CYP74A2在白粉菌誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性中的功能及其生物信息學(xué)分析

楊琦　劉思琪　李云仙　楊發(fā)忠

摘要：為明確CYP74A2基因在白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾的抗性過程中的功能，并對CYP74A2作生物信息學(xué)分析，利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達基因進行功能富集分析。結(jié)果表明，α-亞麻酸代謝產(chǎn)生的茉莉酸是白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾抗性的主要揮發(fā)性成分之一，發(fā)現(xiàn)該通路中共有5個CYP74A2差異表達基因，分別是LOC112173678、LOC112172343、LOC112172188、LOC112173396和LOC112169957。采用qRT-PCR驗證CYP74A2基因的功能，利用NCBI、KEGG等數(shù)據(jù)庫找到CYP74A2同源蛋白并結(jié)合ExPASy-ProtParam、TMHMM、SignalP 6.1、MEME、SOPMA、SWISS-MODEL、MEGA 11等在線工具或軟件對CYP74A2進行生物信息學(xué)分析。通過ExPASy-Protparam分析發(fā)現(xiàn)，CYP74A2蛋白分子量都在54.3 ku左右，是一種穩(wěn)定的親水性蛋白。該類蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，少量分布于質(zhì)膜和細(xì)胞核內(nèi)。SOPMA預(yù)測結(jié)果表明該類蛋白以α-螺旋為主，SWISS-MODEL對CYP74A2蛋白三維建模的結(jié)果與SOPMA預(yù)測結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，月季CYP74A2蛋白與草莓CYP74A2蛋白親緣性最近。MEME對蛋白的保守基序分析結(jié)果表明，CYP74A2蛋白具有底物識別位點SRS-1、P450s的保守序列、血紅素結(jié)合域以及血紅素結(jié)合域的Ⅰ型螺旋。研究結(jié)果為探明CYP74A2基因的生物學(xué)功能及白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾抗性的生物分子學(xué)機制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：月季；白粉菌；甜菜夜蛾；CYP74A2；茉莉酸；生物信息學(xué)

中圖分類號：S436.8+1文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0119-09

月季（Rosa chinensis Jacq.）別稱玫瑰、月季花、中國月季，在云南省的鮮切花生產(chǎn)中，切花月季占據(jù)了鮮切花產(chǎn)量的40%以上［1-2］。甜菜夜蛾［Spodoptera exigua （Hübner）］和月季白粉菌［Podosphaera pannosa （Wallr. ∶Fr.）］是云南省月季種植過程中主要的有害生物［3-4］。甜菜夜蛾是鱗翅目夜蛾科的一種雜食性害蟲，其寄主植物達170多種。目前，還沒有對甜菜夜蛾有效的生物防治，而長期使用化學(xué)試劑會導(dǎo)致土壤污染以及甜菜夜蛾耐藥性的增強，據(jù)統(tǒng)計，甜菜夜蛾已對38種有效化學(xué)成分產(chǎn)生抗藥性［5］。

Karban等研究發(fā)現(xiàn)，真菌病原體大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）感染棉花幼苗后，二斑葉螨（Tetranychus urticae）的種群增長速度降低［6］。這一結(jié)果表明，2種高度無關(guān)的生物如果共享同一寄主，它們之間則可能發(fā)生強烈的相互作用，這揭開了由寄主植物介導(dǎo)的病蟲互作關(guān)系的序章。該領(lǐng)域也成為國內(nèi)外研究的熱點［7-9］，但是截至目前，該領(lǐng)域的研究主要是從現(xiàn)象上闡明了共享寄主的病蟲間存在著寄主植物介導(dǎo)的間接互作關(guān)系，而對于互作的生物分子學(xué)機制研究仍不清楚，特別是關(guān)于白粉菌誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的分子生物學(xué)的研究仍然是未知的。研究表明，白粉菌侵染可誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾的抗性［4，10-12］，雖然白粉菌誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的化學(xué)機制已被探明，但其生物分子學(xué)機制仍是未知的。

