李小食心蟲GfunOBP2的原核表達(dá)及氣味配體結(jié)合特性

年和粉，張鈺析，李伯遼，陳秀琳，羅坤，李廣偉

李小食心蟲GfunOBP2的原核表達(dá)及氣味配體結(jié)合特性

年和粉1,2，張鈺析2，李伯遼1,2，陳秀琳1,2，羅坤1,2，李廣偉1,2

1陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（延安大學(xué)），陜西延安 716000；2延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000

【目的】通過測定李小食心蟲（）Plus-C氣味結(jié)合蛋白2（odorant binding protein，GfunOBP2）結(jié)合性信息素和蘋果樹揮發(fā)化合物的能力，分析GfunOBP2的嗅覺功能，為闡釋李小食心蟲定位寄主植物的嗅覺分子機(jī)理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肦T-PCR擴(kuò)增2的ORF序列，通過同源注釋和比對氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）的分布模式確定GfunOBP2屬于Plus-C OBP亞家族；利用RT-qPCR檢測2在李小食心蟲3日齡成蟲觸角、頭、胸、足、翅、腹部和性腺中的相對表達(dá)量；構(gòu)建pET30a(+)/GfunOBP2原核表達(dá)載體，在大腸桿菌（）BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)GfunOBP2重組蛋白。利用熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)測定重組GfunOBP2蛋白對5種性信息素和35種蘋果樹揮發(fā)化合物的結(jié)合能力；通過分子對接預(yù)測GfunOBP2與具有強(qiáng)結(jié)合能力的氣味配體的相互作用力及關(guān)鍵氨基酸殘基?！窘Y(jié)果】克隆獲得2（GenBank登錄號：OQ054799.1）的全長序列，共編碼183個氨基酸，氨基酸序列中有12個保守的Cys，其分布模式表明2屬于Plus-C OBP。2主要在成蟲觸角中表達(dá)，在雄蟲觸角中的相對表達(dá)量顯著高于雌蟲觸角（＜0.05）。重組GfunOBP2蛋白對反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇、1-癸醇、己醛、庚醛、乙酸-順-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、-羅勒烯、-石竹烯、-蒎烯和檸檬烯具有強(qiáng)結(jié)合能力，抑制常數(shù)Ki均小于5.0 μmol·L-1。分子對接結(jié)果顯示氫鍵、Donor-Donor相互作用和烷基相互作用是GfunOBP2結(jié)合反-2-己烯-1-醇、1-庚醇和1-癸醇的主要弱相互作用力，氫鍵和碳?xì)滏I是GfunOBP2結(jié)合乙酸-順-3-己烯酯和2-甲基丁酸葉醇酯的主要弱相互作用力，烷基相互作用是GfunOBP2結(jié)合-羅勒烯和-石竹烯的唯一弱作用力。疏水性氨基酸Ile、Pro、Phe、Ala、Leu和Val在GfunOBP2結(jié)合氣味配體中起著重要作用。【結(jié)論】2主要在李小食心蟲成蟲觸角中表達(dá)，重組GfunOBP2蛋白對被測的35種蘋果樹揮發(fā)化合物中的12種具有強(qiáng)結(jié)合能力、對10種化合物具有中等結(jié)合能力，表明其在識別寄主植物揮發(fā)化合物的過程中起著重要作用。研究結(jié)果為證實(shí)Plus-C OBP參與李小食心蟲外周嗅覺通訊提供了理論依據(jù)。

