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    代謝組學(xué)研究方法及其在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用探析

    2023-08-04 17:13:58李春燕薛培鳳陸景坤
    關(guān)鍵詞:高通量代謝物組學(xué)

    董 馨,李春燕,薛培鳳,陸景坤,王 智,王 辰,渠 弼

    (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

    骨質(zhì)疏松是一種病因復(fù)雜的常見的進(jìn)行性骨骼疾病。其特征為單位面積內(nèi)骨組織量低于正常標(biāo)準(zhǔn)(T 值介于-1 g/cm3和1 g/cm3之間),易造成疼痛、骨折及駝背等,且患者結(jié)構(gòu)以老年人和絕經(jīng)后婦女為主。近年來,全球骨質(zhì)疏松患病率的激增給社會(huì)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害,骨質(zhì)疏松現(xiàn)已成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。對(duì)骨質(zhì)疏松生物標(biāo)志物的研究有助于做到對(duì)疾病的早發(fā)現(xiàn)和早預(yù)防,對(duì)降低患病率有重大意義[1,2]。

    骨質(zhì)疏松是一種代謝性疾病,代謝組學(xué)被廣泛用于骨質(zhì)疏松的研究。代謝組學(xué)是繼蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)后新發(fā)展的一門學(xué)科,與其他組學(xué)的研究思想有相近之處,可通過對(duì)生物體液或機(jī)體各組織中存在的各種代謝物的識(shí)別來探究機(jī)體內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)化的規(guī)律或機(jī)體在生理、病理刺激下的動(dòng)態(tài)變化,為解釋骨質(zhì)疏松生理或病理機(jī)制提供另一種新的視角,成為骨質(zhì)疏松的預(yù)防、診斷和治療更簡捷的工具[3]。

    1 代謝組學(xué)的研究方法

    1.1 樣品采集和制備

    1.1.1 樣本采集 在代謝組學(xué)研究中,樣本的選取和制備對(duì)代謝物的檢測(cè)結(jié)果有較大的影響,制備方案應(yīng)盡可能覆蓋所有的代謝產(chǎn)物。骨質(zhì)疏松代謝組學(xué)研究所選取的樣本有血液、尿液、糞便、膽汁及全身各組織[4]。血液參與全身循環(huán),包含大量的代謝物,能整體地反映機(jī)體的生理病理狀態(tài),通常作為代謝組學(xué)樣本的首選。由于全血中同時(shí)包含細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)液,基質(zhì)的復(fù)雜性增加,在實(shí)際檢測(cè)中多對(duì)血清和血漿進(jìn)行分析[5]。糞便樣本通常用來分析機(jī)體與腸道菌群之間相關(guān)作用。尿液樣本中常含有藥物和工業(yè)產(chǎn)物,通常用來反映藥物代謝的最終狀態(tài)。尿液和糞便具有采樣便捷、可大量取樣等優(yōu)點(diǎn),但由于樣本濃度差異較大、代謝物種類與含量參差不齊,增加定量難度[6]。組織樣本的選擇具有明確的目標(biāo)性,樣本含有豐富的代謝物信息,但制備方法較為復(fù)雜??傊?,不同種類的研究需要選擇合適的樣本,以達(dá)到分析的準(zhǔn)確性和無偏向性。

    1.1.2 樣品制備方法 生物樣品組成復(fù)雜,基質(zhì)干擾性強(qiáng),為了提升待測(cè)樣品的分析準(zhǔn)確性,在檢測(cè)前都需經(jīng)過前處理,將待檢成分最大限度與基質(zhì)分離。常見的樣本前處理方法包括:直接稀釋進(jìn)樣法、溶劑沉淀法、離心超濾法及固相萃取法等。溶劑沉淀法被廣泛應(yīng)用于血清、糞便、組織、細(xì)胞等樣本,成本低,可用于高通量篩選,但操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性低,操作過程中對(duì)樣品的稀釋易致成分缺失[7,8]。直接稀釋進(jìn)樣法適用于尿液樣本,操作便捷,可降低溶劑對(duì)儀器分析的影響,減少被分析物的丟失。離心超濾法在處理各種生物樣本時(shí),無需加入沉淀蛋白劑便可除去基質(zhì)中大部分高分子有機(jī)物質(zhì),操作簡單、成本低廉,可保證檢測(cè)結(jié)果的靈敏度[9]。固相萃取法被譽(yù)為最具前景的樣本前處理方法,在處理生物樣本時(shí)能夠高效去蛋白,同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行濃縮,提升靈敏度和樣本回收率,降低分析誤差[10]。