CYP450s是一種單加氧酶，能催化植物的多種初級和次級代謝反應(yīng)，其催化作用的共同點是在底物分子中加入一個氧原子。CYP450s是一個龐大的家族，包括1 000多個家族和2 500個亞家族，在植物次生代謝方面有著非常廣泛和復(fù)雜的功能，該超家族的特點是結(jié)構(gòu)中均存在“FxxGxRxCxG”的保守血紅素結(jié)合域。CYP450s超家族在植物的脂肪酸代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成、植物激素的生物合成與降解等代謝通路中以及植物抵抗病蟲害方面發(fā)揮了重要作用［13］。而P450的CYP74家族的酶無需氧就可催化脂肪酸過氧化物形成揮發(fā)性物質(zhì)或丙二烯氧化物，該類家族包括2種脫氫酶［丙二烯氧化合酶（AOS）和二乙烯基醚合成酶（DES）］以及2種異構(gòu)酶［氫過氧化物裂解酶（HPL）和環(huán)氧醇合酶（EAS）］［14］。丙二烯氧化合酶是參與α-亞麻酸代謝的主要脫氫酶［15］。亞麻酸屬于脂肪酸，其分解產(chǎn)物之一的茉莉酸（JA）不僅是重要的植物生長調(diào)節(jié)物［16］，還是白粉菌誘導(dǎo)月季對甜菜夜蛾產(chǎn)生抗性的揮發(fā)性成分［17］。

因此，本研究利用月季轉(zhuǎn)錄組中的CYP74A2差異表達基因，通過生物信息學(xué)分析方法分析CYP74A2基因，以確定月季抗甜菜夜蛾關(guān)鍵候選基因?？蔀椴∠x互作機制的系統(tǒng)深入研究提供科學(xué)依據(jù)，為月季鮮切花生產(chǎn)過程中的病蟲害防治提供新思路，為綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的現(xiàn)代植保理念助力，為高原特色現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展提供動力。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為中國月季品種艷粉，采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉種植基地（102.78°E，24.90°N）。

1.2轉(zhuǎn)錄組測序

將感染白粉菌前后的月季葉片用去離子水沖洗揉搓后，分開用液氮冷凍保存。將樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，樣本用Trizol試劑法提取總RNA并去除DNA污染。用NanoDrop 1000檢測RNA純度及濃度后，對2組樣本（每個樣本3次重復(fù)）共6份待測樣本分別富集mRNA，然后將mRNA進行隨機打斷。以mRNA作為模板，合成第1條cDNA鏈，隨后合成第2條cDNA鏈。將雙鏈的cDNA補成平末端后在3′末端加上“A”堿基，最后采用Illumina Novaseq 6000對修飾后的cDNA進行高通量測序。

測序完成獲得該物種的Unigene庫后，利用R語言編寫腳本將Unigene序列與Swiss-Prot（http：//web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html）、GO（http：//www.geneontology.org）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）、NCBI（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/）、Pfam（http：//pfam.xfam.org/）等數(shù)據(jù)庫對比以獲取注釋信息。

參考基因組：Rosa chinensis；參考基因組版本：GCF_002994745.1；參考基因組來源網(wǎng)站：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/11715？genome_assembly_id=366730。

1.3差異表達基因的篩選

獲取注釋信息后對基因進行差異表達分析，從而鑒定出樣本間的差異表達基因。使用DESeq2軟件（版本1.38.0，http：//bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/）對源數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，隨后篩選出組間的P450差異表達基因，篩選條件為 P-adjust<0.05且|log2FC| ≥ 1，采用BH（Benjamini & Hochberg）法校正，上下調(diào)差異倍數(shù)2.0倍。

