枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌作用機制的網絡藥理學分析

鄺曉嵐，蔡婉娜，馬婷，劉博，徐方方（廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510006）

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，根據不同的組織形態(tài)學和病理學表現可將其分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），其中非小細胞肺癌占肺癌病例的75%～80%[1]。超過80%的非小細胞肺癌患者被確診時已處于中晚期，5 年生存率僅為15%[2]。目前非小細胞肺癌的治療仍以手術、放療和化療為主，但其復發(fā)率及轉移率高，且存在術后并發(fā)癥、藥物不良反應和耐藥性等問題[3]。中藥具有多成分、多靶點的治療特點，在改善肺癌患者臨床癥狀、提高生存質量以及延長患者生存期等方面具有獨特的優(yōu)勢[4]。因此，探尋非小細胞肺癌的中醫(yī)藥治療方法具有重要意義。

中藥枳椇為枳椇屬鼠李科植物，該屬植物主要包括北枳椇（HoveniadulcisThunb．）、枳椇（Hovenia acerbaLindl.）以及毛果枳椇（HoveniatrichocarpaChun et Tsiang）等[5]。枳椇屬植物入藥部位為果實、木汁和木皮，其主要成分為黃酮類、三萜類以及苯丙素類[6]。研究[7]表明，枳椇子提取物具有較強的抗腫瘤活性。枳椇子95%乙醇提取物對人非小細胞肺癌A549 細胞的體外增殖具有良好抑制效果[8]；枳椇子水提物能抑制H22 小鼠腫瘤組織生長[9]；枳椇屬三萜類成分hovenidulciosides C 能抑制A549 細胞中Nrf2 的表達[10]。Nrf2 的高表達不僅與腫瘤惡性程度相關，也與腫瘤TNM 分期、淋巴結轉移及遠處轉移密切相關[11-12]。上述研究提示，枳椇屬三萜類成分具有治療非小細胞肺癌的潛力。故本研究擬采用網絡藥理學方法及分子對接技術探討枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的關鍵成分及作用機制，以期為非小細胞肺癌的臨床治療及藥物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 枳椇屬三萜類活性成分虛擬篩選 利用TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php/）結合相關文獻數據庫檢索、匯總枳椇屬三萜類化合物。通過Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載枳椇屬三萜類化合物的結構，數據庫中未收載的成分使用Chemdraw V19.0 軟件繪制，并以sdf 格式保存。使用Discovery Studio 軟件計算各化合物的“類藥性”參數，篩選出符合Lipinski “類藥五法則”[13]的化學成分作為枳椇屬三萜類活性成分。

1.2 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點獲取 使用Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）檢索“1.1”項下篩選出的枳椇屬三萜類活性成分的作用靶點，選擇物種為“Homo sapiens”。以“Non-small cell lung cancer”為檢索詞，使用GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb等疾病數據庫[14]檢索、合并、去重后，得到非小細胞肺癌疾病相關靶點。使用UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org）對上述靶基因名稱進行確認和校正。將枳椇屬三萜類活性成分作用靶點、非小細胞肺癌疾病相關靶點上傳至韋恩繪圖平臺（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到二者的交集靶點（共同靶點），作為枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點。

1.3 潛在作用靶點的蛋白互作（PPI）網絡構建 將“1.2”項下的交集靶點在線導入STRING 平臺（https://string-db.org），設定物種為“homo sapiens”、 閾值≥0.900，獲取枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點的PPI 網絡關系。將結果下載為“tsv”格式文件，并導入Cytoscape V3.8.2 軟件中構建PPI 網絡，使用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 插件（V2.1.6）進行核心靶點篩選。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 使用R 4.0.3軟件中的“clusterProfiler”程序包對枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的核心靶點進行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細胞組分（Cellular component，CC）。結果根據閾值P＜0.05 進行篩選，對所得條目以氣泡圖進行展示，分析枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用機制。將篩選出的活性成分、核心靶點以及KEGG 通路（前20 條）通過Excel 軟件建立相互作用關系，并使用Cytoscape V3.8.2 軟件構建“活性成分-核心靶點-潛在通路”網絡。

1.5 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌核心靶點的生物信息學預測 肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）及大細胞癌是非小細胞肺癌最常見的3 種病理類型，其中肺腺癌和肺鱗癌是非小細胞肺癌的主要亞型，約占70%[15]。因此利用Ualcan 數據庫（https://ualcan.path.uab.edu）獲得核心靶點在肺腺癌或肺鱗癌中的表達情況并進行相關分析。對正常組織與肺腺癌或肺鱗癌組織的核心靶點表達差異分析采用獨立樣本t檢驗（以P＜0.05 為差異有統計學意義）。

