三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響及機理研究

胡少男，趙 博，李鵬躍，馮舒婭，武慧蓉，杜守穎*

（1.內蒙古醫(yī)科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029）

華法林是臨床一線口服抗凝藥物，廣泛用于預防心房顫動、心臟瓣膜置換等引發(fā)的血栓栓塞及腦卒中事件，以及預防和治療深靜脈血栓和肺栓塞[1]。華法林的循證醫(yī)學證據充足、價格低廉，因此成為抗凝治療的首選藥物之一。然而，華法林的臨床應用也有許多局限性，包括治療窗狹窄、需要頻繁的臨床監(jiān)測等[2]。華法林在臨床使用時易受多種食物和藥物的影響，包括中藥和西藥。其可導致華法林抗凝強度的增強或減弱，甚至發(fā)生嚴重不良反應。根據2005年的系統性回顧研究，可影響華法林抗凝作用的藥物和食物多達120 余種，且數量還在不斷擴增[3]。眾所周知，中藥在我國的臨床應用十分普遍，同時在全球范圍內作為補品或替代藥物的使用情況也逐年增多[4]。中藥在心腦血管疾病的治療方面具有獨特的優(yōu)勢，在臨床應用時與華法林聯用的機會較多。

三七總皂苷是從三七根部提取的有效成分，具有活血祛瘀、通脈活絡之功效。主要用于治療中風偏癱、瘀血阻絡證。研究表明，一定劑量的三七水煎液可顯著延長華法林在大鼠體內的代謝時間[5]。三七總皂苷還具有抑制血小板聚集和抗凝功效，可能會與華法林發(fā)揮協同抗凝作用[6]。臨床研究表明，血塞通注射液（主成分為三七總皂苷）聯合華法林可更好地降低非大面積急性肺栓塞患者的肺動脈壓，并能縮短治療時間，療效優(yōu)于常規(guī)的華法林抗凝治療[7]。此外，有學者初步探究了三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響，但對凝血功能的評價僅局限于PT[8]。因此，本文通過凝血四項全面評價三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響，并以凝血因子和華法林代謝酶闡釋相關機理。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

三七總皂苷（云南三七科技有限公司，批號：180301）；華法林鈉片（芬蘭奧利安大藥廠，批號：1821813）；SPF 級SD 大鼠（雄性，體質量160～180 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006）；PT、APTT、FIB、TT 測定試劑盒（凝固法，北京賽科希德科技股份有限公司）；纖維蛋白原參比血漿、定標血漿（美國太平洋公司，貨號：100602、100301）；乏Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子血漿試劑盒（美國Instrumentation Laboratory 公司，貨號：0020012200、0020011700、0020011900、0020010000）；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：KR104）；Trans Start Green qPCR SuperMix 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，貨號：AQ101）；CYP 2C11、CYP 1A2和CYP 3A4抗體（美國Abcam公司，貨號：ab3571、ab22717和ab3572）；全自動凝血測試儀（北京賽科希德科技股份有限公司）；凝血檢測儀（羅氏診斷有限公司，德國）；超微量紫外/可見分光光度計（Thermo 公司，美國）；熒光定量PCR 儀（杭州博日科技有限公司）；垂直電泳槽（ATTO公司，日本）；電泳儀（北京六一儀器廠）；轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）；凝膠成像分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與處理 將120 只大鼠按隨機數表法分為3 大組，每大組40 只。然后再將各大組均隨機分為4 小組，即對照組（Control）、三七總皂苷組（PNS）、華法林組（Warfarin）、聯用組（PNS-Warf），每小組10只。根據臨床單日等效劑量折算，三七組和聯用組灌胃三七總皂苷31.25 mg/kg，1 次/d，連續(xù)14 d，而對照組和華法林組灌胃等體積蒸餾水。隨后，各大組中的華法林組和聯用組在前述14 d 灌胃的最后5 d，同時灌胃華法林鈉（0.5%CMC-Na 溶液混懸），1 次/d，而對照組和三七組同時灌胃等體積0.5%CMC-Na 溶液。此外，各大組中的華法林組和聯用組，華法林的使用劑量分別為低劑量、中劑量、高劑量（0.3 mg/kg、0.4 mg/kg和0.5 mg/kg）。