李小食心蟲；化學(xué)感受；氣味結(jié)合蛋白；寄主植物揮發(fā)物；分子對接

0 引言

【研究意義】李小食心蟲（）是鱗翅目卷蛾科的一種重要果樹害蟲，主要以幼蟲蛀果危害，常造成幼果大量脫落，嚴(yán)重影響水果的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。李小食心蟲的寄主有李、郁李、杏、櫻桃、桃等，其中以李受害最重[3-4]。近年來，隨著我國北方蘋果種植面積的不斷擴(kuò)大，李小食心蟲在新疆、陜西、甘肅、吉林等地蘋果園的種群數(shù)量逐年增加，危害日趨嚴(yán)重，在部分蘋果種植區(qū)，李小食心蟲已成為果園食心蟲的優(yōu)勢種類[5-12]。目前，利用性誘劑誘捕和迷向絲迷向是無公害防治該蟲的主要措施[13-14]。由于李小食心蟲雄蛾具有多次交配的習(xí)性，在性誘劑或者迷向劑防治的果園，雌蟲仍可獲得較高的交配率，僅依靠誘捕和迷向防治不能達(dá)到理想的效果。深入開展李小食心蟲定位寄主植物的嗅覺感受機(jī)制研究，篩選能夠顯著增效性信息素的寄主植物揮發(fā)性化合物，可為以嗅覺通訊系統(tǒng)為靶標(biāo)設(shè)置“陷阱”開發(fā)綠色、高效的李小食心蟲行為調(diào)控技術(shù)提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲，雄蟲主要依靠雌蟲釋放的性信息素尋覓配偶完成交配，雌蟲借助寄主植物釋放的揮發(fā)化合物定位最適合子代幼蟲生長的產(chǎn)卵寄主植物[15-18]。性信息素和寄主植物揮發(fā)化合物分子通過昆蟲觸角感器表皮上的微孔進(jìn)入其內(nèi)，氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）能夠選擇性地識別和結(jié)合氣味分子，并攜帶疏水性的氣味分子穿過親水性的感器淋巴液屏障[19-20]。當(dāng)OBP/氣味分子復(fù)合物移動至接近位于嗅覺感受器神經(jīng)元（olfactory receptor neuron，ORN）樹突膜上的氣味受體（odorant receptor，OR）時，由于感器淋巴液酸性逐漸增強(qiáng)導(dǎo)致OBP構(gòu)象發(fā)生變化從而釋放氣味分子，氣味分子被OR識別后激活了OR/Orco（氣味共受體，odorant receptor co-receptor）異源四聚體組成的門控離子通道，將氣味分子的化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娚硇盘朳21-24]。OBP作為昆蟲嗅覺通訊系統(tǒng)中重要的運(yùn)輸?shù)鞍讌⑴c了外周嗅覺識別的初始過程。OBP是一類分子量小、水溶性強(qiáng)、在觸角感器中高濃度（可達(dá)10 mmol·L-1）存在的球狀蛋白[25-26]。OBP通常編碼140—180個氨基酸，典型OBP具有6個保守的半胱氨酸（cysteine，Cys）殘基、1個疏水性的結(jié)合口袋以及3對二硫鍵[27]。在昆蟲長期的進(jìn)化過程中，OBP氨基酸序列中保守的Cys數(shù)量發(fā)生了缺失或增加，根據(jù)保守Cys數(shù)量，將OBP分為典型OBP、Minus-C OBP（具有4個Cys，第2和第5個Cys被其他氨基酸取代）和Plus-C OBP（具有8—12個Cys，在第4和第5個Cys之間存在1個Cys4a，第6個Cys后具有Cys6a和Cys6b）[28-30]。目前，通過敲除（knockout）、敲低（knockdown）昆蟲OBP基因表達(dá)以及利用熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)測定重組OBP結(jié)合配體的能力，證實(shí)典型OBP在昆蟲識別性信息素或寄主植物揮發(fā)化合物中起著關(guān)鍵性的作用[31-34]。相比于典型OBP，Plus-C OBP在昆蟲中數(shù)量少，對其功能研究相對不足，其在嗅覺通訊中的生理功能有待深入研究。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期成功構(gòu)建了李小食心蟲觸角cDNA文庫并進(jìn)行了二代轉(zhuǎn)錄組測序，從中鑒定到23種OBP，其中22種OBP屬于典型OBP，1種OBP屬于Plus-C OBP（命名為GfunOBP2）[11]，借助原核表達(dá)系統(tǒng)和熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)對典型OBP亞家族中的3種普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant binding protein，GOBP）和4種信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，PBP）的嗅覺功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)GfunGOBP能夠結(jié)合性信息素和寄主植物揮發(fā)化合物，GfunPBP對性信息素具有強(qiáng)結(jié)合能力[11-12]。GfunOBP2屬于Plus-C OBP，在序列長度、保守半胱氨酸分布模式、結(jié)合口袋形成等方面與典型OBP存在較大差異，GfunOBP2的嗅覺功能有待進(jìn)一步明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確GfunOBP2與性信息素和寄主揮發(fā)化合物的結(jié)合特性，為Plus-C OBP在李小食心蟲外周嗅覺通訊中的生理功能研究提供理論依據(jù)，進(jìn)一步為開發(fā)以寄主植物揮發(fā)化合物為增效劑的高效性誘劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年在延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院完成。

1.1 試蟲來源及組織樣品收集

所用試蟲為李小食心蟲的雌、雄成蟲，其老熟幼蟲采自于延安市寶塔區(qū)李渠鎮(zhèn)的杏園，在杏成熟期將老熟幼蟲從果實(shí)中移出置于潮濕的沙土中結(jié)繭化蛹。成蟲羽化后分雌、雄置于一次性塑料杯中飼養(yǎng)并飼喂5%蜂蜜水補(bǔ)充營養(yǎng)。不同發(fā)育階段的試蟲均在人工氣候箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，相對濕度60%±5%，光周期16L﹕8D。選擇3日齡健康活潑的成蟲分雌、雄分別收集觸角（400個）、頭（去除觸角）（40個）、胸（20個）、足（100個）、翅（50對）、腹（去除性腺）（10個）、性腺（50個）作為測定2在成蟲不同組織中相對表達(dá)量的樣品。每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)。各樣品收集后立即轉(zhuǎn)至浸于液氮中的無酶離心管中，后保存于-80 ℃低溫冰箱待用。

