肉鵝制品中松香酸和脫氫松香酸殘留的高效液相色譜檢測方法

李金玲　白昊鑫　馬晶晶　劉?！」⒅久鳌±罱鹌健⊥醯罓I　徐為民

摘要：松香甘油酯是我國推薦使用的畜禽脫毛劑，研究表明，松香甘油酯在合成和使用過程中均能檢出游離松香，這些殘留的松香在脫毛過程中可能殘留于畜禽胴體，而肉鵝制品中松香殘留情況尚缺乏研究。在前期松香殘留分析工作的基礎(chǔ)上，以松香酸（AA）和脫氫松香酸（DHAA）作為松香的標(biāo)志物，采用固相萃取對樣品進(jìn)行除雜和富集，高效液相二極管陣列檢測器串聯(lián)熒光檢測器同時分析市場流通領(lǐng)域中肉鵝制品中2種目標(biāo)化合物的含量。該方法具有重復(fù)性好、靈敏度高的特點，松香酸和脫氫松香酸的檢出限分別為0.015 μg/g和0.003 μg/g。市場上流通的生、熟肉鵝制品中AA的陽性檢出率均高達(dá)80%，AA含量分別在2.82～14.52 μg/g和0.64～9.6 μg/g范圍，而生、熟肉鵝制品DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06 μg/g和0.06～2.62 μg/g范圍。研究結(jié)果表明，市場上流通領(lǐng)域的肉鵝制品中普遍檢出松香殘留，這些殘留的松香進(jìn)入消費者餐桌，存在食品安全隱患。

關(guān)鍵詞：肉鵝制品；松香酸；脫氫樅酸；固相萃??；高效液相色譜法

中圖分類號：TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0174-05

我國是世界肉鵝生產(chǎn)和消費大國，相比其他家禽，肉鵝羽毛具有分布更密集、毛層厚實、絨多且細(xì)長等特點［1］，這些因素導(dǎo)致肉鵝宰后脫毛難度更大。脫毛是肉鵝屠宰加工過程中的重要環(huán)節(jié)，脫毛干凈與否是制約肉鵝制品生產(chǎn)和銷售的瓶頸問題之一［2］。傳統(tǒng)的脫毛方法主要包括熱燙、機械打毛、二次脫毛等步驟，熱燙和機械脫毛可以去除大部分羽毛，二次脫毛主要采用黏附性較好的脫毛劑去除殘留在頭、頸、翅、臀等部位的細(xì)小微絨毛。

松香和松香甘油酯是2種常用的畜禽脫毛劑，二者在適當(dāng)加熱條件下可由固態(tài)轉(zhuǎn)化成液態(tài)，此時較好的黏附性能，可以附著在畜禽胴體表面，遇冷凝固成膜，撕去膜的同時可達(dá)到除殘毛的效果［3］。松香是一種天然的樹脂固體晶體，具有來源廣、價格低等優(yōu)點，曾長期用于鴨、鵝、豬蹄、豬耳等的二次脫毛加工［4-5］。松香酸（Abietic acid，AA）和脫氫松香酸（Dehydroabietic acid，DHAA）是松香的標(biāo)志性成分［6-11］，研究表明，AA和DHAA均有一定的毒理學(xué)性質(zhì)［12-14］，在光、熱、氧和金屬離子等因素的誘導(dǎo)下，易發(fā)生氧化反應(yīng)，生成的產(chǎn)物具有致敏性［15-16］。采用松香脫毛，易導(dǎo)致AA和DHAA殘留在胴體表皮組織中，引發(fā)食品安全問題，因此，我國已禁止松香用于屠宰加工脫毛，推薦松香甘油酯作為替代產(chǎn)品［17］。松香甘油酯是松香的改性產(chǎn)物，松香中的羧酸類化合物和甘油在催化劑作用下發(fā)生酯化，生成一甘酯、二甘酯和三甘酯等產(chǎn)物（圖1），相比松香，松香甘油酯具有穩(wěn)定性好、酸值低等優(yōu)點。但松香甘油酯作為脫毛劑，使用過程也存在一些問題：一是相比松香，松香甘油酯成分更加復(fù)雜，工業(yè)化生產(chǎn)偏重酸價和色度等指標(biāo)來判斷產(chǎn)物等級，而忽視了松香的真實酯化程度，此外，松香甘油酯的酯化程度、成分分析、含量分析等方面尚缺乏必要的研究，市場上流通的松香甘油酯品質(zhì)難以鑒別和監(jiān)控［18-19］；二是松香甘油酯的工業(yè)合成存在酯化不完全現(xiàn)象，導(dǎo)致游離松香殘留，采用松香甘油酯用于畜禽脫毛仍可導(dǎo)致松香殘留的情況發(fā)生［20］，這些殘留的松香進(jìn)入消費者的餐桌，同樣會引發(fā)食品安全問題；三是松香甘油酯價格比松香高，實際生產(chǎn)過程中使用量大，無疑會增加企業(yè)的成本，在脫毛效果和利益的雙重脅迫下，部分企業(yè)仍違規(guī)使用松香進(jìn)行屠宰加工脫毛。筆者所在課題組前期研究表明，市場上流通領(lǐng)域的白條鴨胴體松香殘留情況較普遍［21-23］，殘留的松香經(jīng)水洗、烹飪加工不能完全消除，肉鴨熟制品仍有游離松香殘留［6］。上述原因造成了市場上“松香產(chǎn)品”屢禁不止現(xiàn)象，這些殘留的松香尚不能有效區(qū)分來源，而現(xiàn)階段市場上流通的肉鵝制品中松香殘留情況尚缺乏研究，因此，對市場上的肉鵝制品進(jìn)行松香殘留分析顯得尤為必要。

