搜風(fēng)愈喘方基于ERK/p38MAPK信號(hào)通路對(duì)支氣管哮喘模型大鼠氣道炎癥的作用機(jī)制探討

李牧瑤，陳晨，郭旭冉，張宇婧，梁磊，閆永彬，2，鄭海濤，2（.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞與細(xì)胞組分參與的以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、呼吸困難、胸悶、氣促、咳嗽等[1]。本病的發(fā)生與遺傳、變應(yīng)原、空氣污染、呼吸道感染等多種因素有關(guān)，調(diào)查[2]顯示，哮喘的平均患病率呈逐年上升趨勢(shì)，尤以兒童發(fā)病率最高，已成為兒童最常見的慢性呼吸道疾病[3]。本病若未能及時(shí)治療，癥狀可隨疾病進(jìn)展而加重，嚴(yán)重影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育及學(xué)習(xí)生活，且造成嚴(yán)重的醫(yī)療衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。目前，在國(guó)內(nèi)外哮喘最新指南中，糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為是治療哮喘的一線用藥，雖然能夠緩解哮喘癥狀，但不良反應(yīng)較多，對(duì)于生長(zhǎng)發(fā)育期的患兒，長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素可影響哮喘患兒的鈣磷平衡、骨膠原代謝，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育[4]。

中醫(yī)藥對(duì)哮喘的研究歷史悠久，并形成了較為完善的理論體系。河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院閆永彬教授長(zhǎng)期從事于兒童呼吸及感染性疾病方向的研究，基于“久病入絡(luò)”“暗瘀”學(xué)說(shuō)提出“伏風(fēng)暗瘀宿痰”的哮喘中醫(yī)病機(jī)新說(shuō)[5]，認(rèn)為伏風(fēng)為哮喘發(fā)作之誘因，暗瘀為其纏綿之禍?zhǔn)?，宿痰為?fù)發(fā)之根源，三者合之，致使氣道痙攣而發(fā)病，且遷延難愈，并基于此創(chuàng)立祛風(fēng)、化痰、活血法三法并行的搜風(fēng)愈喘方，且在臨床取得較好的療效[6]。課題組前期初步證實(shí)了搜風(fēng)愈喘方可通過(guò)調(diào)控白細(xì)胞介素（IL）-13、IL-25、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抑制哮喘氣道重塑的作用[7]；并通過(guò)拆方理論證實(shí)搜風(fēng)愈喘方拆方“祛宿痰方”可通過(guò)抑制NF-κB、PI3K-AKT、IL-17 信號(hào)通路的激活，從抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)等途徑作用于哮喘[8]。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）和p38 絲裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK）是MAPKs 信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要通路，可通過(guò)激活和釋放促炎細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)[9-10]。氣道炎癥反應(yīng)與杯狀細(xì)胞化生、黏液分泌增多有關(guān)，IL-13能夠與人支氣管上皮直接相互作用，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生，促進(jìn)黏液分泌，其過(guò)程涉及ERK、p38MAPK和PI3K 信號(hào)傳導(dǎo)途徑[11]，而Th2 細(xì)胞因子的明顯下降或氣道上皮組織中p38MAPK 的表達(dá)下調(diào)可抑制黏液的分泌和炎癥的浸潤(rùn)[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)p38MAPK 在過(guò)敏性氣道疾病中作用于NF-κB 信號(hào)通路的上游，可調(diào)節(jié)IL-4、IL-13、TNF-α 等多種炎性因子。

本研究擬在前期研究[7-8]基礎(chǔ)上，通過(guò)建立哮喘大鼠模型，基于ERK/p38MAPK 信號(hào)通路，從炎癥角度以及氣道組織結(jié)構(gòu)變化入手，進(jìn)一步探討搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥精準(zhǔn)施治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量為（150±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110322211102551612，于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF 屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：DWLL2021011006。