1.2 GfunOBP2基因克隆和序列結(jié)構(gòu)分析

使用TransZol Up試劑（TransGen Biotech.，中國）參照說明書提取1.1節(jié)中所有樣品的總RNA。以2 μg總RNA為底物模板、oligo(dT)18為引物，利用Thermo scientific RevertAid MM Kit試劑盒（ThermoFisher，美國）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以表1中GfunOBP2- F/R為引物、雄蟲觸角cDNA為模板、2×Taq Plus Master Mix II （Dye Plus）為聚合酶（Vazyme，中國）擴(kuò)增2 ORF的全長序列。PCR目標(biāo)產(chǎn)物使用SteadyPure DNA凝膠回收試劑盒（艾科瑞生物，中國）純化回收后連接至TA/Blunt-Zero克隆載體（Vazyme，中國），然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)選取3個陽性克隆送測序公司測序驗(yàn)證。利用BLASTX比對非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（non-redundant protein sequence database，Nr）對GfunOBP2進(jìn)行同源注釋，選取葡萄花翅小卷蛾（）LbotOBP35、大豆食心蟲（）LglyOBP等17個鱗翅目昆蟲Plus-C OBP的氨基酸序列分析GfunOBP2保守半胱氨酸殘基的分布模式。利用在線程序SignalP-4.1（https://services.healthtech.dtu. dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測GfunOBP2的信號肽、ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)pI。

1.3 GfunOBP2在成蟲不同組織中的相對表達(dá)量檢測

以1.2節(jié)合成的第1鏈cDNA為模板、李小食心蟲和（GenBank登錄號：JX258663.1）為雙內(nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)（StepOnePlusTM，ABI，美國）檢測2在李小食心蟲3日齡雌、雄成蟲觸角、頭（去除觸角）、胸、足、翅、腹（去除性腺）和性腺中的相對表達(dá)量。首先，以李小食心蟲雄蟲觸角cDNA為模板，用無酶水4倍梯度稀釋至4-6，利用表1中基因表達(dá)量檢測引物，優(yōu)化目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增條件，使2、和的擴(kuò)增效率在90%—105%且熔解曲線顯示無非特異性的擴(kuò)增。然后，以獲得的最優(yōu)RT-qPCR條件測定2在李小食心蟲雌、雄成蟲不同組織中的相對表達(dá)量。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃（2和）/59 ℃（）退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)樣品3次技術(shù)重復(fù)。參照文獻(xiàn)[35-36]方法計(jì)算2在不同組織中的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

下劃線表示內(nèi)切酶H I和d III的酶切位點(diǎn)The cutting sites of endonuclease ofH I andd III are underlined

1.4 重組GfunOBP2的原核表達(dá)及純化

設(shè)計(jì)去除信號肽、正反向引物5′端分別帶有H I和d III酶切位點(diǎn)的特異性引物用于原核表達(dá)重組GfunOBP2蛋白（表1）。以李小食心蟲雄蟲觸角cDNA為模板、GfunOBP2-eF/eR為引物，利用2×Taq Plus Master Mix II（Dye Plus）聚合酶擴(kuò)增目的片段。將PCR目的產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收后連接至TA/Blunt-Zero克隆載體，提取TA/Blunt-Zero/GfunOBP2重組質(zhì)粒后用H I和d III內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，同時用以上兩種內(nèi)切酶對表達(dá)載體pET30a(+)進(jìn)行酶切，然后利用T4 DNA連接酶（TaKaRa，大連）將酶切回收后的GfunOBP2 DNA片段連接至線性化的pET30a(+)載體上，先轉(zhuǎn)DH5感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆的質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)至BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將成功轉(zhuǎn)化pET30a(+)/GfunOBP2質(zhì)粒的大腸桿菌（）BL21 (DE3)單克隆菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用終濃度0.5 mmol·L-1異丙基--d-硫代半乳糖苷（isopropyl--d-thiogalactoside，IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測發(fā)現(xiàn)重組GfunOBP2蛋白以包涵體的形式存在，參照Calvello等[37-38]的方法對GfunOBP2的包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性處理。利用Ni-NTA His·Bind Resin（7sea Biotech.，中國）參照說明書對重組GfunOBP2蛋白進(jìn)行純化，利用腸激酶（New England Biolabs.，英國）切除重組蛋白的His-tag，使用BCA蛋白定量試劑盒（中暉赫彩，中國）測定重組GfunOBP2蛋白的濃度。