1.4P450基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對蛋白的等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和分子量等理化性質(zhì)進行分析；利用ExPASy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測蛋白的親疏水性；利用TMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；利用在線工具SignalP 6.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP）對信號肽進行預(yù)測；利用WolfPsort（https：//wolfpsort.hgc.jp）對P450蛋白進行亞細(xì)胞定位；利用在線預(yù)測工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/index.html）對蛋白結(jié)構(gòu)進行分析；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用在線工具SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。通過NCBI序列比對，獲取CYP74A2的同源蛋白后，利用MEGA 11對該類蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（NJ法，Bootstrap值為1 000）。

1.5差異表達基因的qRT-PCR驗證

利用提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，每個樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。以月季染白粉菌前后穩(wěn)定表達的基因LOC112165308為內(nèi)參基因，選擇白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生茉莉酸的5個CYP74A2差異表達基因，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物（表1）， 將月季葉片樣本與引物信息一并送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進行qRT-PCR熒光定量驗證。qRT-PCR的擴增流程為95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸120 s，進行30個循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序及序列比對結(jié)果

以未感病月季葉片樣本為對照組（CK組），感病月季葉片樣本為實驗組（T組）轉(zhuǎn)錄組測序共統(tǒng)計到表達基因37 309個，其中已知基因32 950個，新基因4 359個。各樣品質(zhì)控后的數(shù)據(jù)總量（clean data）均達到6.88 Gb以上，Q20、Q30堿基比例分別在98.20%、94.39%以上，測序堿基平均錯誤率在0.025%以下（表2），結(jié)果表明測序質(zhì)量較好。

與參考基因組相比，定位到基因組上的clean reads占總clean reads數(shù)的86.50%左右。其中，有唯一比對位置的clean reads數(shù)量占比最大，在83.60%～84.45%之間；有多個比對位置的clean reads占比最小，在2.50%左右。reads區(qū)域分布方面，比對到蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）的clean reads占比最大，最高達到87.29%；比對到基因間區(qū)的最小，在0.70%～0.78%之間；比對到內(nèi)含子區(qū)域的也較低，為1.68%～2.04%；而非編碼區(qū)的則在 10.29%～11.34%之間（表3）?？傮w來看，有超過83%的clean reads能定位到基因組中且有唯一比對位置，低于3%的clean reads有多個比對位置。Reads區(qū)域分布中，超過85%的reads比對到編碼區(qū)，比對到非編碼區(qū)的低于12%。

2.2差異表達基因功能富集分析

轉(zhuǎn)錄組測序共統(tǒng)計到1 646個差異表達基因，其中上調(diào)基因1 251個，下調(diào)基因395個。KEGG富集分析結(jié)果表明， 富集到的KEGG通路共81條，有56條通路參與新陳代謝，主要包括酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，萜類化合物和聚酮化合物的代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝等；有12條通路參與了遺傳信息處理，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、DNA復(fù)制、不匹配修復(fù)、同源重組及泛素介導(dǎo)的蛋白水解；有12條通路參與環(huán)境信息處理，主要包括磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、MAPK信號通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；有4條通路參與細(xì)胞過程，主要包括細(xì)胞衰老、內(nèi)吞、壞死；有5條通路參與生物體系統(tǒng)，主要包括植物-病原體相互作用、膽固醇代謝、晝夜節(jié)律等。

差異表達基因的GO功能富集分析結(jié)果表明，共250條GO term被顯著富集。其中，參與分子功能（MF）的GO term共156條，主要包括酶活性、酶抑制劑活性、脂質(zhì)結(jié)合、有機酸結(jié)合、單氧酶活性、氧化還原酶活性等；參與生物過程（BP）的共85條，包括信號傳導(dǎo)途徑、防御反應(yīng)、糖類的分解代謝過程、黃酮類的生物合成及代謝過程、脂質(zhì)分解代謝過程等；參與細(xì)胞組成（CC）的共9條，主要包括細(xì)胞外區(qū)域、葉綠體、膜的整體成分等。圖1為富集最顯著的前20條KEGG通路、GO term。

