硒誘導的黃瓜耐鎘轉(zhuǎn)錄本鑒定分析及表達載體構(gòu)建

王小云　孫紅艷　史夢　于佳

摘要：以黃瓜乙烯響應因子CsERF7轉(zhuǎn)錄本為研究對象，通過外源硒緩解黃瓜鎘脅迫試驗分析其表達及黃瓜生長狀況，并克隆CsERF7基因，構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，同時分析CsERF7的理化性質(zhì)和功能。結(jié)果表明，外源硒顯著升高了鎘脅迫引起的黃瓜生長指標的降低，CsERF7在鎘處理下的表達豐度是對照的56%，而鎘+硒比單獨鎘處理上調(diào)表達4.53倍，與RNA-seq結(jié)果相符，此基因可能在硒調(diào)控黃瓜鎘脅迫響應中起作用。同時，成功構(gòu)建超表達載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP，轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因株系。生物信息學分析表明，黃瓜CsERF7基因?qū)儆贏P2/ERF家族的AP2亞家族，開放閱讀框ORF長度588 bp，編碼196個氨基酸，有1個AP2結(jié)構(gòu)域；該蛋白屬于非跨膜親水性蛋白，亞細胞定位預測定位在線粒體中，存在22個氨基酸磷酸化位點；其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸鏈構(gòu)成，與三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果高度一致，所得蛋白序列與黃瓜、甜瓜同源性最高。

關鍵詞：黃瓜；ERF；基因克??；過表達載體構(gòu)建；生物信息分析

中圖分類號：S642.201文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0046-07

黃瓜（Cucumis sativus）是世界范圍內(nèi)普遍種植的蔬菜，是我國設施蔬菜主要栽培種之一，在蔬菜產(chǎn)業(yè)中的地位十分重要；同時兼具清熱利水、健腦安神、潤膚美容等多種功效。我國城市食用黃瓜產(chǎn)地多位于城市近郊，這里同時也聚集較多的城市廢棄物，以及含重金屬的農(nóng)藥、化肥的大量使用，使得我國蔬菜質(zhì)量問題依然堪憂，其中包括鎘在內(nèi)的重金屬污染十分突出。重金屬鎘具有較高的可轉(zhuǎn)移性，能夠被植物的根部吸收，繼而轉(zhuǎn)運至地上部分可食器官并在植物中積累［1］；并通過食物鏈富集于人體引發(fā)多種疾病，嚴重威脅人類健康［2］。因此，治理土壤鎘污染，深入探討黃瓜鎘毒害及耐性的生理與分子機制，發(fā)掘耐鎘關鍵基因，培育耐鎘新品種已經(jīng)成為當前農(nóng)業(yè)科學的研究熱點。

乙烯響應因子ERF（ethylene-responsive factor）是植物界的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物抗病、干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫中具有重要作用，該基因在不同植株中的超表達能夠提高其抗性［3］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及其相互間的序列相似性分為AP2、RAV和ERF 3個主要亞家族［4］，其中AP2蛋白在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中起著重要作用［5］；RAV家族蛋白在生物和非生物脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用［6］；ERF亞家族成員對植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫應答反應有著重要的調(diào)控作用，主要包括植物生長、果實發(fā)育、低溫和干旱脅迫等環(huán)境脅迫［7-8］。

在黃瓜轉(zhuǎn)錄因子ERF研究中，張慧敏等報道CsERF（登錄號：Csa7M448110）是黃瓜葉片中調(diào)控苦味形成的關鍵轉(zhuǎn)錄因子［9］；CsERFs和CsHDAs基因表達水平與黃瓜果實冷害有一定的關系［10］；潘健等報道部分ERF基因家族成員參與雌花分化初期的基因表達調(diào)控［11］。至今，ERF轉(zhuǎn)錄因子與鎘脅迫相關的研究鮮見報道，因此本研究擬以前期通過轉(zhuǎn)錄組學方法篩選獲得應答鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄因子CsERF7為研究對象，驗證其與硒和鎘的調(diào)節(jié)作用關系，通過對目的基因的擴增，構(gòu)建CsERF7過表達載體，并對其進行生物信息學分析，最后利用農(nóng)桿菌花序法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株，為CsERF7功能的深入研究提供依據(jù)，為硒介導的黃瓜耐鎘機理研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以黃瓜津研四號為研究材料，其種子購自太原市種子公司；哥倫比亞野生型擬南芥種子、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞均由武漢艾迪晶生物科技有限公司提供。所用化學試劑均采用普通分析純，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