1.5 重組GfunOBP2蛋白結(jié)合氣味配體的能力

以李小食心蟲雌蟲5種性信息素[39]和蘋果樹35種揮發(fā)化合物[40-41]的化學(xué)合成品作為待測配體，測定重組GfunOBP2蛋白結(jié)合氣味配體的能力。性信息素乙酸-順-8-十二碳烯酯、乙酸-反-8-十二碳烯酯和順-8-十二碳烯醇（有效成分均＞98%）購自北京中捷四方生物科技股份有限公司，乙酸-順-8-十四碳烯酯和乙酸-順-10-十四碳烯酯（有效成分均＞90%）委托沈陽北欣景溢貿(mào)易有限公司合成。35種揮發(fā)化合物來自蘋果樹的花、葉片和果實(shí)，對應(yīng)的化學(xué)合成品購自化學(xué)試劑公司。用色譜級甲醇將熒光探針N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN）和氣味配體配制成100 mmol·L-1的母液，然后稀釋成1 mmol·L-1的工作液。將重組GfunOBP2蛋白用20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）稀釋至2 μmol·L-1的反應(yīng)濃度。利用熒光分光光度計(jì)（F-2700，日本日立公司）在激發(fā)光337 nm、掃描發(fā)射波長370—550 nm條件下測定重組GfunOBP2蛋白結(jié)合氣味化合物的能力。參照實(shí)驗(yàn)室前期測定重組OBP蛋白結(jié)合氣味配體的方法，依次測定重組GfunOBP2蛋白與熒光探針1-NPN的抑制常數(shù)（K1-NPN）以及與不同氣味配體的抑制常數(shù)（Ki）[42-43]。根據(jù)公式Ki=IC50/[l+（1-NPN）/Kl-NPN]計(jì)算GfunOBP2與氣味配體的抑制常數(shù)Ki。IC50表示配體替代1-NPN使蛋白/1-NPN復(fù)合物的初始熒光強(qiáng)度值降低50%時的濃度；1-NPN表示未與蛋白結(jié)合的1-NPN濃度。為了更規(guī)范地描述GfunOBP2結(jié)合配體能力的強(qiáng)弱，參照Huang等[44]的方法，K＜5、5≤K＜10和K≥10 μmol·L-1分別表示蛋白對配體化合物具有強(qiáng)烈、中等和較弱的結(jié)合能力。

1.6 GfunOBP2同源建模及分子對接

以去除信號肽的GfunOBP2序列為查詢序列，利用在線工具NCBI BLASTP（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/）在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）比對與GfunOBP2序列一致性較高的模板序列，根據(jù)GfunOBP2與模板序列的覆蓋度和相似性，選擇以岡比亞按蚊（）AgamOBP47（PDB: 3PM2）的晶體結(jié)構(gòu)為模板利用SWISS-MODEL在線程序（https://swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建GfunOBP2的同源模型，GfunOBP2的3D結(jié)構(gòu)，包括-螺旋、二硫鍵等的顯示利用PyMOL（v 2.5.2）軟件完成。由于在熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)GfunOBP2對反-2-己烯-1-醇、1-庚醇、1-癸醇、乙酸-順-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、-羅勒烯和-石竹烯具有強(qiáng)結(jié)合活性，Ki值均≤4 μmol·L-1。故選擇以上7種氣味配體利用AutoDockTools-1.5.6軟件通過分子對接預(yù)測GfunOBP2結(jié)合氣味配體的弱相互作用力和關(guān)鍵氨基酸殘基[45]。蛋白與配體對接的3D結(jié)構(gòu)圖和2D結(jié)構(gòu)示意圖分別用PyMOL（v 2.5.2）和Discovery Studio 2016（v 16.1）軟件顯示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用單因素方差分析、Tukey多重比較檢驗(yàn)2在雌、雄蟲不同組織中相對表達(dá)量的差異顯著性，相同組織在不同性別中相對表達(dá)量的差異用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 GfunOBP2的克隆和序列特征

2（GenBank登錄號：OQ054799.1）ORF全長552 bp，編碼183個氨基酸，N端有一個由18個氨基酸組成的信號肽。成熟的GfunOBP2蛋白其預(yù)測的分子量和等電點(diǎn)分別為20.41 kDa和4.73。將GfunOBP2與其他17種鱗翅目昆蟲的Plus-C OBP的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GfunOBP2具有12個保守的Cys位點(diǎn)，Cys分布符合Cys1-X12-Cys1a -Cys1b-X13-Cys1c-X19-Cys2-X4-Cys3-X43-Cys4-X11-Cys4a-X7-Cys5-X8-Cys6-X8-Cys6a-X9-Cys6b（X為除Cys以外的其他氨基酸）的模式。此外，Cys6殘基后直接連接一個脯氨酸殘基也是Plus-C OBP的重要特征。BLASTX比對發(fā)現(xiàn)GfunOBP2與葡萄花翅小卷蛾LbotOBP35的序列一致性最高（達(dá)79.78%），與大蠟螟（）GmelGOBP66-like的序列一致性次之（達(dá)56.28%），與種內(nèi)其他22個GfunOBP的序列一致性較低，介于1.6%—9.8%，表明GfunOBP2與近緣種間昆蟲Plus-C OBP同源性更高，而與種內(nèi)其他典型OBP的同源性低，分化程度高。