2.3α-亞麻酸代謝中的CYP74A2差異表達基因

富集程度最顯著的KEGG代謝通路中的α-亞麻酸代謝（圖2）產(chǎn)生的茉莉酸是甜菜夜蛾的天然抗

性化合物，其對甜菜夜蛾的驅(qū)避率達到71%。茉莉酸的生物合成方式為細(xì)胞膜上釋放的α-亞麻酸在脂氧合酶（LOX2S，EC 1.13.11.12）的催化下合成13（S）-氫過氧-亞麻酸［13（S）-HpOTrE］，隨后在丙二烯氧化合酶（AOS，EC 4.2.1.92）和丙二烯氧化環(huán)化酶（AOC，EC 5.3.99.6）的作用下生成12-氧-植物二烯酸（OPDA），OPDA經(jīng)12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR，EC 1.3.1.42）以及3次β氧化后形成茉莉酸，最后在茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（JMT，EC 2.1.1.141）的作用下以茉莉酸為底物生成茉莉酸甲酯。

α-亞麻酸代謝共8個差異表達基因被富集到，包括脂氧合酶基因LOC112191508和丙二烯氧化合成酶基因LOC112173678、LOC112172343、LOC112172188、LOC112173396、LOC112169957，該類基因?qū)儆贑YP450的74亞家族A2（CYP74A2）；12-氧-植物二烯酸還原酶基因LOC112178863以及茉莉酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶基因LOC112174859。

2.4CYP74A2的生物信息學(xué)分析

ProtParam理化性質(zhì)分析結(jié)果（表4）表明，5個P450差異表達基因蛋白的分子質(zhì)量很接近，都在54.3 ku左右。理論等電點預(yù)測上，除LOC112173396等電點為6.81外，其他都大于7。5個差異表達的CYP74A2蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)都小于40，表明此類蛋白為穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)都小于0，表明該類蛋白為親水性蛋白。

ProtScale分析結(jié)果（圖3）也表明，CYP74A2是一類親水性的蛋白質(zhì)。跨膜預(yù)測和信號肽分析結(jié)果表明，該類蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。亞細(xì)胞定位結(jié)果（表4）顯示，CYP74A2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，少量分布于質(zhì)膜和細(xì)胞核內(nèi)。

SOPMA對CYP74A2蛋白預(yù)測的結(jié)果（圖4）顯示，該類蛋白以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，有少量的β-折疊和延伸鏈。利用SWISS-MODEL對CYP74A2蛋白質(zhì)進行三維建模，結(jié)果（圖 5）也表明CYP74A2蛋白主要由α-螺旋和和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與SOPMA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

通過NCBI Protein Blast找到月季CYP74A2同源性最高的蛋白，利用MEME對這些蛋白進行保守基序分析，結(jié)果（圖6）顯示，CYP74A2蛋白與蘋果、草莓、桃、擬南芥的CYP74A2蛋白有極高的同源性。在基序4和基序13中存在底物識別位點 SRS-1，基序10中“WSNG”的序列是P450s的保守序列。基序5為血紅素結(jié)合域，用于血紅素配體結(jié)合的保守半胱氨酸殘基用星號表示，該結(jié)構(gòu)域在P450蛋白中普遍存在，其氨基酸序列特征為“PXAXNKQCAG”?；?中則存在血紅素結(jié)合域的I型螺旋，氨基酸序列特征為“TCFNAXXGXXXF/L”。

將NCBI Protein Blast得到的同源性最高的11個物種的CYP74A蛋白與測序獲得的月季CYP74A2蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖7）表明，月季CYP74A2蛋白與同為薔薇科的草莓CYP74A蛋白親緣性最近，與擬南芥CYP74A蛋白親緣性最遠(yuǎn)。