1.2.2 凝血四項和凝血因子活性檢測 大鼠腹主動脈取血并制備血漿，根據PT、APTT、TT 和FIB 檢測試劑盒說明書操作步驟，測定凝血四項值，并根據PT 值計算INR 值。利用各乏因子血漿測定中劑量華法林各組大鼠血漿凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性，根據試劑盒說明書進行操作，并計算相應凝血因子的活性百分比。

1.2.3 RT-qPCR 分析 提取中劑量華法林各組大鼠肝組織總RNA，按照TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書將各組總RNA進行反轉錄，以合成對應的第一鏈cDNA。將各樣品cDNA 稀釋10 倍后取2 μL作為模板，分別用目標基因引物和內參基因引物進行擴增（見表1）。以β-Actin作為內參，利用2-CT法計算各組目標基因相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物信息

1.2.4 Western Blot 分析 通過RIPA 裂解液（含PMSF）提取中劑量華法林各組大鼠肝組織總蛋白。用6%～12% SDS-PAGE 分離總蛋白，濕法轉至PVDF 膜。將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉，室溫封閉30 min。洗滌后加一抗，室溫孵育2 h。充分洗滌后加二抗，室溫孵育1 h。充分洗滌，ECL顯影液顯影，凝膠成像系統拍照。使用Image J 軟件分析蛋白的相對表達量。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件計算并進行統計學分析，計量數據均表示為平均值±標準差（±s），采用ANOVA 方差分析進行組間差異性比較；計數數據用[n（%）]描述，利用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對華法林抗凝作用的影響

2.1.1 凝血酶原時間（PT） 如表2所示，三七總皂苷組的PT較對照組間差異無統計學意義（P＞0.05），而低、中、高劑量華法林組的PT較對照組劑量依賴性延長，且組間差異有統計學意義（P＜0.05）；三七總皂苷與各劑量華法林聯用后，PT較單用華法林均不同程度延長，且組間差異有統計學意義（P＜0.05）。這表明聯用三七總皂苷可增強不同劑量華法林對PT的影響。

表2 三七總皂苷對華法林抗凝作用—PT的影響（±s，s）

表2 三七總皂苷對華法林抗凝作用—PT的影響（±s，s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別凝血酶原時間（秒）低劑量華法林中劑量華法林高劑量華法林對照組三七總皂苷組華法林組聯用組11.03±0.33 11.22±0.39 18.80±8.58*32.02±12.39**△11.76±0.34 11.62±0.36 31.71±11.41**55.03±14.53**△△11.52±0.54 11.45±0.26 47.29±18.95**80.00±24.97**△△

2.1.2 活化部分凝血活酶時間（APTT） 如表3 所示，三七總皂苷組的APTT 較對照組差異無統計學意義（P＞0.05），而低、中、高劑量華法林組的APTT較對照組劑量依賴性延長，其中，中、高劑量華法林組較對照組差異有統計學意義（P＜0.05）；三七總皂苷與各劑量華法林聯用后，APTT 較單用華法林均不同程度延長，且組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。這表明聯用三七總皂苷可增強不同劑量華法林對APTT的影響。

表3 三七總皂苷對華法林抗凝作用—APTT的影響（±s，s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別活化部分凝血活酶時間（秒）低劑量華法林中劑量華法林高劑量華法林對照組三七總皂苷組華法林組聯用組17.48±0.59 17.08±0.45 19.40±6.76 28.73±11.37*△17.71±0.48 17.56±1.02 28.62±11.20**43.23±10.53**△△17.43±1.05 17.23±0.93 42.43±18.39**63.25±20.04**△

2.1.3 凝血酶時間（TT）如表4 所示，三七總皂苷組、華法林組及聯用組的TT 較對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。這表明三七總皂苷和華法林在單用或聯用時對TT均無顯著影響。

表4 三七總皂苷對華法林抗凝作用—TT的影響（±s，s）

表4 三七總皂苷對華法林抗凝作用—TT的影響（±s，s）

組別凝血酶時間（秒）低劑量華法林中劑量華法林高劑量華法林對照組三七總皂苷組華法林組聯用組33.63±1.50 34.72±2.31 32.88±1.15 33.05±1.60 33.88±1.20 35.08±2.93 33.35±1.81 34.60±1.98 34.88±1.64 36.45±0.91 34.04±0.96 35.25±1.80