通過Kaplan-Meier Plotter 在線數據庫（https://kmplot.com/analysis/）進行生存分析，在工具欄“mRNA”中選擇“Lung cancer”，選擇“Auto select best cutoff”作為診斷分界點的確定條件，分析核心靶點對非小細胞肺癌患者5 年生存率的影響。采用用log-rank 檢驗分析核心靶點的表達水平與肺癌患者生存之間的相關性（以P＜0.05 為差異有統計學意義）。

1.6 分子對接驗證 結合生物信息學預測結果，在核心靶點中選取與非小細胞肺癌關聯性較高的4 個靶點作為受體，分別與潛在活性成分進行分子對接驗證。從UniProt 數據庫中檢索靶點的3D 結構，選擇已被驗證且物種為“Human”的靶點，并以PDB 格式保存；使用Pymol 軟件中的GetBox 插件獲得靶點的活性位點，并對蛋白進行去水、去配體、加氫等處理；聯合使用AutoDock Vina 及R 軟件進行分子對接結合能計算，得到結合能最低的分子構型。

2 結果

2.1 枳椇屬三萜類活性成分 通過TCMSP 數據庫結合相關文獻數據庫檢索共獲得42 個三萜類成分，通過Discovery Studio 軟件計算各化合物的“類藥性”參數，篩選出符合Lipinski “類藥五法則”的枳椇屬三萜類活性成分4 個，結果見表1。

表1 枳椇屬三萜類活性成分的類藥性參數Table 1 Drug-likeness parameters of active components of Hovenia triterpenoids

2.2 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點 通過Swiss Target Prediction 數據庫共預測得到4 個枳椇屬三萜類活性成分的285 個作用靶點。通過GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb 數據庫檢索、篩選、去重得到5 916 個非小細胞肺癌的疾病相關靶點。通過韋恩分析（見圖1），得到非小細胞肺癌的疾病相關靶點與枳椇屬三萜類活性成分作用靶點的共同靶點（交集靶點）186 個，即枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點。

圖1 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點Figure 1 Potential therapeutic targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

2.3 潛在作用靶點的PPI 網絡 通過STRING 數據庫進行186 個交集靶點的PPI 分析，并將結果導入Cytoscape（V3.8.2）軟件構建PPI 網絡。利用CytoNCA（V2.1.6）插件工具通過2 次篩選，共獲得核心靶點12 個，見圖2。核心靶點包括STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2、 MAPK3、 MAPK1、 AKT1、 JAK1、 JAK2、EGFR、MAPK14 和IL2，上述靶點可能在枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌中起到關鍵作用。

圖2 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的核心靶點篩選流程Figure 2 Screening flow chart of core potential targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

2.4 GO 功能及KEGG 信號通路富集分析 結果見圖3。枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點涉及1 161 個BP 條目，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶信號（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、蛋白激酶活性的激活（activation of protein kinase activity）和磷脂酰肌醇介導的信號傳導（phosphatidylinositol-mediated signaling）等；39 個CC條目，主要包括局部粘連（focal adhesion）、細胞-基質連接（cell-substrate junction）、質膜筏（plasma membrane raft）等；72 個MF 條目，主要包括磷酸酶結合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）和MAP 激酶活性（MAP kinase activity）等；前20 條KEGG 信號通路主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、癌癥中PD-L1 表達及PD-1 檢查點途徑（PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer）、JAK-STAT 信號通路（JAKSTAT signaling pathway）等。

圖3 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 3 GO and KEGG pathway enrichment analysis of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

將篩選出的活性成分、核心靶點以及KEGG 通路（前20 條）通過Cytoscape（V3.8.2）軟件構建“活性成分-核心靶點-潛在通路”網絡，見圖4。該網絡由35 個節(jié)點（包括4 個關鍵成分、11 個核心靶點、20 條通路）和186 條邊構成?；衔顲eanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 的度值分別為2、3、5、9，STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2等多個靶點均與Saponin H 相連，提示其可能是治療非小細胞肺癌的關鍵枳椇屬三萜類成分。

圖4 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的“活性成分-核心靶點-潛在通路”網絡Figure 4 “Active components-core targets-potential pathways”network diagram of Hovenia triterpenoids in the treatment of nonsmall cell lung cancer

2.5 核心靶點在非小細胞肺癌中的表達情況及對患者生存率的影響 通過Ualcan 在線工具分析了TCGA數據庫中515 例肺腺癌組織與59 例正常組織、503 例肺鱗癌組織與52 例正常組織中STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 的表達情況，結果見圖5。與正常肺組織相比，SRC 的表達水平在肺腺癌和肺鱗癌中均明顯升高（P＜0.05），STAT3 及GRB2 的表達水平則明顯降低（P＜0.05）；而PIK3CA 在肺腺癌中的表達水平相較于正常肺組織明顯降低（P＜0.05），在肺鱗癌中的表達水平則明顯升高（P＜0.05）。

圖5 核心靶點在正常組織與肺腺癌/肺鱗癌中的表達情況比較Figure 5 The core targets expression in normal lung tissue compared with LUAD or LUSC tissue