筆者所在課題組前期建立了同時檢測肉鴨制品中AA和DHAA方法，采用固相萃取凈化、高效液相分析方法［22］。肉鵝表皮組織富含油脂、蛋白等成分，會干擾AA和DHAA的分析檢測，本研究采用固相萃取對肉鵝表皮組織進(jìn)行除雜和富集AA和DHAA。AA和DHAA這2種化合物的同時檢測采用高效液相二極管陣列檢測器（PDA）串聯(lián)熒光檢測器（FLR）來實現(xiàn)。由圖2可見，AA和DHAA是一類三環(huán)二萜類的樹脂酸，AA因結(jié)構(gòu)中存在共軛的不飽和碳碳雙鍵，在紫外區(qū)域有良好的吸收特性，可采用紫外或二極管陣列檢測器對AA進(jìn)行含量分析，而DHAA分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，兼具紫外和熒光特性，且在熒光檢測器下表現(xiàn)出更高的靈敏度，能滿足更低含量的檢測要求，可采用熒光檢測器對DHAA進(jìn)行含量分析。因此，本研究采用固相萃取對采集的肉鵝制品進(jìn)行凈化和松香富集，二極管陣列串聯(lián)熒光檢測器的高效液相分析同時檢測樣品中AA和DHAA含量。該方法具有靈敏度高、操作便捷等優(yōu)點。本研究以AA和DHAA為松香殘留標(biāo)志物，采用高效液相法分析生、熟肉鵝胴體中松香殘留情況，為現(xiàn)階段市場流通領(lǐng)域中的肉鵝制品中松香情況提供數(shù)據(jù)和分析方法，對于國家質(zhì)量監(jiān)管、保護(hù)消費者食品安全具有重要意義。

1材料與方法

1.1原料與試劑

肉鵝制品均購自南京孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場及附近蘇果超市、北京華聯(lián)超市，所有樣品采樣后，取不同部位的表皮、肌肉（胸肉和腿肉，去除筋膜），攪碎，混勻，置于密封袋中-20 ℃避光保存。

AA（標(biāo)準(zhǔn)試劑，HPLC純度≥90%）和DHAA（標(biāo)準(zhǔn)試劑，HPLC純度≥98%）上海源葉試劑有限公司；色譜純乙腈，上海泰坦科技股份有限公司；色譜純甲酸，上海麥克林生化科技股份有限公司；水由Millipore純水儀制備；其他試劑均為分析純；C18固相萃?。╯olid phase extraction，SPE，3 mL）小柱，美國Supelco公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀Waters e2695（配有PDA和FLR），美國Waters公司；固相萃取儀，美國Alltech科技有限公司；氮氣濃縮儀N-Evap 112，美國 Organomation公司；Direct-Q3uv超純水機，美國Millipore；電子分析天平PTX-FA210S，福州華志科學(xué)儀器；臺式冷凍離心機Unicen MR，德國 Hero lab公司；HS2060A超聲波振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別稱取適量AA和DHAA，用乙腈溶解，分別配制成1 mg/mL和 0.1 mg/mL 的儲備液。取適量等體積上述儲備液混勻，用乙腈梯度稀釋，分別配制成AA系列濃度為0.1～20 μg/mL，DHAA系列濃度為0.01～2.00 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2樣品處理參照文獻(xiàn)［14］的方法并略有改動：稱取1 g（精確至0.001 g）混合均勻的樣品置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈，充分混勻后超聲水浴振蕩10 min，室溫離心（10 000 r/min，10 min）。另取潔凈10 mL離心管，吸取4 mL上清液，加入等體積的去離子水混勻后作為固相萃取上樣液，固相萃取小柱上樣前依次用乙腈和去離子水各3 mL活化，上樣后，用3 mL 40%乙腈溶液淋洗，最后用 2 mL 甲醇洗脫收集，收集液經(jīng)氮氣吹掃儀濃縮干燥后，用適量乙腈復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，置于-20 ℃保存，待HPLC分析。每個樣品取3個平行，測試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.3色譜條件色譜柱：XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比84 ∶16）；流速：1 mL/min；PDA檢測波長：240 nm，F(xiàn)LR 激發(fā)和發(fā)射波長分別為 225 nm 和287 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4數(shù)據(jù)及圖像分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；圖像采用Chemdraw 16.0及Powerpoint 2016繪制。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

