南藥巴戟天脫毒苗的培育與快繁體系的優(yōu)化

陳子恩　馮 沖　羅振華　劉夢云 丁平

關(guān)鍵詞：巴戟天；脫毒；快繁；直接器官發(fā)生；病毒檢測

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A

巴戟天（Morinda officinalis How）為茜草科巴戟天屬植物，多年生藤本，其干燥根入藥，是我國的“四大南藥”之一，具有補肝腎、強筋骨的作用[1]。其主產(chǎn)于廣東、福建等地，在我國主要通過扦插繁殖，病毒通過植物的無性繁殖在植物體內(nèi)傳遞及積累，最終造成植物生長受到抑制、產(chǎn)量及品質(zhì)下降[2-3]，因此，加強對巴戟天組織培養(yǎng)技術(shù)的研究具有十分重要的意義。本課題組在前期研究中對花葉病巴戟天進行病原鑒定，確定該病原為黃瓜花葉病毒-巴戟天株（Cucumbermosaic virus isolate Morinda officinalis How，CMVMO）[4]。目前，對于防治病毒病害沒有特別有效的防治藥物，脫除病毒是提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)最有效的方法，張曉麗等[5]發(fā)現(xiàn)脫毒苗在生長過程中各方面指標如形態(tài)指標、生理特性均優(yōu)于非脫毒苗，且產(chǎn)量也會顯著提高。常見的脫病毒方法包括低溫脫毒、溫熱脫毒、利用組織培養(yǎng)技術(shù)脫毒、化學脫毒等[6]。其中，利用組織培養(yǎng)技術(shù)脫除植物病毒簡便、易行，目前使用該技術(shù)進行植物脫毒的有半夏（Pinellia ternata）、大蒜（Allium sativum）、姜（Zingiber officinale Rosc.）等[7-9]。因此，加強對巴戟天組織培養(yǎng)技術(shù)的研究具有十分重要的意義。

通過器官發(fā)生途徑進行組織培養(yǎng)是藥用植物組織培養(yǎng)的主要方式，指一定條件下通過誘導外植體產(chǎn)生不定芽等器官，經(jīng)過擴繁、誘導生根、煉苗移栽等步驟發(fā)育成為完整植株。器官發(fā)生途徑有2 種，根據(jù)組織培養(yǎng)過程中是否需要誘導愈傷組織，又分為直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑[10]。目前巴戟天的組織培養(yǎng)技術(shù)主要通過間接器官發(fā)生途徑，即利用巴戟天外植體誘導出愈傷組織，通過愈傷組織誘導不定芽從而獲得巴戟天的組培苗，這種組織培養(yǎng)方法存在許多問題，例如培養(yǎng)時間比較長，培養(yǎng)基配方繁多，繁殖系數(shù)低，増殖困難，繼代生長周期長，缺少建立經(jīng)濟效率高、成本低的標準化生產(chǎn)體系等。與其相比，直接器官發(fā)生途徑不需經(jīng)過愈傷組織階段，周期更短，且期間發(fā)生的變異少，能很好地保留植株的遺傳特異性，特別適用于需要維持遺傳穩(wěn)定性的道地藥材種苗的培育[11-13]。利用直接器官發(fā)生途徑建立巴戟天組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究迄今鮮有報道。故本研究選用組織培養(yǎng)技術(shù)以獲得巴戟天的脫毒苗，通過直接器官發(fā)生途徑，以巴戟天莖段材料直接誘導生芽，建立巴戟天的組織培養(yǎng)技術(shù)體系的快速繁殖方法，為巴戟天種苗的工廠化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴戟天小葉黑蕊型植株與大葉型植株均收集自廣東省德慶縣，移栽至華南植物園種質(zhì)資源圃。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學丁平研究員鑒定為茜草科植物巴戟天的植株。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒接種 取兩年生的巴戟天樣品，將其莖分為3 部分，距離頂端20 cm 以內(nèi)為幼嫩莖段，距離頂端20～40 cm 處為半木質(zhì)化莖段，距離頂端超過40 cm 的部位為完全木質(zhì)化莖段。切除葉片后置于超凈工作臺中，用75%酒精棉片，擦拭其表面，將巴戟天莖段切成帶有節(jié)位的長度約為2～3 cm 的小段，為了篩選出巴戟天的最佳消毒部位和消毒方法，將其使用0.1%氯化汞將巴戟天幼嫩、半木質(zhì)化及木質(zhì)化莖段分別消毒5.5 ～8.0 min，無菌水漂洗3 次。處理后，于無菌條件下接種至1/2 MS 培養(yǎng)基上，于接種后第2 天開始記錄污染數(shù)。20 d 后統(tǒng)計污染率和成活率（污染率=污染苗數(shù)/接種苗數(shù)100%，成活率=成活苗數(shù)/接種苗數(shù)100%）。

