芪仙湯對苯并芘加劇哮喘小鼠氣道炎癥及黏液高分泌的影響及機制研究

孫亦鵬，倪振華，劉金金，王雄彪（上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)呈逐年上升趨勢[1]。大氣污染是哮喘發(fā)病的獨立危險因素[2]，其不僅可誘發(fā)和加重哮喘的癥狀、降低肺功能、提高住院率[3]，還可導致哮喘患者出現(xiàn)激素抵抗[4]。苯并芘（BaP）是大氣污染物中常見的、毒性最大的物質(zhì)之一[5]。BaP 暴露可顯著增加兒童的哮喘患病風險[6]，還可誘導哮喘模型肺組織中白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素13（IL-13）的分泌，加劇氣道高反應(yīng)性[7-10]。本課題組前期研究[11]也發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導氣道上皮細胞黏液分泌增加。因此，以BaP 為代表的大氣污染物可通過誘導炎癥浸潤和黏液分泌加劇哮喘肺損傷。而目前尚缺乏針對大氣污染誘發(fā)和加重哮喘的有效治療方案。芪仙湯是本課題組王雄彪教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)的自擬方，臨床試驗和基礎(chǔ)實驗均顯示其具有良好的抗哮喘作用[12-15]。體外實驗[16]發(fā)現(xiàn)，芪仙湯提取物可下調(diào)BaP 誘導的氣道黏蛋白5AC（MUC5AC）高表達。然而在動物體內(nèi)，芪仙湯能否改善BaP 誘導的哮喘氣道炎癥浸潤和黏液分泌尚不清楚。因此，本研究擬以卵蛋白（OVA）致敏法復(fù)制哮喘小鼠模型，以BaP 暴露法模擬大氣污染，觀察芪仙湯對BaP 加劇哮喘小鼠氣道炎癥和黏液分泌的影響，以及對活性氧（ROS）和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白的作用，以期闡釋其抗肺損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 動物4 周齡雌性BALB/c 小鼠40 只，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0002。動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院動物房，動物使用許可證號：SYXK（滬）2018-0032。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批文號：DWEC-A-201804001。

1.2 藥物及制備芪仙湯由黃芪30 g、仙靈脾30 g、巴戟天30 g、虎杖30 g、川芎15 g、旋覆花9 g、枇杷葉30 g、生地黃30 g 組成，購于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，所有藥材經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院藥學部袁易主任藥師鑒定均為正品。芪仙湯按常規(guī)方法煎煮，水煎液過濾、濃縮至含生藥1.5 g·mL-1，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑OVA（批號：9006-59-1）、硫酸鋁鉀（批號：7784-24-9）、BaP（批號：B1760），均購自美國Sigma 公司；HE 染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：C0105S；RNA 提取試劑盒，美國Zymo Research 公司，批號：R2052；TRIzol 試劑盒（批號：9109）、PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：RR047）、TB Green PCR 反應(yīng)液（批號：RR420），均購自日本Takara 公司；AB-PAS 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號：G1285；MUC5AC 抗體，美國Abcam 公司，批號：ab79082；p-ERK 抗體，美國CST 公司，批號：4370；兔IgG 免疫組化試劑盒，武漢博士德公司；ROS 檢測試劑盒，南京建成生物工程公司，批號：E004-1-1。致敏液：將10%硫酸鋁鉀溶液與500 μg·mL-1的OVA 溶液等比例混勻，用氫氧化鈉溶液將pH 值調(diào)至6.5，室溫下靜置1 h，離心、棄上清，在余下沉淀中加入生理鹽水至初始體積即得；激發(fā)液：2 mg·mL-1的OVA 溶液。

1.4 主要儀器EG1150 型石蠟組織包埋機、RM2335型病理切片機、ST5010 型病理染色機、CV5030 型全自動玻璃蓋片機，德國Leica 公司；BX43 型顯微鏡，日本Olympus 公司；T100 型梯度PCR 儀器，美國伯樂公司；ViiA7 型Real-time PCR 擴增儀，美國Applied Biosystems 公司；Countess 3 型全自動細胞計數(shù)儀、Varioskan LUX 型多功能酶標儀，美國Thermo公司。