在筆者所在課題組前期研究［6］的基礎(chǔ)上，對高效液相檢測的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，主要對流動相試劑種類、流動相比例進(jìn)行優(yōu)化，固定0.1%甲酸水溶液作為水相，以乙腈代替甲醇作為有機流動相時，在不影響分離度的情況下，可以明顯縮短AA和DHAA的保留時間，與此同時，DHAA的熒光吸收響應(yīng)值要比甲醇作為流動相時高，可以滿足更低濃度的檢測。通過流動相比例優(yōu)化，可以得出，隨著水相比例的提高，可以延長AA和DHAA的出峰時間，當(dāng)乙腈和水相體積比調(diào)為84 ∶16時，可使目標(biāo)物和雜質(zhì)分離開來，又能滿足檢測保留時間的需求。綜合2種標(biāo)志物分離度、峰形、保留性、響應(yīng)值等方面的綜合考慮，最終采用的流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比84 ∶16），流速為1 mL/min，AA和DHAA的保留時間分別為13.4 min和9.0 min（圖3）。

2.2方法的線性范圍、檢測限和定量限

本試驗采用外標(biāo)法定量肉鵝制品中的AA和DHAA，以標(biāo)準(zhǔn)系列濃度作為橫坐標(biāo)x，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)y，分別繪制AA和DHAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，AA和DHAA的回歸方程分別為y=11 596x-159.1和y=2 200 587.2x-6 715.3，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.999，表明在選擇的濃度范圍內(nèi)，2種化合物的濃度與相應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系。按照3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，AA和DHAA的檢出限分別為0.015 μg/g和0.003 μg/g，按照10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限，兩者的定量限分別為0.050 μg/g和0.010 μg/g（表1）。AA和DHAA的保留時間具有較高的重復(fù)性，日內(nèi)和日間精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，結(jié)果均低于2.0%。

2.3實際樣品分析

采用已經(jīng)建立的固相萃取凈化、高效液相同時分析AA和DHAA的方法，對市場上流通的肉鵝制品中松香殘留進(jìn)行分析。由表2可見，市場上的生、熟肉鵝制品（各10種）中松香的陽性檢出率均高達(dá)80%，AA含量分別在2.82～14.52? μg/g和0.64～9.6? μg/g范圍；生、熟肉鵝制品DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06? μg/g 和0.06～2.62? μg/g范圍。這2種物質(zhì)的陽性檢出率均比較高，表明市場流通領(lǐng)域的肉鵝制品普遍存在松香殘留情況，AA和DHAA的范圍變化比較大，可能與使用的脫毛劑中松香組成、含量分布、 脫毛工藝、加工方式等因素有關(guān)，與前期的研究結(jié)果基本一致。沈金燦等分別采用松香和松香甘油酯模擬肉鴨脫毛，結(jié)果表明這2種脫毛劑均可能導(dǎo)致肉鴨胴體殘留松香［11］。目前市場上流通的肉鵝制品松香殘留率較高，尚不能有效區(qū)分松香殘留的來源究竟是松香還是松香甘油酯。因此，需要更深入研究松香殘留的影響因素，確保脫毛效率的同時，減少或消除松香殘留的發(fā)生。

3結(jié)論

本研究以AA和DHAA作為松香殘留的標(biāo)志物，采用固相萃取前處理、HPLC-PDA/FLR分析對市場上的肉鵝制品中松香殘留情況進(jìn)行普查。該方法可以實現(xiàn)AA和DHAA同時分析檢測，具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點。市場上流通的生、熟肉鵝制品中AA的陽性檢出率均高達(dá)80%，AA含量分別在2.82～14.52? μg/g和0.64～9.6? μg/g范圍，而生、熟肉鵝制品中DHAA的陽性檢出率分別為80%和60%，DHAA含量分別在1.62～10.06? μg/g和0.06～2.62? μg/g范圍。這些殘留的松香最終被消費者攝入，具有潛在的食品安全隱患，應(yīng)該引起更多的關(guān)注。

參考文獻(xiàn)：

［1］陳麗園，張?zhí)┛担≡w，等. 日糧中添加維生素添加劑對皖西白鵝羽絨生長與品質(zhì)的影響［J］. 糧食與飼料工業(yè)，2022（5）：44-47.