2.5CYP74A2差異表達基因的qRT-PC驗證

以LOC112165308基因為內(nèi)參基因，對5個CYP74A2基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果表明，LOC112173678、LOC112172343、LOC112172188、LOC112169957這4個基因與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，雖然LOC112173396表達水平略低于轉(zhuǎn)錄組，但其上調(diào)的趨勢仍然一致（圖8）。

3討論與結(jié)論

以中國月季為試驗材料，對白粉菌誘導(dǎo)前后的月季進行轉(zhuǎn)錄組測序， 隨后將鑒定的差異表達基因進行功能富集分析，最后通過生物信息學(xué)分析和qRT-PCR驗證，明確CYP74A2在分泌月季揮發(fā)物中抗甜菜夜蛾的生物分子學(xué)機制。

雖然在很多植物尤其是苔蘚中CYP74家族有很多報道，且月季的全基因組也已公布［18］，但關(guān)于月季作為寄主植物介導(dǎo)的病蟲害互作關(guān)系的生物分子學(xué)機制還未被探明，尤其是關(guān)鍵基因在該互作關(guān)系下的功能及機制。茉莉酸作為參與應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育的重要信號分子，同時也參與了對甜菜夜蛾

的驅(qū)避。其通路中的丙二烯氧化物合酶基因?qū)儆贑YP74A家族，該類酶在催化脂肪酸形成揮發(fā)性物質(zhì)過程中不需要氧。CYP74A2可以將氧脂合酶催化的13（S）-氫過氧-亞麻酸轉(zhuǎn)化成不穩(wěn)定的 12-氧-植物二烯酸，最終經(jīng)過酶催化轉(zhuǎn)化為茉莉酸，該代謝途徑是植物采用的主要防御機制之一。

CYP74A2具有CYP450共有的血紅素結(jié)合域以及該家族所特有的底物識別位點SRS-1結(jié)構(gòu)域［19-20］，有研究表明，CYP74亞家族在氨基酸的 N-末端具有類似質(zhì)體或線粒體的運送肽［21］。另外，血紅素結(jié)合域通常位于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的第330～370位氨基酸，有特征性半胱氨酸并包含標(biāo)志性序列“WSNG”是血紅素結(jié)合環(huán)的一部分［22］。在血紅素結(jié)合域后的第4個殘基上，其他P450s中強烈保守為丙氨酸或甘氨酸，但在CYP74中卻是纈氨酸或異亮氨酸，該位置纈氨酸的功能可能是使CYP74的血紅素傾斜［23］。

茉莉酸類化合物在植物防御方面發(fā)揮了重要的作用，該類化合物的生物合成需要脂氧合酶、丙二烯氧化合酶和丙二烯氧化環(huán)化酶的連續(xù)作用［16，24］。植物界廣泛存在參與JA生物合成的酶，這也反映了植物對具有挑戰(zhàn)性的昆蟲和病原體的防御反應(yīng)的高度保守機制。在植物對昆蟲和病原體的防御機制中，茉莉酸類化合物被認(rèn)為是一個關(guān)鍵的組成部分，也有文獻表明，氧代植物二烯酸也是激活防御機制的必要條件。因此，植物體內(nèi)可能已經(jīng)進化出協(xié)調(diào)與協(xié)同的防御機制［25］，JA和OPDA可能具有協(xié)同作用［26］。

白粉菌誘導(dǎo)月季合成的茉莉酸不僅調(diào)控了植物的新陳代謝，還調(diào)控了甜菜夜蛾的寄主選擇行為，增強了月季的抗蟲性［27］。KEGG功能富集分析和CYP74A2的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明了月季抗蟲性產(chǎn)生的分子生物學(xué)機制。CYP74A2在白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾的抗性方面發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果可為篩選月季抗甜菜夜蛾的關(guān)鍵基因提供重要理論支撐。但白粉菌誘導(dǎo)月季產(chǎn)生對甜菜夜蛾的影響受多個網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，具體調(diào)控途徑仍需深入研究。

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