當(dāng)歸補血湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

趙瑩，鄭秋含，張眾，潘志，王穎航 （.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 307；.長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，吉林 長春 307）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種病因未明的自身免疫性疾病[1]。RA 全球平均患病率為0.5%～1.0%，我國的發(fā)病率為0.42%[2-3]。RA 的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫紊亂、細胞因子等多方面，目前臨床尚無根治方法，多停留在抑制炎癥、緩解癥狀、延緩病情發(fā)展階段，且臨床治愈率較低[4]。探究RA 潛在的治療方法是近年來的研究熱點。

當(dāng)歸補血湯始載于《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪和當(dāng)歸組成，用量比為5∶1，其中黃芪扶陽補氣、益氣補血，當(dāng)歸活血補血，二者合用，氣血兩旺，對補氣生血有協(xié)同增效的作用[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[6]表明，當(dāng)歸補血湯具有抗炎、補氣生血、調(diào)節(jié)免疫等功能作用，在RA 的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。但目前當(dāng)歸補血湯治療RA 的相關(guān)研究及報道較少，因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)結(jié)合實驗驗證，以揭示當(dāng)歸補血湯治療RA 可能的作用機制，為后續(xù)的進一步研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性Wistar 大鼠42 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0014，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2011-0004，飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度（23±2）℃，相對濕度（50±5）%。所有動物實驗按照長春中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，批準(zhǔn)號：2021361。

1.2 藥物及試劑 當(dāng)歸、黃芪，購自長春吉林大藥房，批號分別為：200407、28122068，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知副教授鑒定為正品；雷公藤多苷片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z31020415，批號：20191204；氨基甲酸乙酯，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司，批號：20190807；牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex 公司，批號：220241；弗氏完全佐劑，美國Sigma 公司，批號：SLCJ4383；乙酸溶液，批號：20210309；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP9）抗體（批號：A0289）、HIF-1α 抗體（批號：A11945）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）抗體（批號：A5708），美國ABclo nal 公司）；GAPDH抗體，美國Bioworld 公司，批號：AP0063；Goat anti-Rabbit IgG（H＆L）-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AF12114126；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：120219200821；ECL 發(fā)光液，美國Beyotime 公司，批號：P0018AS。

1.3 儀器 165-8000 型電泳儀、170-3930 型轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad 公司；FL1000 型智能成像系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；3H16RI 高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.4.1 當(dāng)歸補血湯的活性成分和潛在靶點的獲取和篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）檢索當(dāng)歸、黃芪的活性成分和潛在靶點[7]。以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Likeness，DL）≥0.18 為條件篩選，去重。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www. Uniprot.org/）進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終確定當(dāng)歸補血湯的活性成分和潛在靶點[8]。

1.4.2 RA 疾病相關(guān)靶點及藥物-疾病共同靶點的獲取利用DisGeNET（http://www.Dis Ge NET.org/home/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca）和TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd） 數(shù) 據(jù) 庫 以 “Rheumatoid Arthritis”為檢索詞條，獲取RA 疾病靶點[9-11]。將獲取的靶點進行合并、去重，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所得靶點進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。將當(dāng)歸補血湯潛在靶點與RA 疾病靶點導(dǎo)入Venny 2.1.0 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），獲得兩者的交集靶點。

1.4.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖將藥物、藥物的活性成分、疾病以及藥物與疾病的交集靶點之間的相互對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并進行相關(guān)拓撲學(xué)分析。在此網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點（node）代表藥物、活性成分、疾病和交集靶點；邊（edge）代表藥物的活性成分、疾病與其作用靶點之間的關(guān)系；與節(jié)點直接相連的其他節(jié)點的數(shù)目稱為該節(jié)點的度值（degree），節(jié)點的度值越大，該節(jié)點所代表的活性成分或者靶點在交集網(wǎng)絡(luò)中越重要。通過該網(wǎng)絡(luò)圖可進一步明確當(dāng)歸補血湯治療RA 的核心活性成分。

1.4.4 構(gòu)建當(dāng)歸補血湯與RA 交集靶點的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖 將當(dāng)歸補血湯與RA 的交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）[12]，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。通過Cytoscape 3.6.0 軟件中“CytoNCA”插件分析拓撲網(wǎng)絡(luò)的度值（Degree Centrality，DC）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC），將高于各值中位數(shù)的靶點定義為當(dāng)歸補血湯治療RA 的核心作用靶點。