2.2 GfunOBP2的組織表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，2在雌、雄成蟲觸角、頭、胸、足、翅、腹部和性腺中均有表達(dá)，但相對表達(dá)量存在顯著差異（雌蟲：=1 743.427，=6,14，＜0.001；雄蟲：=7 436.579，=6,14，＜0.001）（圖1）。2主要在觸角中表達(dá)，相對表達(dá)量顯著最高其他組織。2在觸角、頭、翅和性腺中的相對表達(dá)量存在性別差異，在雄蟲觸角（=6.318，=4，=0.003）、頭（=9.674，=4，=0.001）和性腺（=-17.959，=4，＜0.001）中的相對表達(dá)量極顯著高于雌蟲中的，雌蟲翅中的相對表達(dá)量極顯著高于雄蟲中的（=47.399，=4，＜0.001）。2在雌、雄蟲胸（=0.382，=4，=0.722）、足（=0.650，=4，=0.551）和腹（=-2.406，=4，=0.074）中的相對表達(dá)量無顯著差異。從2偏好表達(dá)于觸角中的特點(diǎn)推測其可能參與成蟲的嗅覺通訊過程。

2.3 GfunOBP2重組蛋白的原核表達(dá)和純化

SDS-PAGE檢測顯示，重組GfunOBP2蛋白以包涵體的形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性以及利用Ni-NTA His·Bind Resin融合標(biāo)簽蛋白純化樹脂純化蛋白后得到約24 kDa的蛋白條帶，這與預(yù)測的含有His-tag的重組蛋白分子量大?。℉is-tag：5.45 kDa，去除信號肽的GfunOBP2：18.15 kDa）相一致。為了消除His-tag影響重組GfunOBP2蛋白對配體的結(jié)合能力，用腸激酶成功切除了His-tag（圖2）。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）。柱上不同小寫字母和大寫字母分別表示雌蟲和雄蟲不同組織間的基因表達(dá)量差異顯著（單因素方差分析，Tukey多重比較，P＜0.05）。雙星號和ns分別表示基因相對表達(dá)量在雌、雄蟲相同組織中差異極顯著（P＜0.01）和不顯著（P＞0.05）（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)）

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker；1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的GfunOBP2表達(dá)產(chǎn)物GfunOBP2 expression product without IPTG induction；2：IPTG誘導(dǎo)后的GfunOBP2表達(dá)產(chǎn)物GfunOBP2 expression product after IPTG induction；3：IPTG誘導(dǎo)GfunOBP2表達(dá)產(chǎn)物的上清Supernatant of GfunOBP2 expression product induced by IPTG；4：IPTG誘導(dǎo)GfunOBP2表達(dá)產(chǎn)物的包涵體Inclusion body of GfunOBP2 expression product induced by IPTG；5：純化的GfunOBP2蛋白Purified GfunOBP2 protein；6：腸激酶切除His-tag后的GfunOBP2蛋白GfunOBP2 protein after excision of His-tag using enterokinase

2.4 重組GfunOBP2蛋白與氣味配體的結(jié)合能力

由圖3可以看出，重組GfunOBP2蛋白和1-NPN的結(jié)合存在飽和效應(yīng)，利用Scatchard方程計(jì)算出GfunOBP2和1-NPN的抑制常數(shù)（K1-NPN）為（4.96±0.85）μmol·L-1。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)顯示，在待測氣味配體最大終濃度值為16 μmol·L-1時，40種氣味配體中有31種配體能夠成功替代1-NPN將GfunOBP2/1-NPN復(fù)合物的初始熒光強(qiáng)度值降低50%以上，表明GfunOBP2的結(jié)合譜較寬（表2）。在待測的5種李小食心蟲雌蟲性信息素中，GfunOBP2對乙酸-順-8-十二碳烯酯、乙酸-反-8-十二碳烯酯、順-8-十二碳烯醇和乙酸-順-8-十四碳烯酯具有中等結(jié)合能力。在9種醇類配體中，GfunOBP2對反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇和1-癸醇具有強(qiáng)結(jié)合能力，對1-辛烯-3-醇和異辛醇的結(jié)合能力較弱，對2-丁氧基乙醇和芳樟醇無明顯的結(jié)合能力。在8種醛類配體中，GfunOBP2對己醛和庚醛表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合能力，對十一醛和苯甲醛無明顯的結(jié)合能力，對反-2-己烯醛、辛醛、壬醛和癸醛具有中等結(jié)合能力。在10種酯類配體中，GfunOBP2能夠強(qiáng)烈結(jié)合乙酸-順-3-己烯酯和2-甲基丁酸葉醇酯，對戊酸乙酯和肉豆蔻酸丁酯無明顯結(jié)合能力，對其他6種物質(zhì)表現(xiàn)出中等或者較弱的結(jié)合能力。在2種酮類揮發(fā)物中，GfunOBP2對6-甲基-5-庚烯-2-酮具有中等結(jié)合能力，對2-甲基-6-亞甲基-1,7-辛二烯-3-酮無明顯結(jié)合能力。在6種萜烯類揮發(fā)物中，-羅勒烯和-石竹烯是所有待測物質(zhì)中GfunOBP2最偏好結(jié)合的化合物。此外，GfunOBP2對-蒎烯和檸檬烯也表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合能力。