    1.2 高通量質(zhì)譜在樣品分析中的應(yīng)用

    其分析和檢測(cè)主要依賴于高通量的質(zhì)譜(mass spectrograph,MS)。MS具有較高的靈敏度,數(shù)據(jù)掃描范圍廣、速度快,對(duì)于熱不穩(wěn)定、易揮發(fā)、不易衍生化和相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)同樣適用。而且近年來質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫和分析軟件也得到了快速發(fā)展,這些優(yōu)點(diǎn)使得MS 在代謝組學(xué)研究中使用更為廣泛[11]。但是MS只能對(duì)化合物進(jìn)行鑒定,實(shí)現(xiàn)高通量要先將成分進(jìn)行高效分離,才能得到更好的分析效果。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)作為體內(nèi)成分分析的理想工具,可以同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行分離與檢測(cè),實(shí)現(xiàn)樣品分析高效性[12,13]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理方法

    代謝組學(xué)通過對(duì)生物體內(nèi)代謝物的變化情況分析,可識(shí)別出數(shù)千個(gè)甚至更多的變量數(shù)據(jù)。將龐大的數(shù)據(jù)量進(jìn)行空間模型擬合、理論計(jì)算、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換等過程是數(shù)據(jù)處理的一大難點(diǎn),通常需要選擇合理的數(shù)據(jù)處理方式。

    1.3.1 主成分分析 主成分分析(principal component analysis,PCA)是一種通過降維的原理,把多變量的空間轉(zhuǎn)化為幾個(gè)主成分空間的重要統(tǒng)計(jì)方法之一,通過對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和概覽,揭示出各組數(shù)據(jù)的趨勢(shì)和離群值并獲得各變量之間的相似性和差異性信息[14]。數(shù)據(jù)信息通常需要擬合成各種直觀的可視化圖形表達(dá)信息,PCA 通常運(yùn)用主成分得分圖和主成分載荷圖表達(dá)各變量的相似性和差異性。

    1.3.2 偏最小二乘判別分析 偏最小二乘判別分析(partial least squares-discrimination analysis,PLS-DA)是一種有效的統(tǒng)計(jì)方法,其原理與PCA 相似,將各個(gè)樣本分組分類,相較于PCA 更容易發(fā)現(xiàn)組間差異,尤其是對(duì)于樣本組間差異較小的分析更適合采用PLS-DA分析。

    1.3.3 正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法。其最大的特點(diǎn)是可以去除變量X 中與變量Y 無關(guān)的數(shù)據(jù)變異,使分類信息主要集中在一個(gè)主成分中,從而使得模型相較于PLS-DA 更簡單,其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[15]。OPLS-DA 可對(duì)兩個(gè)組別的樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析和判別,可以很清楚地展現(xiàn)兩組間變量的差異性。而這種差異性是通過S圖直觀地展示出來,在S圖中,可以清楚地顯示出各變量的差異程度,距離原點(diǎn)越遠(yuǎn),表現(xiàn)差異性越高。這提示化合物更有可能成為生物標(biāo)志物。

    1.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺(tái)

    生物機(jī)體的代謝過程復(fù)雜,涉及的代謝物眾多,且代謝組學(xué)運(yùn)用到MS 和NMR 等高分辨率、高準(zhǔn)確性的分析儀器,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量大,數(shù)據(jù)的處理過程復(fù)雜。近年隨著代謝組學(xué)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的快速發(fā)展,相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件及平臺(tái)也得到快速發(fā)展。目前被廣泛使用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)有XCMS、Compound Discover 以及Simca-P 等,且每個(gè)平臺(tái)都有其獨(dú)有的特點(diǎn)[16,17]。

