Genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯病毒檢測上的應(yīng)用綜述

頡瑞霞　張小川　王效瑜　郭志乾　吳林科　余幫強(qiáng)　張國輝

摘要 生物芯片檢測技術(shù)是一種檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)的新型病毒檢測技術(shù)。genetop馬鈴薯病毒試劑盒具有可同時檢測出7種病毒（PVY可分型PVY與PVYN）與1種類病毒，直接檢測薯塊，所用試劑無毒，操作簡便且病毒與類病毒全部檢測平均成本低于ELISA等特點。對genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及馬鈴薯種薯生產(chǎn)與質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 生物芯片檢測；馬鈴薯；病毒檢測

中圖分類號 S412 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）21-0104-01

生物芯片（Biochip）是20世紀(jì)90年代中期以來形成的最具深遠(yuǎn)意義的重大科技進(jìn)展之一[1]，目前主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域[2]。近年來，生物芯片檢測技術(shù)是繼酶聯(lián)免疫吸附、免疫膠體金技術(shù)（ICG）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法應(yīng)用之后，又一種利用核酸專一性，檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果易讀取的新型病毒檢測技術(shù)[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產(chǎn)中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發(fā)的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑，該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進(jìn)行分子檢測，在生物芯片孔盤表面已預(yù)先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針，病毒核酸萃取后經(jīng)由一步核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)，將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大，與芯片盤上的探針進(jìn)行專一性結(jié)合；反應(yīng)結(jié)果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃取（Virus RNA Extraction）、一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)（RT-PCR）以及核酸雜合反應(yīng)（Hybridization），同時使用生物素與堿性磷酸酶系統(tǒng)的化學(xué)非放射性的呈色方法進(jìn)行顯色，避光染色后，結(jié)果可利用肉眼直接讀取。該方法是進(jìn)行定性檢測的一種有效方法。

2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術(shù)步驟

2.1 樣品的制備

取待檢測脫毒苗莖段、薯塊（取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）樣品分別標(biāo)記后，加入細(xì)胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速離心30 min吸取上清液100 ？滋L，初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min離心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即為檢測樣品，備用。

2.2 一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄與生物芯片雜合反應(yīng)

向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ？滋L、RT-PCR混合試劑（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進(jìn)入循環(huán)后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進(jìn)行30次循環(huán)，72 ℃ 7 min、溫度8 ℃），PCR擴(kuò)增結(jié)束后95 ℃ 3.5 min斷鏈，進(jìn)入雜合反應(yīng)階段：吸取擴(kuò)增樣品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min條件下進(jìn)行雜合反應(yīng)，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0）55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應(yīng)，繼續(xù)加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液顯色，避光7 min。自來水沖洗，直接觀察結(jié)果。

2.3 結(jié)果讀取

生物芯片檢測的結(jié)果分為失效、陽性、陰性。失效：質(zhì)控位點（C3或A1、A5、E1、E5）不顯色，說明PCR反應(yīng)和雜合反應(yīng)已失效；陰性：質(zhì)控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現(xiàn)顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不顯色，說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒；陽性：質(zhì)控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現(xiàn)顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出現(xiàn)顏色明顯的黑點，說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩(wěn)點顏色越深，樣品中的被檢測病毒含量越高。

3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優(yōu)點

genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性，可直接

（下轉(zhuǎn)第106頁）

生物芯片（Biochip）是20世紀(jì)90年代中期以來形成的最具深遠(yuǎn)意義的重大科技進(jìn)展之一[1]，目前主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域[2]。近年來，生物芯片檢測技術(shù)是繼酶聯(lián)免疫吸附、免疫膠體金技術(shù)（ICG）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法應(yīng)用之后，又一種利用核酸專一性，檢測速度快、靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果易讀取的新型病毒檢測技術(shù)[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產(chǎn)中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發(fā)的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑，該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進(jìn)行分子檢測，在生物芯片孔盤表面已預(yù)先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針，病毒核酸萃取后經(jīng)由一步核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)，將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大，與芯片盤上的探針進(jìn)行專一性結(jié)合；反應(yīng)結(jié)果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃?。╒irus RNA Extraction）、一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)（RT-PCR）以及核酸雜合反應(yīng)（Hybridization），同時使用生物素與堿性磷酸酶系統(tǒng)的化學(xué)非放射性的呈色方法進(jìn)行顯色，避光染色后，結(jié)果可利用肉眼直接讀取。該方法是進(jìn)行定性檢測的一種有效方法。

2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術(shù)步驟

2.1 樣品的制備

取待檢測脫毒苗莖段、薯塊（取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）樣品分別標(biāo)記后，加入細(xì)胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速離心30 min吸取上清液100 ？滋L，初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min離心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即為檢測樣品，備用。

2.2 一步驟核酸反轉(zhuǎn)錄與生物芯片雜合反應(yīng)