表2 重組GfunOBP2蛋白對性信息素和蘋果樹揮發(fā)化合物的結(jié)合能力

揮發(fā)化合物來源（根據(jù)文獻(xiàn)報道）Origins of volatiles according to literature reports：a：李小食心蟲雌成蟲性信息素Sex pheromones of female adult of；b：蘋果花Apple flowers；c：蘋果葉片apple leaves；d：蘋果果實(shí)apple fruits?！?”：無法計(jì)算出IC50和Ki值The values of IC50and Kican’t be calculated

圖3 重組蛋白GfunOBP2與1-NPN的結(jié)合曲線及線性化的斯卡查德圖

2.5 GfunOBP2同源建模和分子對接

以岡比亞按蚊AgamOBP47（PDB: 3PM2）為結(jié)構(gòu)模板構(gòu)建了GfunOBP2的3D同源模型（圖4-A），分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)GfunOBP2具有由8個-螺旋形成的球狀結(jié)構(gòu)，GfunOBP2的3D結(jié)構(gòu)中Cys3-Cys159、Cys27-Cys149、Cys28-Cys140、Cys42-Cys67和Cys111-Cys131連接形成5個二硫鍵維持空間構(gòu)型（圖4-B）。由于反-2-己烯-1-醇、1-庚醇、1-癸醇、乙酸-順-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、-羅勒烯和-石竹烯是熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)中與GfunOBP2結(jié)合能力最強(qiáng)的前7種配體（Ki值≤4 μmol·L-1），通過分子對接計(jì)算和預(yù)測了GfunOBP2與以上7種配體的結(jié)合能（表3）以及相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基（圖5、圖6），結(jié)果表明，蛋白結(jié)合口袋內(nèi)部的疏水性氨基酸與氣味分子形成弱相互作用力是GfunOBP2結(jié)合以上配體的重要原因，如GfunOBP2與反-2-己烯-1-醇和1-庚醇均可形成氫鍵、Donor-Donor相互作用和烷基相互作用（圖5-A、5-B），與1-癸醇可形成氫鍵、σ-π鍵相互作用、π-孤對電子作用和烷基相互作用（圖5-C），與乙酸-順-3-己烯酯和2-甲基丁酸葉醇酯主要形成氫鍵和碳?xì)滏I（圖5-D、5-E），與-羅勒烯和-石竹烯僅形成烷基相互作用（圖5-F、5-G）。疏水性氨基酸如Ile、Pro、Phe、Ala、Leu、Val等是GfunOBP2結(jié)合氣味配體的重要氨基酸殘基（圖6）。

A：岡比亞按蚊AgamOBP47的晶體結(jié)構(gòu)Crystal structure of AgamOBP47 from A. gambiae；B：預(yù)測的GfunOBP2 3D模型Predicted 3D model of GfunOBP2；C：AgamOBP47和GfunOBP2的3D結(jié)構(gòu)比對3D structure aligned of AgamOBP47 and GfunOBP2。圖中字母N和C分別表示OBP的N端和C端The letters N and C indicate the N- and C-terminal of OBPs, respectively