1.2 藥物及試劑搜風(fēng)愈喘方（白僵蠶、蟬蛻、地龍、橘絡(luò)、紅花、黨參、山楂、萊菔子、炙麻黃、杏仁、炙枇把葉、礞石、甘草），中藥飲片均購(gòu)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定學(xué)科代麗萍副教授鑒定合格；卵清白蛋白（OVA），美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：A5503；氫氧化鋁佐劑，美國(guó)賽默飛公司，批號(hào)：WG325422；醋酸地塞米松片，上?？肆种扑幑煞萦邢薰?，規(guī)格：每片0.75 mg，批號(hào)：2010072；鹽酸氯胺硐注射液，福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H 35020148；4%多聚甲醛，北京蘭杰柯公司，批號(hào)：BL539A；大鼠IL-13、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技公司，批號(hào)：G2DNUCZNPF，EELR2856c；p-p38 抗體，美國(guó)CST公司，貨號(hào)：2859；ERK、p-ERK 抗體，武漢三鷹生物技術(shù)公司，貨號(hào)分別為：1157-1-AP、28733-1-AP；p38MAPK，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：ab32142；總RNA 提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20210513。

1.3 儀器NE-C28P 壓縮霧化器，歐姆龍中國(guó)有限公司；GNP-9080BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械；HBS-4009 全自動(dòng)洗板機(jī)，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RT-6100 酶標(biāo)儀，美國(guó)Rayto 公司；TL-988 熒光定量PCR 儀，西安天隆科技有限公司；D3024R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；SVE-2 垂直電泳儀，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 藥物制備搜風(fēng)愈喘方用純凈水浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min，倒出藥液、過(guò)濾；殘?jiān)鼜?fù)煎1 次，倒出藥液。將2 次水煎液混合，置70 ℃恒溫水浴，濃縮藥液至0.63 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分組及模型復(fù)制將32 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為4 組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、搜風(fēng)愈喘方組，每組8 只。除正常對(duì)照組外，其余各組均建立哮喘大鼠模型[14]，具體如下：實(shí)驗(yàn)第l 天及第7 天，10% OVA 及氫氧化鋁佐劑復(fù)合液1 mL，五點(diǎn)注射致敏；實(shí)驗(yàn)第14 至第28 天，給予1% OVA 霧化吸入25 min 激發(fā)哮喘。觀察并記錄大鼠情況。造模完成后各組隨機(jī)挑選1 只大鼠進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，以大鼠出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸、喘促、口鼻發(fā)紺、煩躁不安、頻繁洗面、噴嚏、精神萎靡等癥狀為造模成功。

1.6 給藥方法造模成功后，繼續(xù)每日給予1% OVA霧化吸入25 min 激發(fā)哮喘，每次霧化吸入激發(fā)前0.5 h 給予藥物干預(yù)，共21 d。地塞米松組每日灌胃0.125 mg·kg-1地塞米松溶液；根據(jù)前期研究[15]結(jié)果，中藥組每日灌胃11.4 g·kg-1搜風(fēng)愈喘方溶液；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每日灌胃等容量生理鹽水。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1觀察大鼠一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、飲食情況及活動(dòng)情況等。

1.7.2血清ELISA 檢測(cè) 大鼠以50 mg·kg-1氯胺酮麻醉后，腹主動(dòng)脈取血8 mL，4 ℃、3 000 r·min-1（離心半徑13 cm）離心10 min 后分離血清，采用ELISA法測(cè)定IL-13、TNF-α 濃度，具體按ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作。

1.7.3支氣管肺泡灌洗液（BALF）ELISA 檢測(cè) 切開大鼠氣管，插管，用一次性注射器取生理鹽水8 mL 作肺泡灌洗，重復(fù)3 次，要求回收率大于75%。每份樣本經(jīng)4 ℃、2 000 r·min-1（離心半徑13 cm）離心10 min，取上清液按ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定BALF 中IL-13、TNF-α 的含量。

1.7.4病理學(xué)觀察 處死大鼠，經(jīng)肺動(dòng)脈插管灌注4%多聚甲醛固定，取肺組織酒精脫水石蠟包埋切片，厚度為5 μm，行蘇術(shù)精伊紅（HE）染色、過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色。光鏡下觀察肺組織氣道炎癥及黏液分泌情況，參照相關(guān)研究[16]評(píng)價(jià)氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況及黏液分泌情況。

1.7.5RT-PCR 法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平 取大鼠肺組織，通過(guò)TRIzol 試劑提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt相對(duì)定量公式計(jì)算。引物序列見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and amplification lengths