1.2.2 腋芽的誘導分化 將消毒處理后的巴戟天莖段分為幼嫩部位、半木質(zhì)部位、全木質(zhì)化部位，分別接種于含不同濃度及組合植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)30 d 后觀察結(jié)果，記錄腋芽誘導率以及腋芽誘導狀況，篩選出誘導腋芽的最適部位與最適培養(yǎng)基（腋芽誘導率=產(chǎn)生腋芽的外植體數(shù)/接入外植體總數(shù)100%）。

1.2.3 叢生芽的增殖培養(yǎng) 將培養(yǎng)30 d，誘導出的腋芽從莖段上切下，接種于不同類型培養(yǎng)基中，接種20 個外植體，培養(yǎng)30 d 后觀察結(jié)果。記錄叢生芽誘導率以及叢生芽生長狀況（叢生芽誘導率=產(chǎn)生叢生芽的腋芽數(shù)/接入腋芽總數(shù)100%）。

1.2.4 組培苗的生根與移栽 （1）生根培養(yǎng)。將培養(yǎng)30 d，誘導出1.5 cm 左右高的叢生芽苗轉(zhuǎn)接到不同類型的生根培養(yǎng)基中，每瓶3～4 個芽苗，共轉(zhuǎn)接4 瓶。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計其生根率和根系生長狀況（生根率=生根的單苗數(shù)/接種單苗總數(shù)100%）。（2）煉苗與移栽。當組培苗根系長度大于2 cm 后，將完成生根的組培苗連組培瓶移出培養(yǎng)室，保持溫度20～25 ℃、相對濕度60%左右，閉蓋置于室溫自然光條件下放置3 d，然后打開瓶口，自然光下煉苗5 d 或8 d。將煉苗結(jié)束的巴戟天組培苗從組培瓶中移出，使用清水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，將根部浸泡于稀釋的多菌靈溶液中5 min，再用流水沖洗4 min。處理后移栽至4 種不同栽培基質(zhì)的育苗杯中，每1～2 d 噴施1 次水，30 d 后記錄移栽存活率（移栽存活率=成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)100%）。

1.2.5 組培苗與移栽苗的病毒檢測 以脫毒組培苗與移栽苗為試驗組，田間感病巴戟天為陽性對照組，取各組幼嫩葉片各0.1 g 提取總RNA 后進行反轉(zhuǎn)錄，利用設(shè)計的3 對特異引物進行RT-PCR檢測。反應體系為2×Pfu Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA模板2 μL，PCR反應程序為94 ℃ 1 min 30 s，94 ℃20 s，50～60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，30 個循環(huán)，72 ℃5 min 得到最終樣品。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對莖段消毒效果的影響