黃瓜幼苗培養(yǎng)及生理指標測定和RNA測序試驗于2021年10—12月進行，實時熒光定量qPCR驗證、過表達載體及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化試驗于2022年3—5月進行，所有試驗均在太原科技大學生物工程實驗室開展（RNA測序除外），具體試驗處理和方法如下。

1.2黃瓜幼苗的培養(yǎng)及處理

1.2.1黃瓜種子的處理先用2%的H2O2將黃瓜種子消毒20 min，再用蒸餾水沖洗干凈，并浸種2 h后置于22 ℃/18 ℃生長室內(nèi)砂床發(fā)芽。

1.2.2黃瓜幼苗水培試驗設計及分析測定項目黃瓜幼苗長至2葉1心期，選生長均勻一致的黃瓜植株移苗至水培溶液中放置在溫室內(nèi)培養(yǎng)。水培容器為3 L水桶，每桶盛培養(yǎng)液2.5 L，每桶6穴，每穴2株，海綿固定。營養(yǎng)液pH值調(diào)至5.8±0.1，基本培養(yǎng)液預培養(yǎng)7 d后進行鎘、硒處理：對照（CK，基本培養(yǎng)液）、3 μmol/L Se、50 μmol/L Cd、50 μmol/L Cd+3 μmol/L Se，并分別記作CK、Se、Cd、Cd+Se，各處理隨機排列，重復3次；24 h保持通氣，每隔5 d更換培養(yǎng)液。處理10 d后各處理間有了顯著差異，收集葉片，清洗表面灰塵，并在液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中備用；并分析測定黃瓜株高、根長、SPAD值和生物量［12-13］。

1.3RNA-seq高通量測序

采用Illumina HiSeqTM高通量測序平臺在北京諾禾致源科技股份有限公司進行黃瓜葉片RNA-seq測序，原始序列過濾后得到clean reads。選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進行基因組定位分析；經(jīng)過組裝、比較，新轉(zhuǎn)錄本預測；最后，采用HTSeq軟件union模型對各樣品進行基因表達水平分析，采用DEGSeq軟件對構(gòu)建的基因作差異分析，差異基因篩選的閾值設置為q值<0.005，然后篩選硒和鎘處理黃瓜幼苗中差異表達的轉(zhuǎn)錄本。結(jié)合差異表達轉(zhuǎn)錄本的q值及在葉片中的基因表達豐度值，最終選取CsERF7作為本研究對象。

1.4實時熒光定量qPCR驗證

根據(jù)GenBank中β-actin基因（登錄號：XM_011659465）和測序后轉(zhuǎn)錄本CsERF7的序列（登錄號：Csa7G432080），利用Primer BLAST在線設計特異性熒光定量PCR所用引物。引物序列分別為β-actin，F(xiàn)：5′-GAATCCAGCACGATACCA-3′，R：5′-TCAACCCAAAGGCTAACA-3′，預計擴增長度為136 bp；CsERF7，F(xiàn)：5′-CCGAGCTACCTCGCATACAG-3′，R：5′-TCCGAGGTCTAGCAGCTCTT-3′，預計擴增長度為228 bp。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

總RNA的提取采用上述各處理的冷凍葉片，用液氮研磨后采用Trizol法提取，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合超微量紫外可見分光光度計檢測濃度、純度及完整性。cDNA的合成嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書執(zhí)行。PCR反應體系為25 μL，單管含有12.5 μL 2×SYBR green，各0.2 μL上游和下游引物，11.1 μL ddH2O和1 μL cDNA模板。熒光定量PCR在CFX 實時熒光PCR檢測系統(tǒng)（BioRAD）里進行，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次。每個樣品設置3次重復。cDNA產(chǎn)物用Actin引物作參照用于定量RT-PCR，對照（CK）的表達設為1。