1.7.6Western Blot 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK 的表達(dá)水平 取大鼠肺組織，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度后，沸水浴加熱15 min 使其充分變性；經(jīng)電泳將蛋白分離，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜后立即漂洗，加脫脂奶粉室溫下封閉30 min；按照抗體說(shuō)明書稀釋后，加入一抗，4 ℃孵育搖床過(guò)夜，回收一抗；將二抗用TBST 按照1∶5 000 的比例進(jìn)行稀釋，室溫下孵育30 min，經(jīng)顯色、曝光、顯影、定影后，進(jìn)行圖片整理和數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，即采用單因素方差分析。方差不齊，則采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，飲食正常，體質(zhì)量無(wú)明顯變化，皮毛光亮濃密，無(wú)異常分泌物。經(jīng)霧化激發(fā)后，除正常對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳，情緒躁動(dòng)，體質(zhì)量明顯下降，且伴不同程度的呼吸氣促，打噴嚏，搔鼻等行為。經(jīng)藥物干預(yù)后，地塞米松組及搜風(fēng)愈喘方組大鼠精神狀態(tài)、飲食、呼吸急促等癥狀均較模型組明顯改善。

2.2 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α 含量的影響見表2。ELISA 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中IL-13、TNF-α含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組大鼠血清IL-13、TNF-α 含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α含量的影響（±s，n=8）Table 2 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on serum IL-13 and TNF-α content in bronchial asthma rats（±s，n=8）

表2 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠血清中IL-13、TNF-α含量的影響（±s，n=8）Table 2 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on serum IL-13 and TNF-α content in bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05

TNF-α/（pg·mL-1）9.40±0.58 25.69±5.37*17.35±7.50#16.46±3.54#組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組地塞米松組搜風(fēng)愈喘方組IL-13/（pg·mL-1）7.88±1.46 14.22±4.30*9.45±2.18#8.44±1.80#

2.3 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影響見表3。ELISA 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組BALF 中IL-13、TNF-α的水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組大鼠BALF 中IL-13、TNF-α 的水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影響（±s，n=8）Table 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on the contents of IL-13 and TNF-α in alveolar lavage fluid of bronchial asthma rats（±s，n=8）

表3 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺泡灌洗液IL-13、TNF-α 含量的影響（±s，n=8）Table 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on the contents of IL-13 and TNF-α in alveolar lavage fluid of bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05

TNF-α/（pg·mg-1）69.56±30.14 226.12±42.89*149.31±37.67#56.33±38.45#組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組地塞米松組搜風(fēng)愈喘方組IL-13/（pg·mg-1）12.92±4.32 46.52±6.34*26.11±6.78#16.75±6.90#

2.4 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織病理變化的影響見圖1、圖2。HE 染色可見，正常對(duì)照組肺組織學(xué)結(jié)構(gòu)清晰，支氣管黏膜完整，肺泡膨脹良好，肺泡壁未見明顯增厚。模型對(duì)照組支氣管黏膜上皮脫落進(jìn)入管腔，同時(shí)混雜嗜酸性黏液；支氣管黏膜固有層增厚，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁增厚，局部肺泡腔內(nèi)可見巨噬細(xì)胞游出。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肺組織炎癥病變?cè)u(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。搜風(fēng)愈喘方組支氣管黏膜上皮輕微脫落，管腔清晰，滲出物較少；支氣管黏膜固有層炎癥減輕，可見淋巴濾泡增生；周圍肺泡壁輕度增厚。地塞米松組支氣管內(nèi)混有大量嗜酸性滲出物；周圍肺泡壁明顯增厚，偶見肺泡上皮細(xì)胞脫落進(jìn)入肺泡腔。與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組的炎癥病變?cè)u(píng)分均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織病理變化的影響Figure 1 Effect of Soufeng Yuchuan Recipe on pathological changes of lung tissue in bronchial asthma rats

圖2 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織病理評(píng)分的影響（±s，n=8）Figure 2 Effect of Soufeng Yuchuan Recipe on pathological score of lung tissue in bronchial asthma rats（±s，n=8）