圖5 GfunOBP2與部分具有強(qiáng)結(jié)合能力的氣味配體的相互作用力及氨基酸殘基（2D結(jié)構(gòu)）

3 討論

3.1 GfunOBP2的空間結(jié)構(gòu)特征及其與氣味配體結(jié)合和釋放的關(guān)系

本研究克隆了一個在李小食心蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序中鑒定的候選Plus-C OBP基因，命名為2，通過比對GfunOBP2和其他鱗翅目昆蟲Plus-C OBP的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，GfunOBP2具有Plus-C OBP亞家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征和保守的Cys殘基分布模式。GfunOBP2與典型OBP、Minus-C OBP在序列組成上明顯不同，如GfunOBP2的分子量更大（編碼183個氨基酸），具有較長的N-末端且N-末端序列形成了2個小-螺旋；具有5對二硫鍵維持蛋白的空間構(gòu)型，較典型OBP 3對二硫鍵維持的空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[46]。典型OBP和Minus-C OBP具有6個-螺旋[47-48]，而預(yù)測的GfunOBP2具有8個-螺旋，長N-末端形成的2個-螺旋1和2位于結(jié)合腔外，未參與結(jié)合腔的形成，根據(jù)鱗翅目昆蟲OBP釋放氣味的分子機(jī)制[49-50]，推測GfunOBP2在中性或者弱酸性的感覺器淋巴液中結(jié)合氣味分子，當(dāng)?shù)竭_(dá)pH較低的ORN樹突膜附近時，由于其構(gòu)象發(fā)生變化，位于結(jié)合腔外的1和2螺旋進(jìn)入結(jié)合腔中，促使GfunOBP2將結(jié)合的氣味分子釋放出來。典型OBP通常具有較長的C-末端，C-末端的肽鏈在中性感器淋巴液中成伸展構(gòu)象，氣味分子進(jìn)入典型OBP結(jié)合腔形成復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物移動至ORN樹突膜附近的酸性淋巴液時，典型OBP C-末端的肽鏈由伸展構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)?螺旋，進(jìn)入結(jié)合腔促使蛋白將氣味分子釋放出來[51-53]。Tsitsanou等[54]對岡比亞按蚊Plus-C OBP AgamOBP48的晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，AgamOBP48在溶劑中形成同源二聚體，蛋白以同源二聚體形成的疏水腔結(jié)合氣味分子，與Plus-C OBP AgamOBP47形成的單體蛋白明顯不同。尚未見Plus-C OBP在酸性環(huán)境中的晶體結(jié)構(gòu)解析以及蛋白和氣味分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)構(gòu)象的報道，Plus-C OBP結(jié)合和釋放氣味化合物的分子機(jī)制有待深入研究。

圖6 GfunOBP2與部分具有強(qiáng)結(jié)合能力的氣味配體的相互作用力及氨基酸殘基（3D結(jié)構(gòu)）

3.2 GfunOBP2是一種結(jié)合寄主植物揮發(fā)物的廣譜型氣味結(jié)合蛋白

熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GfunOBP2對李小食心蟲雌蟲性信息素和大部分蘋果葉片、果實(shí)揮發(fā)化合物具有結(jié)合活性，表明GfunOBP2參與了該蟲嗅覺通訊中對氣味分子的選擇性感受識別和運(yùn)輸。GfunOBP2對5種性信息素化合物表現(xiàn)出中等或較弱的結(jié)合能力，其結(jié)合性信息素的能力明顯低于3種GfunPBP（GfunPBP1. 1/1.2/2）和3種GfunGOBP（GfunGOBP1/2/3）[11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)疆夜蛾（）Plus-C OBP PsauOBP7對性信息素乙酸-順-11-十六碳烯酯和乙酸-順-9-十四碳烯酯沒有結(jié)合活性[55]、柑橘木虱（）Plus-C OBP DcitOBP2對性信息素月桂酸僅具有較弱的結(jié)合能力[56]，表明Plus-C OBP不是轉(zhuǎn)運(yùn)性信息素的主要OBP。GfunOBP2對蘋果樹揮發(fā)化合物具有較寬的結(jié)合譜，對35種寄主揮發(fā)化合物中的26種具有結(jié)合活性，其中對反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇、1-癸醇、己醛、庚醛、乙酸-順-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、-蒎烯、-羅勒烯、檸檬烯和-石竹烯具有強(qiáng)結(jié)合活性，GfunOBP2對反-2-己烯-1-醇、己醛、庚醛、-羅勒烯和-石竹烯的結(jié)合能力強(qiáng)于GfunGOBP1、GfunGOBP2和GfunGOBP3[11]，表明GfunOBP2能夠選擇性地識別寄主植物揮發(fā)化合物。在其他昆蟲中也證實(shí)Plus-C OBP能夠結(jié)合寄主揮發(fā)化合物或環(huán)境中的揮發(fā)性信息物質(zhì)，如暗黑鰓金龜（）Plus-C HparOBP14能夠結(jié)合寄主植物揮發(fā)化合物6-甲基-5-庚烯-2-酮，有機(jī)肥揮發(fā)化合物3-甲基吲哚、對二甲苯、甲醇、甲醛、-蒎烯和香葉醇[57]；柑橘木虱DcitOBP2能夠結(jié)合寄主揮發(fā)化合物二甲基二硫醚和(+)-檸檬烯[56]。

