歸方程：

Y=95.07+0.87X1-0.41X2-0.58X3-0.43X1X2+0.24X1X3+0.34X2X3-2.12X12-2.20X22-0.67X32。

通過(guò)Design Expert 10.0 軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表5可知，該模型P值為0.000 4＜0.01，具有極顯著影響，失擬項(xiàng)P值為0.158 3＞0.05，不顯著，表明該模型和試驗(yàn)擬合度較好。模型的決定系數(shù)R2為0.962 2，校正后的決定系數(shù)R2為0.915 3，變異系數(shù)（C.V.）為0.61%，表示該模型有0.61%的變異不能由該模型解釋，說(shuō)明試驗(yàn)操作和模型可信。

2.7 各因素交互作用對(duì)生孢率的影響（見圖12）

圖12 各因素交互作用對(duì)生孢率的影響

由圖12（a）可知，當(dāng)Mg2+的質(zhì)量濃度為8.0 g/L時(shí)，葡萄糖和復(fù)合氮源質(zhì)量濃度分別為1.75～2.25 g/L和7.75～8.25 g/L。

由圖12（b）可知，當(dāng)復(fù)合氮源質(zhì)量濃度為8.0 g/L時(shí)，葡萄糖和Mg2+質(zhì)量濃度范圍分別為1.75～2.50 g/L 和7.0～8.25 g/L。

由圖12（c）可知，當(dāng)葡萄糖濃度為8.0 g/L時(shí)，復(fù)合氮源和Mg2+質(zhì)量濃度范圍分別為7.75～8.25 g/L 和7.0～8.25 g/L。

通過(guò)Design-Expert 10.0 分析，發(fā)現(xiàn)葡萄糖質(zhì)量濃度為2.124 g/L，復(fù)合氮源質(zhì)量濃度為8.272 g/L 和Mg2+質(zhì)量濃度為8.272 g/L時(shí)，生孢率最大為94.65%，與以上分析一致。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證Design-Expert 10.0軟件所預(yù)測(cè)的最佳試驗(yàn)條件，考慮現(xiàn)實(shí)操作條件，調(diào)整發(fā)酵條件為葡萄糖2.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L，MgCl28.0 g/L、KH2PO46.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、1 mol/L 的CaCl26 mL、1 mol/L 的MnCl26 mL。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到發(fā)酵液生孢率為95.37%，比預(yù)測(cè)值94.65%高約0.73%，此差值在可接受范圍內(nèi)。在未優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，生孢率為64.53%[21]。本試驗(yàn)比未優(yōu)化培養(yǎng)基生孢率增加了30.84%。

3 結(jié)論

對(duì)Bacillus velezensisP9進(jìn)行生孢培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定最佳的生孢培養(yǎng)基成分為葡萄糖2.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、MgCl28.0 g/L、KH2PO46.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、1 mol/L的CaCl26 mL、1 mol/L的MnCl26 mL，此時(shí)芽孢率為95.37%。