1.5過表達載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP的構(gòu)建

CsERF7基因引物設計方法和合成公司同上，并在上下游兩端分別加上保護堿基和EcoRⅠ、HindⅢ 限制性內(nèi)切酶酶切位點（下劃線處序列）。引物序列為F：5′-ACTAGGGTCTCGCACC ATGGCTCGTCCACAACAACG-3′，R：5′-ACTAGGGTCTCTGCC TGTAATAATTTCGAATGATCCGAGGT-3′，預計擴增片段長度為588 bp。

采用上述引物和cDNA模板進行目的片段擴增并回收，與改造后的載體pEGOEP35S-H 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌檢、提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果序列與目的片段序列比對一致，即為該過表達載體構(gòu)建成功。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取100 μL冰凍的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101，加5 μL上述質(zhì)粒DNA；迅速轉(zhuǎn)入37 ℃解凍；在 37 ℃ 溫浴5 min（無振蕩）；加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，28 ℃、260 r/min振蕩，預表達2～4 h；取適當體積均勻涂布于含有抗生素的LB平板；28 ℃ 培養(yǎng)2～4 d，即可觀察到轉(zhuǎn)化子。

挑取單菌落克隆到5 mL LB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24～40 h，作PCR驗證，挑取陽性PCR的克隆1個，將此菌液取100 μL加入100 μL 30%甘油（提前滅菌）。充分渦旋混勻，室溫放置數(shù)小時，每30 min到1 h混勻1次。最后儲藏于-80 ℃待用。

1.7農(nóng)桿菌介導的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

首先，將哥倫比亞野生型擬南芥播種之后用保鮮膜覆蓋達到保溫保濕的效果。待擬南芥長出2張真葉時移栽，移栽后的苗用保鮮膜保濕3～4 d即可揭去保鮮膜，1個月左右蓮座葉可以覆蓋塑料杯，此時幼苗的澆水量要適中。當生長至第1次抽莖產(chǎn)生第1輪花蕾時，摘去該花蕾，在短日照的情況下讓擬南芥營養(yǎng)生長，在侵染1周左右可將其置于長日照下，當其旁支的第2花蕾的枝條長2～10 cm時進行浸染。取出上述-80 ℃保存的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌室溫解凍后浸染花序，第1次侵染前要去除已長出的角果，第1次侵染之后隔1周侵染1次，侵染2～3次，侵染之后植株不能缺水；每次浸染后用塑料薄膜套袋24 h，取掉薄膜后用去離子水洗去殘余菌液，大約3周后等擬南芥角果泛黃干燥后收種子。

將T0種子用75%乙醇洗30 s左右，之后用無菌水清洗2次，再用30%次氯酸鈉浸泡10 min左右，用無菌水洗2～3次，用無菌水浸泡1 h后，用01%的瓊脂水溶液懸浮后，轉(zhuǎn)移至含潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基。待擬南芥長出2張真葉且長勢較好時移栽，移栽后的苗用保鮮膜保濕3～4 d即可揭去保鮮膜，適量澆水，1個月左右蓮座葉可以覆蓋塑料杯。約1個月后，待擬南芥長到一定大小之后用CTAB法提取DNA，進行PCR檢測。

1.8生物信息學分析

使用BLAST對黃瓜CsERF7基因編碼氨基酸序列進行同源性比對；使用Prot-Param分析CsERF7基因基本理化性質(zhì)；利用在線工具NCBI-CDS里的SMART軟件預測蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件NetPhos 3.1分析ERF7蛋白的潛在磷酸化位點；利用PSORT Ⅱ預測ERF7蛋白的亞細胞定位；通過SignalP 4.1 Server在線工具進行信號肽預測分析，在線軟件TMHMM 2.0預測跨膜螺旋區(qū)，SOPMA預測二級結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL進行三級結(jié)構(gòu)預測，使用ProtScale分析蛋白質(zhì)的親疏水性。利用MEGA 11軟件，采用NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用BioAider V1.423軟件進行序列相似性分析。

2結(jié)果與分析

2.1RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

由表1可知，RNA-seq-CsERF7在鎘處理組和鎘+硒復合處理組中的表達豐度非常高，其中鎘處理表達豐度為對照的2.104倍，鎘+硒處理表達豐度為單獨鎘處理的5.600倍，推測其可能在外源硒介導的黃瓜耐鎘脅迫中扮演著重要的角色。因此，選擇CsERF7作為后續(xù)研究對象。