2.1.4 纖維蛋白原（FIB）含量 如表5所示，華法林組的FIB含量較對照組差異無統計學意義（P＞0.05），而三七總皂苷組與聯用組的FIB含量較對照組均顯著降低，且組間差異無統計學意義（P＞0.05）。這表明三七總皂苷可降低大鼠血漿纖維蛋白原含量，而不同劑量華法林對纖維蛋白原含量并無顯著影響。

表5 三七總皂苷對華法林抗凝作用—FIB含量的影響（±s，s）

表5 三七總皂苷對華法林抗凝作用—FIB含量的影響（±s，s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05。

組別纖維蛋白原含量（g/L）低劑量華法林中劑量華法林高劑量華法林對照組三七總皂苷組華法林組聯用組2.59±0.20 2.32±0.14*2.63±0.33 2.34±0.13*△2.54±0.11 2.29±0.27*2.58±0.18 2.27±0.30*△2.58±0.12 2.33±0.20*2.48±0.17 2.22±0.27**△

2.2 對華法林作用凝血因子的影響

2.2.1 凝血因子活性 如表6所示，三七總皂苷組凝血因子活性較對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；華法林組凝血因子活性較對照組均不同程度降低，其中凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ組間差異有統計學意義（P＜0.05）；聯用組凝血因子活性較華法林組均不同程度降低，其中凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅹ組間差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究表明，三七總皂苷可增強華法林對凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ活性的抑制作用，而其本身對上述凝血因子活性無顯著影響。

表6 三七總皂苷對華法林作用凝血因子活性的影響（±s）

表6 三七總皂苷對華法林作用凝血因子活性的影響（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05。

Group Factor ⅡFactor ⅦFactor ⅨFactor ⅩControl PNS Warfarin PNS-Warf 81.4±16.9 83.5±19.6 63.9±22.8 36.0±25.4△**103.6±13.2 100.7±21.8 73.0±33.2*39.8±23.3△**92.4±18.4 97.7±23.0 67.3±31.5*43.3±28.6**118.8±19.2 110.8±29.3 50.8±35.1**25.3±14.6△**

2.2.2 凝血因子基因表達 如圖1所示，三七組凝血因子基因表達較對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；華法林組凝血因子基因表達較對照組差異有統計學意義（P＜0.05）；聯用組凝血因子基因表達較華法林組均不同程度降低，其中凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ組間差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究表明，三七總皂苷可增強華法林對凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ基因表達的抑制作用，而其本身對上述凝血因子的基因表達無顯著影響。

圖1 三七總皂苷對華法林作用凝血因子Ⅱ（A）、Ⅶ（B）、Ⅸ（C）、Ⅹ（D）基因表達的影響N.S.表示差異無統計學意義；與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05。

2.3 對大鼠肝臟華法林代謝酶的影響

如圖2 所示，華法林組CYP1A2、CYP2C11 和CYP3A4蛋白表達較對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；三七總皂苷組與聯用組CYP1A2蛋白表達較對照組顯著升高，而CYP2C11 和CYP3A4 較對照組顯著降低，且兩組間各蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究表明，三七總皂苷可誘導CYP1A2表達，抑制CYP2C11 和CYP3A4 表達，而華法林對各代謝酶表達無顯著影響。

圖2 三七總皂苷對大鼠肝臟華法林代謝酶CYP1A2（A）、CYP2C11（B）和CYP3A4（C）蛋白表達的影響N.S.表示差異無統計學意義；與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與華法林組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

3 討論

華法林作為臨床一線口服抗凝藥物，廣泛應用于預防和治療血栓栓塞性疾病。華法林是通過抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的肝臟合成而發(fā)揮抗凝作用[9]。目前，臨床主要以“凝血四項”反映機體止血與凝血系統的狀況，包括APTT、PT、FIB 和TT[10]。其中，APTT（延長）主要用于篩查凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ等的缺乏，PT（延長）主要用于篩查凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ等的缺乏，FIB主要反映血漿纖維蛋白原的含量，而TT 主要反映纖維蛋白原轉為纖維蛋白的時間[11]。此外，INR 值作為華法林抗凝監(jiān)測的首選指標，是由PT 演算而來。應用華法林抗凝治療，一般要求INR值維持在2.0～3.0的合理范圍[12]。