不同消毒處理對巴戟天莖段的污染率及成活率均有一定的影響。隨氯化汞消毒時間的延長，幼嫩莖段的污染率及成活率成反比，而半木質(zhì)和全木質(zhì)莖段的污染率和成活率均逐漸下降（表1）。對于巴戟天幼嫩莖段，消毒8 min 的污染率最低，且成活率在4 組中最高，達到35.12%，因此消毒8 min 為巴戟天幼嫩莖段消毒的優(yōu)選方法。對于半木質(zhì)莖段，消毒5.5 min 的成活率最高，接種21個外植體成活10 個，成活率達47.62%，但是污染率偏高，達到47.62%；0.1%氯化汞消毒8 min的污染率最低，只有38.33%，但是成活率也最低，只有30.00%，綜合考慮污染率及成活率2 個指標，最終選定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 為巴戟天半木質(zhì)化莖段消毒的優(yōu)選方法。對于巴戟天的全木質(zhì)化莖段，消毒8 min 的污染率最低，消毒5.5 min的成活率最高，綜合考慮污染率及成活率2 個指標，最終選定0.1%氯化汞溶液消毒6 min 為巴戟天全木質(zhì)化莖段消毒的優(yōu)選方法。綜上，雖然消毒時間組內(nèi)之間沒有顯著差異，但比較3 個部位巴戟天的消毒效果，半木質(zhì)部位污染率較低，成活率較高，優(yōu)選其為巴戟天組織培養(yǎng)的外植體部位。

2.2 不同部位莖段對腋芽誘導能力的影響

比較巴戟天不同部位莖段的平均腋芽誘導數(shù)及腋芽生長狀況，結(jié)果如表2 所示。巴戟天的半木質(zhì)化莖段平均腋芽誘導數(shù)大，生長較快，平均腋芽誘導數(shù)為1.90 個，一個生長點可見多個腋芽，與幼嫩部位及全木質(zhì)化部位差異顯著（P< 0.05）。幼嫩部位的平均腋芽誘導數(shù)低于半木質(zhì)化部位，高于木質(zhì)化部位，半木質(zhì)化部位的平均腋芽誘導數(shù)最低，每個生長點僅長一個腋芽。因此最終篩選巴戟天半木質(zhì)化莖段可作為巴戟天組織培養(yǎng)的理想材料來源。

2.3 不同類型培養(yǎng)基對腋芽誘導能力的影響

比較半木質(zhì)化巴戟天莖段在3 種不同類型培養(yǎng)基中的腋芽誘導率及其生長狀況，結(jié)果顯示組間并沒有明顯差異（表3，圖1）。以巴戟天半木質(zhì)化莖段為外植體，接種于含有6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培養(yǎng)基中，莖段的節(jié)點處長出腋芽，腋芽生長狀況良好（圖1A），巴戟天半木質(zhì)化莖段誘導腋芽在MS 培養(yǎng)基中生長狀況不佳，芽苗瘦弱（圖1B），在含有6-BA 0.2 mg/L 的MS 培養(yǎng)基中誘導腋芽出現(xiàn)透明玻璃化現(xiàn)象（圖1C）。

2.4 不同類型培養(yǎng)基對叢生芽誘導能力的影響

以1/2 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，利用不同濃度配比的6-BA 與NAA 篩選出適合誘導巴戟天莖段叢生芽的培養(yǎng)基。對巴戟天莖段叢生芽在不同類型培養(yǎng)基中生長狀況進行統(tǒng)計，結(jié)果如表4 和圖2 所示。6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培養(yǎng)基叢生芽誘導率達到83.33%，叢生芽生長狀況良好，葉片呈現(xiàn)深綠色；當6-BA 的濃度升高到0.5 mg/L 時，叢生芽的誘導率反而下降到46.67%，與另外2 組有顯著差異性，叢生芽生長緩慢，葉片蜷縮并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；在0.5 mg/L 6-BA 的基礎(chǔ)上再添加0.2 mg/L 的NAA，叢生芽的誘導率有所上升，可達73.33%，叢生芽的生長狀況有所改善，但是部分叢生芽葉片玻璃化的現(xiàn)象仍然存在。