PAS 染色可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組可見肺泡壁增厚，支氣管黏膜可見大量杯狀細(xì)胞化生及黏液分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，地塞米松組及搜風(fēng)愈喘方組支氣管黏膜杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表達(dá)變化的影響見表4。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織勻漿中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組大鼠肺組織勻漿中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，搜風(fēng)愈喘方可使哮喘大鼠肺組織勻漿中IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 的mRNA 表達(dá)減少，改善氣道炎癥反應(yīng)。

表4 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表達(dá)的影響（±s，n=8）Table 4 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on expressions of IL-13，ERK1，ERK2 and p38 MAPK genes in lung tissue of bronchial asthma rats（±s，n=8）

表4 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織IL-13、ERK1、ERK2、p38 MAPK 基因表達(dá)的影響（±s，n=8）Table 4 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on expressions of IL-13，ERK1，ERK2 and p38 MAPK genes in lung tissue of bronchial asthma rats（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05

p38MAPK 1.00±0.00 2.64±0.78*1.57±0.39#1.50±0.09#組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組地塞米松組搜風(fēng)愈喘方組IL-13 1.00±0.00 2.54±0.78*1.14±0.86#0.12±0.09#ERK1 1.00±0.00 1.79±0.23*1.21±0.10#121±0.30#ERK2 1.00±0.00 2.14±0.58*1.36±0.05#1.09±0.14#

2.6 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表達(dá)的影響見圖3。Western Blot 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組大鼠肺組織中p-ERK、p-p38 MAPK 的蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組比較，肺組織中p-ERK、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，搜風(fēng)愈喘方可在一定程度上抑制p-ERK、p-p38 MAPK 蛋白的表達(dá)。

圖3 搜風(fēng)愈喘方對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織p-ERK、p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of Soufeng Yuchuan Recipe on protein expressions of p-ERK and p-p38 MAPK in lung tissue of bronchial asthma rats

3 討論

支氣管哮喘是以氣道重塑、氣道炎癥、平滑肌功能紊亂為主要病理改變的慢性氣道炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，通常具有不同的臨床表型。在目前對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)中，氣道炎癥是其本質(zhì)，基本特征是氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR），而氣道重塑是造成哮喘反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的根本原因，它主要是由于反復(fù)慢性炎癥刺激、支氣管彈性損傷導(dǎo)致管壁不可逆性的病理改變[15]。在治療方面，哮喘全球防治創(chuàng)議提出哮喘的治療目標(biāo)在于良好的控制癥狀，維持正常生活水平，減少藥物不良反應(yīng)、急性發(fā)作和死亡[17]。國(guó)內(nèi)外哮喘最新指南中均把糖皮質(zhì)激素作為哮喘治療的一線用藥，但不良反應(yīng)較多，患者依從性較差，對(duì)于其是否可直接或間接通過(guò)減輕炎癥抑制或逆轉(zhuǎn)氣道重塑，目前仍存在爭(zhēng)議，故對(duì)氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制以及藥物干預(yù)的研究尤為重要。崔彬等[18]發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯可從改善氣道炎癥、調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡及神經(jīng)源性因子多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)對(duì)哮喘進(jìn)行干預(yù)。李厚忠等[19]發(fā)現(xiàn)中藥川貝母可通過(guò)抑制MMP-2，MMP-9 和TIMP-1，改善哮喘癥狀。朱穎濤等[20]發(fā)現(xiàn)馬鞭草苷可干預(yù)哮喘大鼠的氣道炎癥及氣道重塑，發(fā)揮抗哮喘的作用。因此，中醫(yī)藥對(duì)氣道調(diào)控作用的積極探索對(duì)支氣管哮喘的臨床施治具有重要意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)將支氣管哮喘歸為“哮證”“喘證”的范疇，并認(rèn)為“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時(shí)之感，膈有膠固之痰”為哮喘的主要病機(jī)。但隨著社會(huì)進(jìn)步，現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)哮喘的病機(jī)有了新的闡釋。閆永彬教授通過(guò)對(duì)中西醫(yī)哮喘理論進(jìn)行研究，提出“伏風(fēng)暗瘀宿痰”的哮喘病機(jī)理論，并創(chuàng)立驗(yàn)效于臨床的祛風(fēng)、化痰、活血法并施的“搜風(fēng)愈喘方”[6]。“知藥不如知方，知方不如守法，守法不如明理”，搜風(fēng)愈喘方正是基于對(duì)哮喘病機(jī)“明理”進(jìn)行的系列研究，方中白僵蠶、蟬蛻、地龍，乃遵葉桂“久則邪正混處其中，草木不能見效，當(dāng)以蟲蟻疏逐”之訓(xùn)，合橘絡(luò)搜風(fēng)通絡(luò)，以搜深伏肺絡(luò)之風(fēng)邪，黨參補(bǔ)氣健脾，和以甘草益氣健脾，助血運(yùn)行；紅花活血消暗瘀；山楂、萊菔子化食消滯；礞石、炙麻黃、杏仁、炙枇把葉化痰降氣以平喘咳。本研究結(jié)果顯示，地塞米松組和搜風(fēng)愈喘方組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的飲食、精神等一般情況比模型對(duì)照組有所改善，肺組織病理?yè)p傷明顯緩解，從宏觀和微觀證實(shí)了搜風(fēng)愈喘方對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的治療作用。