中藥在心腦血管疾病的治療方面具有獨特的優(yōu)勢，在臨床應用時與華法林聯用的機會較多。一項Meta 分析研究了9 項中藥與華法林聯用的臨床試驗，表明中藥聯合華法林對房顫患者血栓栓塞的預防優(yōu)于單用華法林，并且不會增加患者出血風險[13]。中藥成分復雜，對華法林抗凝作用的影響也極其復雜。近年來，中藥與華法林發(fā)生相互作用而引起INR 水平變化或不良反應的報道屢見不鮮。有學者初步探究了三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響，但對凝血功能的評價僅局限于PT[8]。因此，本文以凝血四項全面評價三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響，并以凝血因子和華法林代謝酶闡釋相關機理。

在本研究中，低劑量華法林單用及與三七總皂苷聯用的INR值（由PT值演算）分別為（1.71±0.78）和（2.89±1.11），中劑量華法林單用及與三七總皂苷聯用的INR值分別為（2.83±1.03）和（4.90±1.30），高劑量華法林單用及與三七總皂苷聯用的INR 值分別為（4.27 ± 1.71）和（7.21 ± 2.26）。這表明三七總皂苷與各劑量華法林聯用均可發(fā)揮協同抗凝作用。其中，中劑量華法林單用和三七總皂苷-低劑量華法林聯用等效、合理抗凝。這提示降低華法林用量并聯用三七總皂苷可以保證合理的抗凝效果，降低血栓栓塞風險。此外，纖維蛋白原（FIB）作為血栓形成的原料，其血漿含量是溶栓治療的一級檢測指標[11]。在本研究中，三七總皂苷單用及與各劑量華法林聯用的FIB 含量較對照組均顯著降低，且二者差異無統計學意義，表明聯用三七總皂苷還可能通過減少FIB含量而降低血栓栓塞風險。

臨床應用的華法林是一種外消旋混合物，包括S-華法林和R-華法林兩種異構體，其中S-華法林提供了60%～70%的抗凝活性[14]。S-華法林主要由人體肝臟代謝酶CYP2C9 代謝，而R-華法林則主要由CYP1A2 和CYP3A4 代謝[14]。華法林抗凝易受多種食物和藥物影響，例如可通過誘導（或抑制）華法林的肝臟代謝酶而抑制（或增強）其抗凝作用[9]。為進一步從蛋白分子角度闡釋三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響機理，我們研究了三七總皂苷對華法林作用的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表達的影響，并研究了三七總皂苷對大鼠肝臟華法林代謝酶CYP2C11、CYP1A2 和CYP3A4 的蛋白表達的影響。其中，大鼠肝臟中CYP2C11與人體肝臟中S-華法林代謝酶CYP2C9 在氨基酸序列、代謝底物等方面具有77%的同源性[15，16]，并且CYP2C11 是雄性大鼠肝藥酶中最豐富的特異性亞型，約占成年雄性大鼠肝藥酶總量的50%[17]。對凝血因子的研究表明，盡管聯用組凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表達較華法林組均不同程度降低，但單用三七總皂苷對上述凝血因子無顯著影響，這與PT 和APTT 的研究結果一致。對華法林肝臟代謝酶的研究表明，三七總皂苷組和聯用組R-華法林代謝酶CYP1A2 的蛋白表達較對照組顯著增加，S-華法林代謝酶CYP2C11 和R-華法林代謝酶CYP3A4 的蛋白表達較對照組顯著降低，而華法林對這三種代謝酶的蛋白表達無顯著影響。有研究表明[18]，S-華法林的抗凝活性是R-華法林的3～5倍。因此，三七總皂苷可能是通過抑制大鼠肝藥酶CYP2C11 和CYP3A4 的表達降低華法林在大鼠體內的代謝，從而使華法林作用的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活性和基因表達較單用華法林進一步降低，發(fā)揮協同抗凝作用。

綜上所述，本文研究了三七總皂苷對華法林抗凝作用的影響及相關機理。三七總皂苷可能通過抑制大鼠肝臟S-華法林代謝酶CYP2C11和R-華法林代謝酶CYP3A4的表達而降低華法林在大鼠體內的代謝，進而增強華法林對凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的抑制作用，使二者發(fā)揮協同抗凝作用。而三七總皂苷對上述凝血因子并無調控作用，但可通過減少FIB含量協同降低血栓栓塞風險。因此，在華法林臨床應用過程中，若與三七總皂苷聯用，可通過調整華法林用量以保證合理的抗凝效果，降低血栓栓塞風險，避免因兩藥聯用造成抗凝過度而增加出血風險。