1.5 模型復(fù)制、分組、給藥及樣本采集小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將其隨機分為：空白組、哮喘組（OVA）、BaP 組（OVA+BaP）和芪仙湯組（OVA+BaP+芪仙湯37.5 g·kg-1），每組10 只。OVA 致敏小鼠于第1 天和第15 天腹腔注射致敏液200 μL，并于第15、26、27、28 天麻醉后滴鼻激發(fā)液50 μL，空白組用生理鹽水作為對照[17]。BaP 暴露小鼠于第16 天開始滴鼻BaP 溶液30 μL（320 μmol·L-1），每2 日1 次，共7 次[18]。按照人和動物體表面積折算的等效劑量確定小鼠每日芪仙湯的給藥劑量為37.5 g·kg-1；芪仙湯組小鼠于第16 天開始灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)13 d，灌胃前將藥液加熱至37 ℃；其他各組用生理鹽水灌胃。于第28 天取材，眼球失血法處死小鼠，剪去雙側(cè)肺外緣肺泡組織約2 mm，將左肺用福爾馬林固定以行病理染色；右肺尖葉和心葉用于ROS 檢測，右肺膈葉和中間葉用于RNA 提取?？瞻捉M、哮喘組、BaP 組和芪仙湯組未完成全程實驗的小鼠數(shù)量分別為1、2、4、2 只。

1.6 HE 染色法檢測肺組織病理形態(tài)學變化左肺標本經(jīng)固定后，組織脫水，然后進行石蠟包埋、切片、烤片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察，并對肺組織炎癥浸潤程度進行評分[19]。

1.7 AB-PAS 染色法檢測肺組織黏液分泌小鼠左肺切片脫蠟至水，蒸餾水洗2 min；阿利新藍染色20 min，蒸餾水洗3 次，每次2 min；滴加氧化劑5 min，蒸餾水浸洗2 次；Schiff Reagent 浸染20 min，自來水流水沖洗10 min；蘇木素染核5 min，水洗；酸性分化液分化2 s，水洗；Scott 藍化液返藍，水洗3 min；室溫下晾干，二甲苯透明，封片；鏡下觀察、拍照，采用Image Pro Plus 軟件測量黏液陽性區(qū)域面積并進行統(tǒng)計分析。

1.8 免疫組化法檢測肺組織MUC5AC、p-ERK 蛋白表達小鼠左肺切片經(jīng)過烤片、脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液煮沸進行抗原修復(fù)10 min，用PBS 沖洗3 次。5% BSA 封閉30 min，滴加一抗，置于4 ℃冰箱內(nèi)，過夜。第2 天，PBS 沖洗3 次，滴加兔IgG 二抗，37 ℃下孵育60 min，PBS 沖洗3 次；滴加SABC 50 μL，37 ℃下孵育20 min，PBS 沖洗3 次；DAB染色，蘇木素染核；鏡下觀察、拍照，采用Image Pro Plus 軟件計算積分光密度（IOD）值，并測量面積（Area），以IOD/Area 值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 qRT-PCR 法檢測肺組織IL-4、IL-13 mRNA表達取適量小鼠右肺組織，按RNA 提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，檢測RNA 濃度、純度。采用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保持。然后進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、5 s，95 ℃、30 s，60 ℃、34 s，共40 個循環(huán)。分析擴增曲線，計算Ct 值；以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算各組間目的基因的表達水平差異。引物合成由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tabel 1 Primer sequences for PCR

1.10 DCFH-DA 探針法檢測肺組織ROS 水平將新鮮右肺組織剪成1 mm3大小的組織塊，在37 ℃下酶解25 min 后，用尼龍網(wǎng)收集單細胞懸浮液；將細胞重懸于含有DCFH-DA（10 μmol·L-1）的PBS 中，37 ℃下孵育30 min；然后用酶標儀在激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長525 nm 下檢測，所得光密度（OD）值即作為熒光強度。