絲裂素活化蛋白激酶家族（MAPKs）是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡及細(xì)胞間功能同步等過(guò)程有重要作用，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中也具有關(guān)鍵性作用[21]。ERK、JNK 及p38MAPK 均是MAPKs 信號(hào)通路中的關(guān)鍵成員，其磷酸化可以激活包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種效應(yīng)蛋白[22]。p38MAPK 是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，可加重炎癥細(xì)胞在炎癥部位的聚集，繼而加劇炎癥反應(yīng)。TNF-α 作為一種多功能炎性因子，與p38 通路激活密切相關(guān)[23]。研究[24-25]發(fā)現(xiàn)TNF-α 可通過(guò)激活信號(hào)通路p38MAPK，致中心粒細(xì)胞大量趨化、黏附、集聚于氣道黏膜以及肺組織，加重氣道局部損傷及血管內(nèi)皮損傷，從而加重慢性氣道炎癥，而活化的p38MAPK 激活的信號(hào)通路會(huì)產(chǎn)生大量TNF-α，進(jìn)而再次推動(dòng)p38MAPK 信號(hào)通路的活化，形成正反饋循環(huán)。ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是體內(nèi)多種信號(hào)通路的匯合點(diǎn)，其作用主要是介導(dǎo)細(xì)胞的增殖與分化。氣道重塑可由ERK 長(zhǎng)期反復(fù)磷酸化引起的生長(zhǎng)和增殖有關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)形成[26]。IL-13 在哮喘的氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可通過(guò)遺傳基因、受體復(fù)合物、信號(hào)通路來(lái)對(duì)哮喘的發(fā)病進(jìn)行調(diào)控[27]。ERK1/2 可在以不依賴于STAT6 的方式被IL-13激活，從而促進(jìn)IL-13 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞重塑，因此ERK1/2 調(diào)節(jié)因子可能有助于治療IL-13 誘導(dǎo)的疾病[28]。Duan 等[29]發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織中P-ERK 的表達(dá)明顯增高，劉先勝等[30]發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠T 淋巴細(xì)胞ERK 的表達(dá)和活性上調(diào)，IL-13 蛋白水平上升，ERK參與了Th2 細(xì)胞IL-13 的調(diào)控。本研究中搜風(fēng)愈喘方組大鼠血清及BALF 中IL-13 和TNF-α 的含量明顯降低，肺組織中ERK、p38MAPK 的基因表達(dá)明顯下降，由此可推測(cè)搜風(fēng)愈喘方是通過(guò)ERK/p38MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道炎癥的干預(yù)作用。

綜上所述，在支氣管哮喘大鼠模型中，搜風(fēng)愈喘方可以明顯抑制炎癥因子的釋放，這可能與其抑制ERK 和p38MAPK 信號(hào)激活有關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了哮喘“伏風(fēng)暗瘀宿痰”中醫(yī)病機(jī)假設(shè)的合理性，并有助于闡明中西醫(yī)病機(jī)交通性，為突破哮喘中醫(yī)病機(jī)“瓶頸”，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥辨證哮喘和精準(zhǔn)干預(yù)哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。