2.5 不同生根培養(yǎng)基對巴戟天生根的影響

分別以1/2 N6、N6、1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的IBA，篩選出適合巴戟天芽苗生根的培養(yǎng)條件。統(tǒng)計巴戟天芽苗移入不同類型培養(yǎng)基的誘導生根率及生根情況，結(jié)果見表5 和圖3。巴戟天芽苗在添加0.5 mg/L IBA 的1/2 N6及添加1.0 mg/L IBA 的N6 培養(yǎng)基中，未出現(xiàn)生根現(xiàn)象，且巴戟天芽苗在N6 培養(yǎng)基中生長狀況較差，出現(xiàn)葉子掉落，萎黃的情況，說明N6 培養(yǎng)基并不適合巴戟天芽苗生根；而在添加不同濃度IBA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中均可生根，但在IBA濃度超過1.0 mg/L 的1/2 MS 培養(yǎng)基中出現(xiàn)氣生根現(xiàn)象。

2.6 不同類型基質(zhì)對組培苗煉苗移栽的影響

待巴戟天芽苗在瓶中長至4～5 cm 后，從組培室移至室外煉苗5 d 或8 d 后移栽至含有不同類型基質(zhì)的育苗杯，統(tǒng)計移栽苗的存活率（表6）。就煉苗時間而言，經(jīng)過8 d 煉苗時間的移栽苗存活率明顯高于5 d 組。幾種基質(zhì)中，當煉苗5 d 時，草炭土與珍珠巖比例1∶1 的組培苗成活率最高，達到88.90%；當煉苗時間為8 d 時，草炭土比珍珠巖1∶1 和草炭土比蛭石1∶1 這2 種基質(zhì)的成活率最高，均為93.33%。因此最佳基質(zhì)為草炭土比珍珠巖1∶1 和草炭土比蛭石1∶1。

2.7 巴戟天組培苗與移栽苗脫毒效果評價

利用RT-PCR 方法檢測巴戟天脫毒苗與田間感病巴戟天的病毒情況，結(jié)果如圖4A 所示，根據(jù)黃瓜花葉病毒-巴戟天株（Cucumber mosaic virusisolate M. officinalis How， CMVMO）設(shè)計的3 對引物均可對黃瓜花葉病毒-巴戟天株進行檢測，第二對引物CMVMO2 的特異性最佳。與陽性對照相比，巴戟天組培苗與移栽苗均未檢測出特異性高亮度條帶，說明該組織培養(yǎng)體系所誘導的巴戟天脫毒苗可成功脫除CMVMO 病毒（圖4B）。

3 討論

近年來關(guān)于巴戟天組織培養(yǎng)技術(shù)的報道有很多，且選擇的培養(yǎng)方式不盡相同。其中陳煌等[14]以巴戟天莖尖或莖節(jié)段為試驗材料，成功建立了一套巴戟天優(yōu)質(zhì)種苗快速繁育應用的組培技術(shù)體系。林美珍等[15]以巴戟天幼胚為外植體誘導愈傷組織，再由愈傷組織分化成完整植株，并誘導出多倍體巴戟天。巴戟天是廣東的道地藥材，必須要保持巴戟天的品種特性，因此本研究選用直接器官發(fā)生途徑建立巴戟天組織培養(yǎng)體系，本方法不經(jīng)過愈傷組織階段，具有極強的遺傳穩(wěn)定性。