1.11 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織炎癥的影響結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，與空白組比較，哮喘組小鼠的氣道、血管周圍炎癥細胞明顯增多，氣道黏膜出現(xiàn)中斷、不連續(xù)，炎癥評分顯著升高（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠的炎癥細胞浸潤進一步加劇，肺泡間隔斷裂明顯，炎癥評分顯著升高（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠的炎癥細胞浸潤、氣道黏膜連續(xù)性均明顯改善，炎癥評分顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯能夠減輕BaP 暴露哮喘模型小鼠的肺組織炎癥。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果（HE 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 1 Results of HE staining in lung tissue of mice in different groups（HE staining，×200；±s，n=6-9）

2.2 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達的影響結(jié)果見圖2。與空白組比較，哮喘組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達明顯上調(diào)（P＜0.05）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠肺組織IL-4、IL-13 mRNA 表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織Th2 型細胞因子表達具有抑制作用。

圖2 各組小鼠肺組織的IL-4、IL-13 mRNA 表達（±s，n=6～9）Figure 2 The mRNA expressions of IL-4 and IL-13 in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.3 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏液分泌的影響結(jié)果見圖3。與空白組比較，哮喘組小鼠的氣道黏液分泌顯著增多（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠的氣道黏液顯著增多（P＜0.01）；與BaP組比較，芪仙湯組小鼠的氣道黏液分泌顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏液分泌具有抑制作用。

圖3 各組小鼠肺組織黏液分泌染色情況（AB-PAS 染色，×200；±s，n=6～9）Figure 3 The mucus secretion in lung tissue of mice in different groups（AB-PAS staining，×200；±s，n=6-9）

2.4 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道MUC5AC蛋白表達的影響結(jié)果見圖4。與空白組比較，哮喘組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠氣道MUC5AC 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道黏蛋白表達具有抑制作用。

圖4 各組小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達情況（免疫組化，×400；±s，n=6～9）Figure 4 The protein expression of MUC5AC in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

2.5 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織ROS 的影響結(jié)果見圖5。與空白組比較，哮喘組小鼠肺組織ROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠肺組織ROS 水平顯著升高（P＜0.01）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠肺組織ROS 水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其降低ROS 水平有關(guān)。

圖5 各組小鼠肺組織的ROS 水平（±s，n=6～9）Figure 5 Detection of ROS content in lung tissue of mice in different groups（±s，n=6-9）

2.6 芪仙湯對BaP 暴露哮喘模型小鼠氣道p-ERK 表達的影響結(jié)果見圖6。與空白組比較，哮喘組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與哮喘組比較，BaP 組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05）；與BaP 組比較，芪仙湯組小鼠氣道p-ERK 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其抑制ERK 通路有關(guān)。

圖6 各組小鼠肺組織p-ERK 蛋白表達（免疫組化，×400；±s，n=6～9）Figure 6 The protein expression of p-ERK in lung tissue of mice in different groups（IHC，×400；±s，n=6-9）

3 討論

中醫(yī)醫(yī)家認為大氣污染病邪性質(zhì)當屬污穢之氣、陰邪、霧露兼夾污濁[20]。蒼天之氣，清凈則志意治，外邪犯肺，肺氣消散不及，邪毒壅塞于肺，阻滯氣機，發(fā)為哮病[21]，故污穢之氣與哮病密切相關(guān)。且肺朝百脈，污穢之氣久侵肺臟，日久而致肺氣不足，無力行血，則血液瘀滯，肺氣不得肅降發(fā)為哮?。煌庑安荒塥殏?，必因正氣不足，無力抵御污穢之氣。肺主呼氣，腎主納氣，腎虛無以納氣則喘；脾胃虛弱，土不生金，則肺失所養(yǎng)，脾腎虛弱可導致哮病[22]。因此，可將“污穢之氣”歸結(jié)為誘發(fā)哮病的外因，而“脾腎陽虛”則歸結(jié)為內(nèi)因。故中醫(yī)治療大氣污染誘發(fā)的哮喘應(yīng)以“補益脾腎、化瘀祛邪”之法。芪仙湯是由“二仙湯”化裁而來的臨床經(jīng)驗方，具有補益脾腎，活血化瘀之功效，對治療大氣污染相關(guān)哮喘具有理論依據(jù)。