1.4.5 GO 與KEGG 富集分析 將當(dāng)歸補血湯與RA的交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）[13]，進行基因功能注釋（Gene Ontology，GO）和京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并使用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖和條形圖。

1.4.6 當(dāng)歸補血湯核心活性成分與核心靶點的分子對接 將當(dāng)歸補血湯主要活性成分與核心靶點進行分子對接，首先通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得化合物的SDF 格式文件，使用Chem3D 軟件對結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化并獲得3D 結(jié)構(gòu)的mol2格式文件。通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得核心靶點的受體蛋白VEGFA（PDB：1BJ1）、HIF-1α（PDB：1H2K）、MMP9（PDB：1GKC），使用PyMOL 2.5 軟件對受體蛋白進行去除水分子和小分子配體。使用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件對靶點的受體蛋白與配體化合物進行PDBQT 格式轉(zhuǎn)換。最后利用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接并用PyMOL 2.5 進行可視化分析。

1.5 當(dāng)歸補血湯治療RA 的體內(nèi)實驗驗證

1.5.1 藥物的配制、實驗分組、造模及給藥 當(dāng)歸補血湯按原方黃芪與當(dāng)歸5∶1 稱取，煎煮濃縮至水煎液濃度為含生藥量1.5 g·mL-1，即當(dāng)歸補血湯高劑量組；同法制備當(dāng)歸補血湯中（7.5 g·kg-1）、低（3.75 g·kg-1）劑量水煎液。42 只Wistar 大鼠按照隨機數(shù)字表分為空白組、模型組、雷公藤多苷組及當(dāng)歸補血湯低、中、高劑量組，每組7 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，在大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 膠原乳劑，進行初次免疫。第7 天進行二次免疫，免疫方法與初次免疫方法相同，建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用的膠原誘導(dǎo)性（CIA）模型[14]。二次免疫1 周后，雷公藤多苷組（9.45 mg·kg-1）及當(dāng)歸補血湯低、中、高劑量組進行灌胃治療，空白組與模型組給予等量生理鹽水，每周記錄關(guān)節(jié)腫脹程度，周期為6 周。

1.5.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分 采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分評價其關(guān)節(jié)炎癥程度。于初次免疫前觀察1 次，之后每周觀察1 次足爪腫脹情況，同時對足爪炎癥進行評分，采用5 分制的評分標(biāo)準(zhǔn)[15]。0 分，無皮膚紅腫關(guān)節(jié)癥狀；1 分，腳踝或足部發(fā)紅輕度腫脹；2 分，腳踝和足部發(fā)紅輕度腫脹；3 分，腳踝和足部發(fā)紅，踝關(guān)節(jié)和跖關(guān)節(jié)中度腫脹；4 分，整個踝關(guān)節(jié)、足部和足底紅腫嚴(yán)重。此外，出現(xiàn)尾部紅斑或前肢腫脹分別計0.5 分。關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度由三位獨立觀察者目測評估，觀察者不知道實驗分組。

1.5.3 Western Blot 法檢測滑膜組織中相關(guān)蛋白表達水平 配制20%的氨基甲酸乙酯，按照7 mL·kg-1的劑量腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血后截取大鼠膝關(guān)節(jié)，用剪刀去除關(guān)節(jié)表面的皮膚和肌肉組織，取各組大鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織并剪碎，分別加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE 凝膠，上樣后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，TBST 洗滌，4 ℃過夜孵育HIF-1α（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000）一抗；次日TBST 洗滌，室溫搖床上孵育二抗（1∶1 000）1 h；TBST 洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯色，采用ImageJ 圖像分析軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 通過SPSS 19.0 軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補血湯的活性成分和潛在靶點 見表1。共獲取當(dāng)歸補血湯活性成分17 個。黃芪對應(yīng)靶點376 個、當(dāng)歸55 個，去除重復(fù)靶點，最終獲得193 個當(dāng)歸補血湯治療RA 的潛在靶點。

表1 當(dāng)歸補血湯活性成分基本信息Table 1 Basic information of active components of Danggui Buxue Decoction

2.2 RA 的疾病靶點及藥物-疾病共同靶點 見圖1。在DisGeNET、DrugBank 和TTD 數(shù)據(jù)庫分別獲得RA疾病靶點2 723 個、594 個和147 個，進行合并、去重，最終共獲得2 883 個RA 疾病靶點。通過Venny 2.1.0 平臺共獲得129 個當(dāng)歸補血湯治療RA 的作用靶點，即與綠色相交部分，其中黃芪治療RA 的可能靶點128 個，當(dāng)歸治療RA 的可能靶點20 個。