    XCMS是一個(gè)相對(duì)簡便的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺(tái),有非常直觀的圖形界面來提供對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的峰值檢測(cè)、保留時(shí)間矯正、峰對(duì)齊以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等完整的工作流程。在數(shù)據(jù)處理完成后可以獲得保留時(shí)間校準(zhǔn)前的總離子色譜圖、保留時(shí)間校正云圖、多維縮放和主成分分析等直觀的結(jié)果分析,接受大部分質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式,且識(shí)別的真實(shí)性較好,適合非靶標(biāo)代謝組學(xué)的分析。

    Compound Discover 是一款商用軟件,擁有著強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理分析能力。利用MS/MS 庫鑒定化合物,并用高分辨率的全質(zhì)譜同位素和MS/MS 數(shù)據(jù)來測(cè)定元素組成。Compound Discover 還可以通過t檢驗(yàn)、方差分析、主成分分析、PLS-DA、火山圖、盒型圖等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,可以查看趨勢(shì)圖以顯示峰值區(qū)域,每個(gè)組的平均峰值面積。雖然其數(shù)據(jù)處理能力較為強(qiáng)大,但由于其商用的性質(zhì),限制了多數(shù)科研人員的使用。

    Simca-P 也是一種多元化數(shù)據(jù)分析軟件,Simca-P提供了PCA、PLS-DA等模型的有效算法,可以方便的提取信息,在計(jì)算的同時(shí)給出了模型的各類統(tǒng)計(jì)量,提供了強(qiáng)大的輔助分析功能,保證了數(shù)據(jù)信息的有效性。Simca-P 通過簡單地操作就可對(duì)質(zhì)譜以及平臺(tái)運(yùn)算數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理,將其繪制成各種所需的圖形,且操作具有高度自由性,可編輯成各種類型圖表。

    2 代謝組學(xué)在骨質(zhì)疏松疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用

    骨質(zhì)疏松是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病。隨著代謝組學(xué)研究的深入,越來越多與骨質(zhì)疏松疾病機(jī)制有關(guān)的代謝物被相繼發(fā)現(xiàn),這些代謝物參與的生物學(xué)過程包括:能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝及微生物群代謝等。

    2.1 能量代謝

    相關(guān)研究顯示,骨質(zhì)疏松可能與能量代謝紊亂有關(guān)。成骨細(xì)胞分泌的非羧基化骨鈣素能通過干預(yù)機(jī)體內(nèi)的葡萄糖代謝進(jìn)而影響能量代謝,而能量代謝也能通過下丘腦、交感神經(jīng)調(diào)控骨生成和骨重塑。骨重塑過程中結(jié)晶磷酸鈣或原纖維膠原蛋白的降解需要大量的能量,當(dāng)能量代謝受到影響時(shí),骨重塑也將受到影響[18]。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)中間產(chǎn)物,參與ATP 合成。琥珀酸作為電子傳遞鏈的電子供體,是三羧酸循環(huán)中的另一個(gè)中間產(chǎn)物。通過代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)得骨質(zhì)疏松大鼠模型血清的檸檬酸和琥珀酸水平均明顯降低,三羧酸循環(huán)受損。這說明能量代謝紊亂可干擾骨組織健康水平。

    2.2 脂質(zhì)代謝

    肥胖是誘導(dǎo)多種慢性疾病的因素之一。研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松與肥胖也有著密切的關(guān)系?,F(xiàn)代臨床研究顯示,肥胖通過干擾成骨作用、破骨作用及骨代謝來誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松。Ye等[19]研究發(fā)現(xiàn),Omega-3和Omega-6 等多不飽和脂肪酸對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松有積極的作用,可以影響鈣平衡,改變細(xì)胞膜功能,減少炎癥細(xì)胞因子或調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活的受體γ 來減慢骨骼吸收并促進(jìn)成骨細(xì)胞生成。LysoPC(18∶1)是甘油磷脂代謝中甘油磷脂酰膽堿的上游成分之一。研究顯示,去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠模型中LysoPC(18∶1)水平顯著升高,說明脂質(zhì)代謝紊亂會(huì)對(duì)正常骨代謝造成一定影響,從而干擾骨骼健康[20]。