氣道炎癥是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機制之一，BaP 能通過多種誘導炎癥機制加劇哮喘的肺損傷。研究發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導OVA 小鼠血液中產(chǎn)生更多的IgE 及嗜酸性粒細胞，并在肺部組織中分泌多種炎癥細胞因子[8-10]；可增強骨髓中樹突狀細胞抗原提呈能力[7]；可誘導CD8+T 細胞、單核/巨噬細胞和NK-T 細胞在肺組織中浸潤[18]，從而加劇哮喘的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，芪仙湯可抑制BaP 加劇的哮喘小鼠肺部炎癥，抑制Th2 型細胞因子的分泌。

黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理學改變，是哮喘病情惡化的重要原因[23]。黏蛋白是黏液的主要組成部分，其中MUC5AC 與哮喘關(guān)系最密切，基因敲除MUC5AC 不僅可抑制哮喘氣道炎癥，還可緩解哮喘的氣道高反應(yīng)[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BaP 可誘導氣道上皮細胞MUC5AC 表達量增加[11]，而芪仙湯提取物可抑制BaP 誘導的MUC5AC 表達上調(diào)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪仙湯對BaP 誘導的哮喘小鼠氣道黏液分泌具有顯著改善作用，并能抑制小鼠氣道黏蛋白表達。研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，中藥地黃中的梓醇和虎杖中的白藜蘆醇均可抑制哮喘小鼠黏液分泌，抑制MUC5AC 表達，芪仙湯的藥理作用可能與此有關(guān)。

氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病機制中具有重要作用，也是大氣污染加劇哮喘的原因之一。大氣污染物可抑制哮喘小鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，從而提高ROS 水平[27]。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，在BaP 誘導肺上皮細胞MUC5AC 高表達的機制中與線粒體ROS 有關(guān)，而白藜蘆醇可抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生。此外，多種中藥單體均具有抗氧化作用，如川芎嗪可通過提高SOD 水平抑制ROS 的產(chǎn)生[28]；黃芪甲苷Ⅳ可通過抑制線粒體鈣超載降低線粒體ROS 水平[29]；淫羊藿苷可抑制細胞ROS 的產(chǎn)生，從而緩解順鉑的細胞毒性[30]。本研究結(jié)果表明，芪仙湯可抑制BaP 暴露哮喘模型小鼠肺組織中ROS產(chǎn)生，可能與芪仙湯含有上述抗氧化活性成分有關(guān)。

ERK 是信號通路中的重要激酶，可調(diào)節(jié)人體內(nèi)細胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等生理病理過程。ERK 通路的過度激活可導致癌癥、炎癥等多種疾病[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，ERK 通路在哮喘模型小鼠肺組織內(nèi)異常激活，抑制ERK 通路可顯著減弱其肺組織嗜酸性粒細胞浸潤、黏液產(chǎn)生、炎癥因子釋放、氣道平滑肌收縮和氣道高反應(yīng)性。本研究也發(fā)現(xiàn)，芪仙湯改善BaP 暴露引起的哮喘模型小鼠肺損傷的作用可能與其抑制ERK 通路有關(guān)。

綜上所述，芪仙湯能夠改善大氣污染物BaP 加劇的哮喘肺部炎癥、黏液分泌，具有較好的抗肺損傷作用，其機制可能與抑制ROS 及ERK 通路有關(guān)。