采用Kaplan-Meier Plotter 數據庫評估核心靶點STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 對肺癌患者5 年生存率的影響，生存分析結果見圖6。結果提示，SRC［HR=1.47（1.21-1.79），P＜0.05］低表達、PIK3CA［HR=0.86（0.75-0.99），P＜0.05］及GRB2［HR=0.51（0.43-0.61），P＜0.05］高表達的肺癌患者5 年生存率更高。

圖6 核心靶點對肺癌患者5 年生存率的影響Figure 6 Effect of core targets expression on the 5-year overall survival of lung cancer patients

2.6 分子對接結果 結果見表2。將4 個活性成分與核心靶點STAT3、SRC、PIK3CA 和GRB2 分別進行分子對接，預測其結合能力。一般來說，結合能低于-4.25 kcal·mol-1表明小分子對蛋白質具有特異性結合活性，低于-5.0 kcal·mol-1表明結合活性較好，低于-7.0 kcal·mol-1說明有強結合活性[16]。結果顯示，4 個活性成分與4 個度值最高的核心靶點結合能均小于-4.25 kcal·mol-1，表明結合能力良好，其中Jujubogenin、Saponin H 與PIK3CA 的結合能最低（-8.7 kcal·mol-1），存在極強結合能力。

表2 枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的活性成分與核心靶點分子對接結果Table 2 Molecular docking results of active components-core targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer

3 討論

本研究以多個數據庫為基礎，采用網絡藥理學方法和分子對接技術篩選出Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 等化合物，可能是枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的活性物質。其中， Ceanothetric acid 具有抗微生物活性[17]；Jujubogenin（酸棗仁皂苷元）是酸棗仁皂苷A、B、B1的皂苷元[18]。研究[19]表明，酸棗仁皂苷A 可以通過激活Fat4-HIPPO-YAP 通路，誘導A549 細胞衰老和凋亡，并且能抑制肺癌細胞增殖，從而發(fā)揮治療非小細胞肺癌的作用。

通過對潛在作用靶點的PPI 網絡進行2 次篩選，獲得STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等12 個核心靶點。STAT3 是一種促進細胞增殖與存活的原癌蛋白，可被不同細胞因子激活[20]。正常組織中STAT3為非活化狀態(tài)，而在腫瘤細胞中被異常激活而過度表達[21]，活化的STAT3 會影響細胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理病理過程[22]。研究[23]表明，槐花-金銀花配伍能通過抑制STAT3 信號通路，進而抑制免疫抑制細胞因子的激活，增強免疫反應，顯著抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長。SRC 是第一個被發(fā)現的原癌基因，在許多細胞類型中廣泛表達[24]，抑制SRC 可以下調非小細胞肺癌細胞中MMP-2/9 的表達[25]，而MMP-2/9 的過度表達與肺癌患者的不良預后密切相關[26]。PIK3CA 在非小細胞肺癌患者中的突變率為14.1%，且PIK3CA 突變可激活腫瘤細胞中的Akt 信號通路，促進腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移[27]。GRB2 是酪氨酸激酶受體信號通路中的重要樞紐蛋白，可介導多條信號通路的激活，干擾細胞中GRB2的表達能顯著抑制A549 細胞的增殖[28]，且GRB2 還可通過激活Akt 信號通路和上調MMP-2/9 的活性來促進非小細胞肺癌的遷移[29]。

KEGG 通路分析結果顯示，枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用靶點主要涉及EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、癌癥中PD-L1 表達及PD-1檢查點途徑、JAK-STAT 信號通路等相關通路。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）廣泛應用于含有EGFR 激活突變的非小細胞肺癌患者的治療，但是大多數患者易產生耐藥性[30]，因而調控EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路，有利于非小細胞肺癌患者的治療。JAK-STAT 是EGFR-TKIs 作用后觸發(fā)的下游信號轉導通路之一，其通過刺激有絲分裂導致細胞增殖和抑制凋亡[31]。PD-1/PD-L1是一種重要的免疫抑制分子，以PD-1/PD-L1 抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑（ICIs）的應用能夠有效延長肺癌患者的生存期，相較于化療患者，經ICIs治療的非小細胞肺癌晚期患者的5 年生存率提高5 倍以上[32]。

綜上所述，枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的潛在作用機制可能是通過Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin、Saponin H 4 種關鍵活性成分，作用于STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等核心靶點，通過EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、癌癥中PD-L1 表達及PD-1 檢查點途徑，以及JAK-STAT信號通路等抵抗EGFR-TIKs 耐藥性及調節(jié)免疫功能的相關信號通路實現的。然而，網絡藥理學技術是基于現有數據庫進行的計算推測，相關結果仍需進一步的生物學驗證。本研究初步探討了枳椇屬三萜類成分治療非小細胞肺癌的分子機制，可為其臨床應用及非小細胞肺癌的新藥研發(fā)提供參考。