2.2外源硒對鎘脅迫下黃瓜幼苗生長的影響

黃瓜幼苗在50 μmol/L Cd處理5 d后受到了顯著的抑制，主要表現(xiàn)為植株矮化，葉片發(fā)黃（圖1-a）；根長比對照顯著下降36.64%，地上部和根系干質(zhì)量分別比對照下降了31.32%和33.57%，其中根長受到的影響尤為嚴重。3 μmol/L外源硒（Cd+Se處理）顯著緩解了50 μmol/L Cd引起的黃瓜幼苗毒害癥狀，SPAD值較單一鎘處理上升9.61%，同時增加黃瓜生物量積累，對根長和根系干質(zhì)量的緩解效果最為明顯；在無鎘條件下添加硒對黃瓜幼苗的生長沒有顯著效應（圖1-b）。進一步表明，外源亞硒酸鈉能顯著緩解鎘脅迫下黃瓜受到的毒害現(xiàn)象。

2.3CsERF7 qPCR鑒定結(jié)果

為驗證RNA-seq測序結(jié)果的準確性，對CsERF7進行qPCR鑒定。由圖2-a可知，鎘處理CsERF7表達豐度是對照的56%；而鎘+硒復合處理與單獨鎘處理相比表達豐度顯著升高，比單獨鎘處理上調(diào)表達4.53倍。此表達結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果完全相符。

2.4黃瓜CsERF7基因擴增

提取黃瓜幼苗鎘+硒處理的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增后電泳檢測出約588 bp的條帶，說明已成功擴增出黃瓜CsERF7基因編碼區(qū)序列（圖2-b）。

2.5黃瓜過表達載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP的構(gòu)建

將上述目標基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，提取質(zhì)粒并使用EcoRⅠ和HindⅢ 對表達載體進行雙酶切鑒定（圖2-c）；電泳檢測后觀察到預期目的片段793 bp的條帶。經(jīng)測序比對，序列結(jié)果與已知的CsERF7基因序列完全匹配。

2.6擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化研究

利用凍融法將載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以花序浸染法進行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，依次經(jīng)過質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，擬南芥培養(yǎng)、浸染、篩選培養(yǎng)、潮霉素抗性基因的PCR檢測后獲得T1代擬南芥轉(zhuǎn)基因種子（圖3）。

2.7CsERF7生物信息學分析

2.7.1CsERF7基因編碼氨基酸序列分析序列分析結(jié)果表明，CsERF7基因可編碼196個氨基酸（圖4-a），相對分子量為22 393.94 u；在線ProtParam軟件預測CsERF7蛋白理論等電點為6.35，原子總數(shù)為3 080，分子式為C980H1 503N287O302S8，相對分子量為22 393.94 u，帶負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）21個，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）18個，脂肪指數(shù)67.81，總平均親水性預測為-0.753，屬于親水蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為53.24，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.7.2黃瓜ERF7蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測與分析對黃瓜ERF7蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測分析表明，該蛋白屬于AP2/ERF家族、 AP2亞家族， 在多肽鏈的N端第7～70位氨基酸之間存在AP2結(jié)構(gòu)域，代表DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，無其他特征（圖4-a）。

2.7.3黃瓜ERF7蛋白質(zhì)信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)預測分析對黃瓜ERF7蛋白進行信號肽分析， 發(fā)現(xiàn)該蛋

白質(zhì)無信號肽，屬于非分泌型蛋白。利用軟件TMHMM 2.0對黃瓜ERF7蛋白的跨膜螺旋區(qū)進行預測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)，表明該蛋白屬非跨膜蛋白。

2.7.4黃瓜ERF7磷酸化位點、亞細胞定位分析在黃瓜轉(zhuǎn)錄因子ERF7蛋白中，共有22個磷酸化位點，其中16個絲氨酸（S）磷酸化位點、4個酪氨酸（Y）磷酸化位點、2個蘇氨酸（T）磷酸化位點。黃瓜ERF7蛋白的亞細胞定位預測顯示，黃瓜ERF7蛋白65.2%的概率分布在線粒體中，其次分布在細胞核內(nèi)，在細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有分布（表2）；推測黃瓜ERF7轉(zhuǎn)錄因子定位于線粒體中。