研究表明，利用巴戟天不同部位莖段作外植體，對其消毒效果也會有所不同。使用相同的消毒處理方法，半木質(zhì)化莖段的污染率較低，成活率相對較高，若巴戟天莖段太幼嫩會對氯化汞不耐受，從而降低成活率，而全木質(zhì)化莖段污染的主要來源為真菌污染，主要表現(xiàn)為培養(yǎng)基上生長白色的霉菌。巴戟天表面被有絨毛，容易帶有真菌及細菌且不易消除，其中以全木質(zhì)化莖段表面最為粗糙，是其污染率較高的主要原因。另外，選擇不同部位莖段作為外植體，其腋芽的發(fā)生情況也不相同，莖段不同取材部位誘導腋芽能力由強到弱依次為半木質(zhì)部位、幼嫩部位、全木質(zhì)部位。以巴戟天莖段為材料誘導腋芽，數(shù)量多，基數(shù)大，增殖快，容易誘導成功，能為巴戟天種苗的工廠化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。該結(jié)果與黃寧珍等[16]、陳偉等[17]的結(jié)果一致。本研究以巴戟天莖段為材料誘導腋芽，并進一步增殖，其誘導最適培養(yǎng)基為添加6-BA 0.2 mg/L 的1/2 MS 培養(yǎng)基。巴戟天常規(guī)的外植體材料包括葉片及莖段等，分化能力較差，叢生芽誘導率較低。本研究以巴戟天半木質(zhì)化莖段誘導出的腋芽為材料，其分化能力較強，為理想的巴戟天叢生芽誘導來源。以莖段誘導的腋芽為外植體，接種于添加6-BA 0.2 mg/L的1/2 MS 培養(yǎng)基上（與誘導莖段腋芽的培養(yǎng)基相同），叢生芽的誘導率達到86.36%。巴戟天移栽到疏松透氣、偏酸性的土壤可提高其移栽成活率，故選用偏酸性的材料作為培養(yǎng)基質(zhì)[14]。草炭土中富含有機質(zhì)，質(zhì)地松軟，呈微酸性，但其缺乏保水性。珍珠巖和蛭石在農(nóng)業(yè)育苗中均有改善土壤、增加土壤透氣性、保水保濕等作用。但由于二者保水效果好，過度添加反而導致基質(zhì)中水分過多，使植株死亡。農(nóng)業(yè)上巴戟天種植通常使用紅土[18]，但紅土黏性較大，透氣性差，土質(zhì)偏重，不能和珍珠巖很好地混合，易導致根系腐爛。因此，在巴戟天組培苗移栽初期，最好選擇草炭土與珍珠巖或蛭石混合使用，既保水又有透氣性。

研究結(jié)果還表明，選用1/2 MS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其生根效果要比選用N6 培養(yǎng)基的好，這與肖祖飛等[19]對樟樹、張琨等[20]對黃花菜、劉丹等[21]對附子的研究結(jié)果一致，且巴戟天芽苗在N6 培養(yǎng)基中生長狀況較差，出現(xiàn)葉子掉落，萎黃的情況，推測為N6 培養(yǎng)基中大量元素含量較低導致。此外，本研究還通過RT-PCR 的方法檢測巴戟天脫毒苗中黃瓜花葉病毒-巴戟天株（CMVMO），結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴戟天脫毒苗已徹底脫除病毒，近年來，組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應用于對中草藥脫毒培養(yǎng)[22]。因此，本研究認為通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以實現(xiàn)巴戟天的脫毒培養(yǎng)與快繁，為巴戟天種苗的脫毒快繁與工廠化生產(chǎn)提供參考。

由于本研究主要針對農(nóng)家品種巴戟天大葉型巴戟天與小葉黑蕊型巴戟天，使得本研究結(jié)果不一定適用于其他品種巴戟天，有一定的局限性。但利用本研究結(jié)果，可為農(nóng)家品種巴戟天的脫毒快繁技術(shù)在生產(chǎn)上的運用提供參考，為巴戟天的種質(zhì)資源保護、脫毒擴繁、品種改良等提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以巴戟天莖段為材料，經(jīng)75%乙醇預處理后的莖段用0.1%氯化汞溶液消毒5.5 min 為巴戟天莖段消毒的優(yōu)選方法；以巴戟天半木質(zhì)部位作為外植體接種的腋芽誘導能力最強；巴戟天莖段誘導腋芽的最適培養(yǎng)基為添加0.2 mg/L6-BA 激素的1/2 MS 培養(yǎng)基；巴戟天莖段誘導叢生芽的最適培養(yǎng)基為添加0.2 mg/L 6-BA 激素的1/2 MS 培養(yǎng)基；誘導巴戟天芽苗生根的最佳培養(yǎng)基為添加0.5 mg/L IBA 激素的1/2 MS 培養(yǎng)基；巴戟天組培苗的最適移栽基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖1∶1 和草炭土∶蛭石1∶1 的基質(zhì)。通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以實現(xiàn)巴戟天的脫毒培養(yǎng)與快繁。