圖1 當(dāng)歸補血湯與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）交集靶點的韋恩（Venny）圖Figure 1 Venny diagram of intersection target of Danggui Buxue Decoction and rheumatoid arthritis（RA）

2.3“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖分析 通過“1.4.3”項下方法構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，并進行相關(guān)拓撲學(xué)分析。在此網(wǎng)絡(luò)圖中，共有149 個節(jié)點，426 條邊。其中紅色圓形節(jié)點表示RA，藍色菱形節(jié)點表示當(dāng)歸補血湯治療RA 潛在作用靶點，綠色和黃色正方形節(jié)點表示黃芪、當(dāng)歸，綠色和黃色正六邊形節(jié)點表示黃芪、當(dāng)歸的活性成分。節(jié)點面積越大代表連接度值越大，其中度值最高的活性成分是HQ15 槲皮素（quercetin）。

圖2 當(dāng)歸補血湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network diagram of“drugs-active components-disease-target”of Danggui Buxue Decoction in the treamtent of rheumatoid arthritis（RA）

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析和核心靶點篩選 通過“1.4.4”項下方法構(gòu)建當(dāng)歸補血湯治療RA 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），共有129 個節(jié)點、2 566 條邊。利用Cytoscape 3.6.0軟件中的“CytoNCA”插件進一步拓撲分析，獲得當(dāng)歸補血湯治療RA 的AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α和MMP9 等27 個核心靶點，見圖4。選取影響關(guān)節(jié)滑膜環(huán)境的VEGFA、HIF-1α 和MMP9 作為關(guān)鍵靶點進行后續(xù)研究。

圖3 當(dāng)歸補血湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI network diagram of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 按“1.4.5”項下方法對當(dāng)歸補血湯治療RA 的交集靶點進行GO富集分析，獲得生物過程（Biological Processes，BP）714 條、細胞組成（Cellular Components，CC）65 條、分子功能（Molecular Functions，MF）139 條。根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取每個類別的前10 條繪制條形圖進行可視化分析，見圖5。

圖5 當(dāng)歸補血湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的GO 富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

對當(dāng)歸補血湯治療RA 的交集靶點進行KEGG 通路富集分析，獲得171 條通路，根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取富集基因數(shù)最多的前20 條，繪制氣泡圖，見圖6。結(jié)果主要涉及RA 中的PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、白細胞介素17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。

圖6 當(dāng)歸補血湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的KEGG 通路富集分析圖Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.6 當(dāng)歸補血湯主要活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果 將當(dāng)歸補血湯的關(guān)鍵活性成分槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 進行分子對接，結(jié)合能見表2。槲皮素與3 種核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 結(jié)合能值均＜-7.0 kcal·mol-1，說明具有強烈的結(jié)合活性，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。通過AutoDock Vina 1.1.2 和PyMOL 2.5 對槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 進行相互作用結(jié)合模式分析，見圖7。

圖7 槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 可視化分子對接模擬圖Figure 7 Visual simulation diagram for molecular docking of quercetin to core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

表2 槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 的結(jié)合能Table 2 Binding energy of quercetin and core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

2.7 當(dāng)歸補血湯對CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響 結(jié)果如表3 所示，與空白組比較，自第2 周起，造模大鼠關(guān)節(jié)炎評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，自第3 周起，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎評分開始呈逐漸降低趨勢，第3 周當(dāng)歸補血湯高劑量組明顯降低（P＜0.05）；至第6 周，各給藥組的關(guān)節(jié)炎評分均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 當(dāng)歸補血湯對膠原誘導(dǎo)性（CIA）大鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

表3 當(dāng)歸補血湯對膠原誘導(dǎo)性（CIA）大鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組雷公藤多苷組當(dāng)歸補血湯低劑量組當(dāng)歸補血湯中劑量組當(dāng)歸補血湯高劑量組關(guān)節(jié)炎評分/分第2 周0 4.43±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**第3 周0 4.71±0.45**4.29±0.45 4.57±0.49 4.29±0.45 4.14±0.34#第4 周0 4.29±0.45**3.71±0.45##4.14±0.35 4.14±0.33 3.86±0.35#第5 周0 4.14±0.35**3.14±0.35##3.71±0.45 3.57±0.49#3.29±0.45##第6 周0 3.86±0.35**2.57±0.49##3.26±0.45#3.29±0.45##2.86±0.63##