    2.3 氨基酸代謝

    多種氨基酸,如精氨酸、賴氨酸和谷氨酸等,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和分化。氨基酸會(huì)影響骨密度(bone mineral density,BMD),促進(jìn)骨骼健康[21]。丙氨酸在骨骼代謝中起著關(guān)鍵的作用,通過促進(jìn)胰島素樣生長因子以及膠原蛋白和肌蛋白的合成來影響骨骼代謝。Yu 等[22]研究BMD 低的絕經(jīng)后女性尿液發(fā)現(xiàn)丙氨酸含量顯著增加,推斷丙氨酸與骨質(zhì)疏松有著密切的聯(lián)系。Qi等[23]發(fā)現(xiàn)谷氨酸受體在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中廣泛表達(dá),且有證據(jù)顯示谷氨酸的信號(hào)可調(diào)控骨的形成和吸收。

    2.4 微生物群代謝

    生物機(jī)體與體內(nèi)微生物群相互共生,微生物群可作用于腸道上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞,調(diào)控機(jī)體的生理狀態(tài)。研究表明[24],馬尿酸被作為骨質(zhì)疏松疾病的關(guān)鍵生物標(biāo)志物,由腸道微生物將食物中的芳香化合物代謝為苯甲酸,隨后結(jié)合甘氨酸形成。代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠模型體液中的馬尿酸水平顯著降低。這提示糖皮質(zhì)激素可能干擾了腸道微生物群導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

    3 代謝組學(xué)技術(shù)在骨質(zhì)疏松疾病診斷中的應(yīng)用

    骨質(zhì)疏松是一種代謝性疾病。隨著疾病的發(fā)生,一些小分子代謝物的種類和數(shù)量也會(huì)隨之改變,這些改變可能早于臨床癥狀的出現(xiàn)。利用代謝組學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)生物標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)水平,能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷。Takeshi 等[25]通過對(duì)絕經(jīng)后婦女進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),低骨量人群的尿素、肌酸以及多種氨基酸與正常人相比都有顯著的差異。Pontes等[26]通過對(duì)中國不同骨密度的女性進(jìn)行代謝組學(xué)研究,最終確定了?;撬?、乳酸以及多種氨基酸為骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)記物。代謝組學(xué)從全局出發(fā)尋找與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物,表征疾病所特有的代謝模式,樣品易獲取、技術(shù)高通量,在疾病早期診斷方面有很大的應(yīng)用潛力。

    4 展望

    近年代謝組學(xué)憑借其高靈敏度、全面的特點(diǎn)逐漸興起,為骨質(zhì)疏松的研究打開了新的思路,并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與骨質(zhì)疏松相關(guān)的生物標(biāo)志物及其代謝途經(jīng),這些發(fā)現(xiàn)為臨床上預(yù)防、診斷和治療骨質(zhì)疏松提供了新的方法。高分辨率質(zhì)譜與多檢測(cè)器聯(lián)用也被用于疾病診斷,高通量和高靈敏度使得疾病診斷效率得到有效地提升。

    盡管代謝組學(xué)已是廣大科研人員認(rèn)可的研究手段,但骨質(zhì)疏松病因復(fù)雜,只從代謝維度研究整體致病機(jī)理具有片面性。近年興起的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組技術(shù)可結(jié)合代謝組學(xué)從多個(gè)層面獲得病理狀態(tài)或藥物治療后的生理變化。將這些變化富集和追溯到最集中的通路和靶點(diǎn),通過對(duì)基因、RNA、蛋白質(zhì)以及體內(nèi)小分子等整體變化物質(zhì)進(jìn)行綜合分析,反映出組織器官功能和代謝狀態(tài),更加深入地對(duì)骨質(zhì)疏松進(jìn)行研究,實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的診斷和治療。但多組學(xué)整合技術(shù)尚未完全成熟,匹配臨床信息的多組學(xué)研究結(jié)合多樣本高通量分析仍是整合過程中的瓶頸,攻克多組學(xué)數(shù)據(jù)整合這道難題,并將之運(yùn)用于骨質(zhì)疏松的診斷和治療當(dāng)中是相關(guān)科研工作者的共同目標(biāo)。

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