基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討澤漆湯治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

竇丹旎 錢韋丹

江蘇省無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇無(wú)錫 214000

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%～85%[1]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的報(bào)告顯示，2020 年肺癌病死率為全球第一[2]。而我國(guó)肺癌病死數(shù)超過全球總數(shù)的三分之一，成為惡性腫瘤的頭號(hào)殺手[3]。中醫(yī)認(rèn)為，肺為生痰之源，脾為儲(chǔ)痰之器，如果肺失宣降，脾失健運(yùn)，那么氣虛痰瘀則易產(chǎn)生腫塊，積于肺則發(fā)展為肺癌[4]?！夺t(yī)宗必讀》載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之?！币舱f明了氣虛是肺癌發(fā)生的根本原因[5]，因此治療應(yīng)從補(bǔ)氣化瘀入手。

澤漆湯，出自《金匱要略》，以澤漆為君藥，佐以半夏、白前、甘草、生姜、紫參（經(jīng)本草考證，此處應(yīng)為拳參。拳參最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名紫參，現(xiàn)代治療肺熱咳嗽等[6]）、黃芩、人參、桂枝，有補(bǔ)脾順肺、扶正化瘀之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，澤漆湯對(duì)肺癌有抑制作用[7-9]。然而，澤漆湯治療NSCLC 的具體機(jī)制尚不明確。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)澤漆湯治療NSCLC 的核心成分和作用靶點(diǎn)，并用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，為開發(fā)以澤漆湯為核心的抗肺癌新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 澤漆湯活性成分獲取與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索澤漆湯的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%以及藥物相似度（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)[10]，獲取活性成分與其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.2 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 以及PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)，將檢索結(jié)果合并去重，得到NSCLC 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用線上繪圖工具網(wǎng)站繪制藥物靶點(diǎn)與NSCLC 相關(guān)靶點(diǎn)的Venn 圖，以確定澤漆湯與NSCLC的共同靶點(diǎn)；將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種設(shè)置為人，以結(jié)合評(píng)分≥0.9 為篩選條件，將所選靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。篩選出度值排名前10 的靶點(diǎn)，繪制核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入共有靶點(diǎn)，進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以P＜ 0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 分子對(duì)接

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)下載澤漆湯核心活性成分的3D 結(jié)構(gòu)mol2 文件，利用RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)大分子的PDB 文件。利用AutoDock 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選取結(jié)合能最低的構(gòu)象，然后通過PyMOL 軟件繪制出分子對(duì)接3D 結(jié)合圖[15]。

2 結(jié)果

2.1 澤漆湯活性成分獲取與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP 和文獻(xiàn)檢索，設(shè)置篩選條件為OB ≥30%且DL ≥0.18，將得到結(jié)果去除重復(fù)后，共獲得178 個(gè)澤漆湯活性成分，272 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

2.2 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 以及PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)，將結(jié)果合并去重，獲得2898 個(gè)NSCLC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

通過Venn 圖得到藥物-疾病共有靶點(diǎn)189 個(gè)，見圖1。將藥物活性成分與藥物-疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)圖中含222 個(gè)節(jié)點(diǎn)、209 條邊，節(jié)點(diǎn)越大代表活性成分與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度越高，其中度值排名前5 的活性成分為槲皮素、木犀草素、柚皮素、甘草醇、松柏苷。

圖1 澤漆湯活性成分和NSCLC 靶點(diǎn)的Venn 圖

圖2 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物-疾病共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病共有靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到藥物-疾病共有靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)。其中包含188 個(gè)節(jié)點(diǎn)，951 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度10.1。把得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。節(jié)點(diǎn)越大、線條越粗代表靶點(diǎn)作用關(guān)系越強(qiáng)。由圖可知，TP53、MAPK3、JUN、AKT1、STAT3 作用關(guān)系最強(qiáng)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO、KEGG通路富集分析結(jié)果

利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)189 個(gè)常見藥物疾病靶點(diǎn)的GO功能進(jìn)行分析，得到505個(gè)GO條目（P＜ 0.05），其中生物過程（BP）389 個(gè)，細(xì)胞成分（CC）36 個(gè)，分子功能（MF）80 個(gè)。對(duì)每個(gè)類別的前10 項(xiàng)進(jìn)行可視化分析，見圖4。在BP 中，涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；在CC 中，包括胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核等；在MF 中，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等。

圖4 GO 功能富集分析

KEGG 通路富集分析得到癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路，選取排名前10 位的信號(hào)通路作氣泡圖，見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析

2.6 分子對(duì)接

分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素等核心成分與TP53、MAPK3 等核心靶點(diǎn)均存在結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合能越小，表明結(jié)合越容易，排名前5 位的為MAPK3 與柚皮素、MAPK3 與甘草醇、AKT1 與松柏苷、MAPK3 與木犀草素、MAPK3 與松柏苷，其相應(yīng)的對(duì)接構(gòu)象見圖6。

圖6 澤漆湯活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接情況

3 討論

NSCLC 占肺癌總數(shù)的85%左右，其發(fā)病率和病死率均居全球首位[11]。因其存在治療難、易復(fù)發(fā)等問題[12]，所以新的治療方式亟待開發(fā)。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌病機(jī)多為虛證氣滯，然后出現(xiàn)水停、痰凝、痰血瘀等，最終形成腫瘤[13]。澤漆湯能益氣養(yǎng)陰、理氣化痰、祛瘀散結(jié)、解毒抗癌?，F(xiàn)代研究[14]也表明，澤漆湯對(duì)肺癌模型小鼠有顯著的抑制作用。

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索澤漆湯成分，以獲得其有效成分并預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)，包括TP53、MAPK3、STAT3 等。TP53 是重要的腫瘤抑制因子，研究表明，超過半數(shù)的人類腫瘤中都存在TP53 的突變或缺失[15]。MAPK3 與STAT3 均在細(xì)胞凋亡等病變過程中有參與。本研究結(jié)果提示澤漆湯可能通過調(diào)控上述靶點(diǎn)來抑制NSCLC 腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，澤漆湯通過RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物過程，在胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核等細(xì)胞組分中，通過影響蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等分子功能來治療NSCLC。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示澤漆湯通過作用于癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路治療NSCLC。

本研究采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證澤漆湯核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力，結(jié)果表明，活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間存在結(jié)合位點(diǎn)，最小結(jié)合能為-6.08 kJ/mol，存在氫鍵等分子間結(jié)合力。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)了澤漆湯治療NSCLC 的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為后期開發(fā)以澤漆湯為主的抗肺癌新藥研究提供了理論依據(jù)。