2.8 當(dāng)歸補血湯對CIA 大鼠滑膜組織中VEGFA、HIF-1α 和MMP9 蛋白表達水平的影響 結(jié)果見圖8，與空白組比較，模型組VEGFA、HIF-1α 和MMP9蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，雷公藤多苷組及當(dāng)歸補血湯低、中、高劑量組VEGFA、HIF-1α 和MMP9 的蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖8 當(dāng)歸補血湯對膠原誘導(dǎo)性（CIA）大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HIF-1α、VEGF、MMP-9 蛋白表達的影響（±s，n=6）Figure 8 The effect of Danggui Buxue Decoction on the protein expressions of HIF-1α，VEGF and MMP-9 in the knee synovium of CIA rats（±s，n=6）

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的主要病理特征為滑膜炎性細胞及炎性因子浸潤、滑膜細胞過度增殖、新生血管形成及軟骨和骨質(zhì)不可逆破壞[16-17]。VEGFA 是一種重要的促血管生成因子，可與滑膜血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致大量新生血管的產(chǎn)生，在RA 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[18]。HIF-1α 是組織參與缺氧調(diào)控的重要核轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下，胞內(nèi)HIF-1α 蛋白大量積聚，并從胞漿進入細胞核內(nèi)參與調(diào)控下游靶基因VEGFA 的轉(zhuǎn)錄過程，使VEGFA 表達上調(diào)，進而促進炎性細胞因子分泌、增加血管通透性、加速血管內(nèi)皮細胞增殖，導(dǎo)致血管翳形成，影響RA 的發(fā)病和病情進展[19-20]。基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metallopmteinases，MMPs）是降解細胞外基質(zhì)的一種鋅蛋白酶，可加重關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞等，其中MMP9 主要參與骨侵蝕[21]。最新研究[22]表明，VEGFA 能影夠響MMPs的表達，且VEGFA 在RA 關(guān)節(jié)液中的表達與MMP9的表達密切相關(guān)。因此，通過影響HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9 的表達，對控制RA 病情的發(fā)展和調(diào)節(jié)RA 病理過程起著重要作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)和體內(nèi)動物實驗，對當(dāng)歸補血湯防治RA 的潛在作用機制進行了初步探討，共篩選出當(dāng)歸補血湯活性成分17 個、潛在靶點193 個，共涉及171 條主要的通路以及918 個生物過程。根據(jù)構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖推測出當(dāng)歸補血湯治療RA 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，其中槲皮素的連接度值最高。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)與KEGG 通路富集分析得出當(dāng)歸補血治療RA 涉及AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α、MMP9 等多個核心靶點以及PI3KAkt、AGE-RAGE、TNF、MAPK 等多條信號通路。利用分子對接技術(shù)進行初步驗證，結(jié)果顯示當(dāng)歸補血湯主要活性成分槲皮素與3 種核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 都有強烈的結(jié)合活性。初步表明當(dāng)歸補血湯可通過調(diào)節(jié)VEGFA、HIF-1α、MMP9 的表達干預(yù)RA 的疾病進程，發(fā)揮抗RA 作用。

為進一步驗證上述觀點，本研究建立了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用的膠原誘導(dǎo)性（CIA）模型進行體內(nèi)實驗。研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸補血湯干預(yù)后的大鼠關(guān)節(jié)炎評分明顯降低，其關(guān)節(jié)腫脹度明顯改善。此外， Western Blot 結(jié)果顯示，CIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、VEGFA 和MMP9 蛋白表達明顯升高，給予當(dāng)歸補血湯干預(yù)后，大鼠滑膜組織中HIF-1α 蛋白表達下降，對下游靶基因VEGF 的激活效應(yīng)減弱，使VEGFA 表達降低，抑制新生血管的生成，減少血管內(nèi)皮細胞釋放NO，從而降低MMP9 蛋白表達，緩解關(guān)節(jié)炎大鼠的骨破壞，減輕關(guān)節(jié)的損傷，對RA 起到治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析當(dāng)歸補血湯治療RA 的可能作用機制，并通過分子對接技術(shù)預(yù)測結(jié)合體內(nèi)實驗進行驗證。結(jié)果表明，當(dāng)歸補血湯通過影響HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9的表達，抑制RA 血管翳的形成，防止骨破壞，從而對RA 起到治療作用。本研究僅對RA 發(fā)病過程中的核心靶點進行研究，與其相互交聯(lián)的信號通路有待進一步探索，可為后續(xù)研究方向提供參考依據(jù)。