向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ？滋L、RT-PCR混合試劑（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進(jìn)入循環(huán)后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進(jìn)行30次循環(huán)，72 ℃ 7 min、溫度8 ℃），PCR擴(kuò)增結(jié)束后95 ℃ 3.5 min斷鏈，進(jìn)入雜合反應(yīng)階段：吸取擴(kuò)增樣品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min條件下進(jìn)行雜合反應(yīng)，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0）55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應(yīng)，繼續(xù)加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液顯色，避光7 min。自來水沖洗，直接觀察結(jié)果。

2.3 結(jié)果讀取

生物芯片檢測的結(jié)果分為失效、陽性、陰性。失效：質(zhì)控位點（C3或A1、A5、E1、E5）不顯色，說明PCR反應(yīng)和雜合反應(yīng)已失效；陰性：質(zhì)控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現(xiàn)顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不顯色，說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒；陽性：質(zhì)控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現(xiàn)顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出現(xiàn)顏色明顯的黑點，說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩(wěn)點顏色越深，樣品中的被檢測病毒含量越高。

3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優(yōu)點

genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性，可直接檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒，有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊，不能檢測類病毒的問題，以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統(tǒng)RT-PCR檢測具有以幾個方面的優(yōu)點：時間短、準(zhǔn)確度和靈敏度高，擴(kuò)充性與多重檢測效果好，所用試劑無毒害、檢測結(jié)果肉眼可判讀，操作簡便，易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時，平均價格低于ELISA，該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質(zhì)量提升，操作步驟簡單，易在基層種薯監(jiān)控單位和種薯繁育企業(yè)推廣。

4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景

我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2，面積位居世界首位，產(chǎn)量水平較低（15 818 kg/hm2），是發(fā)達(dá)國家產(chǎn)量水平的1/3～1/2，我國馬鈴薯產(chǎn)量遠(yuǎn)低于世界平均水平（2012年FAO數(shù)據(jù)）。影響我國馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素是病毒病危害，研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的產(chǎn)量損失[8]。利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒復(fù)壯種薯，可從根本上解決這一問題，種薯的質(zhì)量是影響馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素。目前，我國大面積推廣應(yīng)用的DAS-ELISA檢測技術(shù)只能檢測試管苗或植株，不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進(jìn)行直接快速檢測[3]。特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術(shù)的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題，達(dá)到了檢測葉片、組培苗或薯塊，一個反應(yīng)具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前，馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用剛剛起步，該產(chǎn)品在歐洲市場已進(jìn)入試用階段。該技術(shù)現(xiàn)已得到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應(yīng)用[D].南京：東南大學(xué)，2004.

[2] 吳明煜，郭曉紅，王萬賢，等.生物芯片研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2005（7）：421-430.

[3] 楊小琴，張艷艷，張媛媛，等.馬鈴薯病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

[5] HADIDI A，CZOSNEK H，BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses，viroids，and phytopl-asmas[J].Plant Pathol，2004，86：97-104.

[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.（上接第104頁）

檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒，有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊，不能檢測類病毒的問題，以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統(tǒng)RT-PCR檢測具有以幾個方面的優(yōu)點：時間短、準(zhǔn)確度和靈敏度高，擴(kuò)充性與多重檢測效果好，所用試劑無毒害、檢測結(jié)果肉眼可判讀，操作簡便，易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時，平均價格低于ELISA，該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質(zhì)量提升，操作步驟簡單，易在基層種薯監(jiān)控單位和種薯繁育企業(yè)推廣。

4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用前景

我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2，面積位居世界首位，產(chǎn)量水平較低（15 818 kg/hm2），是發(fā)達(dá)國家產(chǎn)量水平的1/3～1/2，我國馬鈴薯產(chǎn)量遠(yuǎn)低于世界平均水平（2012年FAO數(shù)據(jù)）。影響我國馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素是病毒病危害，研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產(chǎn)10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的產(chǎn)量損失[8]。利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒復(fù)壯種薯，可從根本上解決這一問題，種薯的質(zhì)量是影響馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素。目前，我國大面積推廣應(yīng)用的DAS-ELISA檢測技術(shù)只能檢測試管苗或植株，不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進(jìn)行直接快速檢測[3]。特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術(shù)的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術(shù)核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題，達(dá)到了檢測葉片、組培苗或薯塊，一個反應(yīng)具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前，馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯質(zhì)量控制體系中的應(yīng)用剛剛起步，該產(chǎn)品在歐洲市場已進(jìn)入試用階段。該技術(shù)現(xiàn)已得到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術(shù)在馬鈴薯種薯生產(chǎn)和質(zhì)量控制體系中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應(yīng)用[D].南京：東南大學(xué)，2004.

[2] 吳明煜，郭曉紅，王萬賢，等.生物芯片研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2005（7）：421-430.

[3] 楊小琴，張艷艷，張媛媛，等.馬鈴薯病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

[5] HADIDI A，CZOSNEK H，BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses，viroids，and phytopl-asmas[J].Plant Pathol，2004，86：97-104.

[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.