［2］馬晶晶，卞歡，王倩，等. 冷鮮鵝二次脫毛與減菌技術(shù)的研究［J］. 食品安全導(dǎo)刊，2021（22）：80-84.

［3］劉恬，張 娜，段仁杰，等. 松香甘油酯在生豬產(chǎn)品脫毛過程中的應(yīng)用［J］. 肉類工業(yè)，2010（12）：11-12.

［4］王院華，劉軍昌，甘泉，等. 屠宰過程中豬蹄、頭脫毛技術(shù)的研究［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（12）：108-109.

［5］王院華，閔成軍，甘泉，等. 屠宰過程中禽類脫毛技術(shù)的研究［J］. 肉類工業(yè)，2007（7）：8-10.

［6］Zhu Y Z，Zhang S Z，Geng Z M，et al. Analysis of abietic acid and dehydroabieticacidresiduesinraw ducks and cooked ducks［J］.Poultry Science，2014，93（10），2663-2667.

［7］張?zhí)K珍，耿志明，王道營，等. 固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸［J］. 食品科學(xué)，2014，35（4）：82-85.

［8］卞歡，仇新媛，李鵬鵬，等. 松香人工抗原的合成及多克隆抗體的制備［J］. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2018，36（6）：51-57.

［9］仇新媛，姚忠，耿志明，等. 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測白條鴨表皮組織中的脫氫松香酸［J］. 肉類研究，2019，33（12）：45-49.

［10］Qiu X Y，Ma J J，Li P P，et al. Development of indirect competitive ELISA for determination of dehydroabietic acid in duck skin and comparison with the HPLC method［J］. Poultry Science，2020，S003257912030119X-.

［11］張?zhí)K珍，卞歡，王道營，等. 食品中松香殘留檢測方法的研究進(jìn)展［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：307-308.

［12］Smith P A，Gardner D R，Drown D B，et al. Detection of resin acid compounds in airborne particulate generated from rosin used as a soldering flux［J］. American Industrial Hygiene Association Journal，1997，58（12）：868-875.

［13］Sderberg T A，Johansson A，Gref R. Toxic effects of some conifer resin acids and tea tree oil on human epithelial and fibroblast cells［J］. Toxicology，1996，107（2）：99-109.

［14］Kamaya Y，Tokita N，Suzuki K. Effects of dehydroabietic acid and abietic acid on survival，reproduction，and growth of the crustacean Daphnia magna［J］. Ecotoxicology & Environmental Safety，2005，61（1）：83-88.

［15］Ren F，Zheng Y F，Liu X M，et al. Thermal oxidation reaction process and oxidation kinetics of abietic acid［J］. RSC Advances，2015，5（22）：17123-17130.

［16］Li Y L，Xu X L，Niu M M，et al. Thermal stability of abietic acid and its oxidation products［J］. Energy & Fuels，2019，33（11）：11200-11209.

［17］陳炳旭. 松香甘油酯獲準(zhǔn)用于畜禽脫毛處理［J］. 肉類工業(yè)，2006（4）：36.

［18］高宏，宋湛謙，王振洪，等. 高穩(wěn)定淺色松香甘油酯的制備［J］. 林產(chǎn)化工通訊，2005，39（5）：1-4.

［19］厚朋祿，劉仕偉，于世濤. 松香甘油酯的合成［J］. 化工科技，2018，26（1）：7-10.

［20］沈金燦，肖陳貴，黃昌雄，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽表皮中松香酸和脫氫松香酸［J］. 食品科學(xué)，2021，42（12）：275-280.

［21］張?zhí)K珍，耿志明，王道營，等. 肉鴨表皮組織中脫氫樅酸殘留的SPE-HPLC檢測方法［J］. 食品科學(xué)，2014，35（16）：101-104.

［22］Zhu Y Z，Zhang S Z，Geng Z M，et al. Simultaneous determination of abietic acid and dehydroabietic acid residues in duck meat by HPLC-PAD-FLD［J］. Food Analytical Methods，2014，7（8）：1627-1633.

［23］張?zhí)K珍，卞歡，王道營，等. 肉鴨經(jīng)松香脫毛后表皮松香殘留的薄層色譜檢測研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，25（5）：117-119.