2.7.5黃瓜ERF7空間結(jié)構(gòu)與親疏水性分析黃瓜ERF7蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，此蛋白包括103個無規(guī)卷曲，占52.55%；71個α-螺旋，占3622%；15個延伸鏈，占7.65%；7個β-轉(zhuǎn)角，占357%（圖4-a、表3）。

采用SWISS-MODEL進行同源建模，在11個相關蛋白模板的基礎上構(gòu)建出的三級結(jié)構(gòu)模型見圖4-b，其中螺旋部位代表α-螺旋，其余部位代表延伸鏈，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)高度一致。從圖4-b可以看出，此模型的全球性模型質(zhì)量估測結(jié)果（GMQE值）為0.18，序列相似性為53.03%，模型結(jié)果可信。

采用ProtScale分析蛋白質(zhì)親疏水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsERF7蛋白質(zhì)的疏水性最大值1.556在84位點，最小值 -3.256 在158和159位點，平均親水性（GRAVY）為-0.788（圖5）。根據(jù)GRAVY數(shù)值為負可推測黃瓜ERF7蛋白為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.7.6CsERF7基因同源性對比分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將黃瓜CsERF7基因的編碼區(qū)（CDS）序列同源性相近的20個物種（表4）進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖6）顯示，CsERF7基因編碼區(qū)序列與黃瓜XP_011659507.1在系統(tǒng)進化關系上最親密，其次是甜瓜KAA0062846.1和XP_008461170.1，在同一分支下的還有南瓜、西葫蘆、冬瓜，說明它們之間的親緣關系較近；其余的赤豆、木豆等親緣關系較遠。

3討論與結(jié)論

本研究利用前期轉(zhuǎn)錄組試驗數(shù)據(jù)庫，通過克隆成功獲得了CsERF7基因的開放閱讀框（ORF）全長，序列分析結(jié)果表明，CsERF7含有1個AP2保守結(jié)構(gòu)域，ORF全長588 bp，編碼196個氨基酸，屬于AP2/ERF家族的AP2亞家族；黃瓜ERF7有1個絲氨酸（S）磷酸化位點，推測其在ERF7蛋白功能中發(fā)揮作用；該基因與黃瓜XP_011659507.1親緣關系最近，其次是甜瓜KAA0062846.1和 XP_008461170.1。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CsERF7基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在外源硒對鎘脅迫下黃瓜幼苗生長狀態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，外源硒顯著緩解了黃瓜鎘脅迫現(xiàn)象；預測黃瓜CsERF7可能與解毒、耐鎘等生物學功能相關。

目前，有關ERFs在黃瓜上的研究有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控黃瓜苦味基因Bi的表達［9］，也有ERFs參與調(diào)控黃瓜果實貯藏冷害機制［10］，調(diào)控黃瓜果實貯藏冷害及其與膜脂代謝關系的研究［14］；另外， 蒙林平通過轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)， ERFs在油菜素內(nèi)酯誘導黃瓜幼苗疫病的抗性方面發(fā)揮作用［15］，隨后有報道稱ERFs在外源油菜素內(nèi)酯介導的黃瓜耐鹽性方面起調(diào)控作用［16］， ERFⅦ在調(diào)控黃瓜耐澇性的分子機制方面發(fā)揮重要作用［17］，但ERFs在調(diào)控黃瓜耐鎘性上鮮見報道。

本研究已完成了CsERF7基因序列和蛋白分析，CsERF7基因?qū)儆贏P2/ERF家族的AP2亞家族，ORF長度588 bp，編碼196個氨基酸，有1個AP2結(jié)構(gòu)域。該蛋白屬于非跨膜親水性蛋白，亞細胞定位預測定位于線粒體中，存在22個氨基酸磷酸化位點。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和延伸鏈構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果高度一致，同源基因進化樹分析表明該基因與黃瓜XP_011659507.1親緣關系最近，其次是甜瓜XP_008461170.1，同時成功構(gòu)建了植物超表達載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP。本研究克隆得到了黃瓜CsERF7基因，成功構(gòu)建過表達載體pEGOEP35S-H-ERF7-GFP，利用農(nóng)桿菌花序法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)PCR檢測，獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，該研究結(jié)果為該基因功能的深入研究提供了理論依據(jù)和基礎。

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