表3 GfunOBP2與氣味配體的平均結(jié)合能

3.3 GfunOBP2結(jié)合不同類型氣味配體的關(guān)鍵氨基酸殘基及形成的弱相互作用力不同

為了更好地闡明GfunOBP2與不同類型揮發(fā)化合物的結(jié)合特性，本研究利用同源建模和分子對接技術(shù)分析了GfunOBP2與7種具有最強(qiáng)結(jié)合能力（Ki≤4.0 μmol·L-1）的氣味配體的結(jié)合能和關(guān)鍵氨基酸殘基，結(jié)果顯示，GfunOBP2與7種氣味配體的結(jié)合能均為負(fù)值，GfunOBP2與氣味配體的結(jié)合能力與結(jié)合能具有相關(guān)性，結(jié)合能力越強(qiáng)，結(jié)合能越?。ū?），這與已報道的松蛀螟（）[58]、美國白蛾（）[59]、異色瓢蟲（）[60]、多異瓢蟲（）[61]等昆蟲的OBP相似，表明GfunOBP2與不同配體之間存在弱相互作用力。前人通過核磁共振解析OBP的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，OBP通常通過疏水性結(jié)合腔內(nèi)的非極性或極性氨基酸殘基與不同配體形成相互作用力[62-63]。GfunOBP2與3種醇類物質(zhì)反-2-己烯-1-醇、1-庚醇和1-癸醇的結(jié)合均有氫鍵和烷基相互作用力的參與，不同的是GfunOBP2 Ile30的氨基與反-2-己烯-1-醇的羥基、Lys127的氨基與1-庚醇的羥基形成Donor-Donor相互作用力，而GfunOBP2 Phe33的-苯基與1-癸醇的C7碳原子形成了σ-π鍵相互作用、Phe30的-苯基與1-癸醇的羥基氧原子形成了π-孤對電子作用。GfunOBP2結(jié)合兩種酯類物質(zhì)乙酸-順-3-己烯酯和2-甲基丁酸葉醇酯主要由氫鍵和碳?xì)滏I兩種弱相互作用力維持，且與上述兩種配體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基也相同，氫鍵均由Phe33的氨基氫原子與酯類物質(zhì)的羰基氧原子形成、碳?xì)滏I均由Ser133的羥基氫原子與酯類配體的碳原子形成。烷基相互作用力是GfunOBP2結(jié)合兩種萜烯類物質(zhì)-羅勒烯和-石竹烯形成的唯一弱相互作用力，疏水性氨基酸如Val、Leu、Phe、Ile和Pro在形成烷基相互作用力中起著重要作用。本研究僅通過分子對接試驗(yàn)預(yù)測了GfunOBP2結(jié)合氣味配體的關(guān)鍵氨基酸殘基，今后將以上關(guān)鍵殘基作為研究重點(diǎn)，借助定點(diǎn)突變[64-65]和熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵殘基突變后對GfunOBP2結(jié)合配體能力的影響。

4 結(jié)論

2在李小食心蟲成蟲觸角中高表達(dá)，重組GfunOBP2蛋白對蘋果樹葉片、果實(shí)的多種揮發(fā)化合物具有強(qiáng)結(jié)合活性，推測其可能在成蟲寄主植物定位、雌蟲產(chǎn)卵場所選擇等嗅覺行為中發(fā)揮著重要作用。寄主揮發(fā)化合物反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇、1-癸醇、己醛、庚醛、乙酸-順-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、-蒎烯、-羅勒烯、檸檬烯和-石竹烯是GfunOBP2偏好結(jié)合的配體分子。

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Expression and ligand binding characteristics of GfunOBP2 from

NIAN HeFen1,2, ZHANG YuXi2, LI BoLiao1,2, CHEN XiuLin1,2, LUO Kun1,2, LI GuangWei1,2

1Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube (Yan’an University), Yan’an 716000, Shaanxi;2College of Life Sciences, Yan’an University, Yan’an 716000, Shaanxi

【Objective】The objective of this study is to determine the binding affinities of the Plus-C odorant binding protein 2 of(2) to sex pheromones and volatile compounds from apple trees, and to provide a basis for explaining the olfactory molecular mechanism of locating the host plantsof.【Method】The ORF of2 was cloned by RT-PCR, and GfunOBP2 was identified as a Plus-C OBP subfamily protein through homology annotation and alignment of cysteine distribution patterns in amino acid sequences. The relative expression level of2 in the antenna, head, thorax, leg, wing, abdomen, and sex gland of the 3-day-old adults ofwas detected by RT-qPCR. The prokaryotic expression vector pET30a(+)/GfunOBP2 was constructed, and the recombinant GfunOBP2 protein was expressed inBL21 (DE3) cells. The binding affinity of recombinant GfunOBP2 protein to five sex pheromones and 35 plant volatiles of apple trees was determined by using a fluorescence competitive binding assay. The interaction force and key amino acid residues of GfunOBP2 interacting with odorant ligands with strong binding affinities were predicted by molecular docking.【Result】The full-length ORF sequence of2 (GenBank number: OQ054799.1) was cloned, encoding 183 amino acids. It was found that GfunOBP2 has 12 conserved cysteines, and the distribution motif of cysteine residues indicated that GfunOBP2 belongs to the Plus-C OBP subfamily.2 was mainly expressed in the antennae of adults, and the relative expression level in male antennae was significantly higher than that in female antennae (＜0.05). Recombinant GfunOBP2 protein exhibited strong binding affinities to ()-2-hexen-1-ol, benzyl alcohol, 1-heptanol, 1-decanol, hexanal, heptanal,-3-hexenyl acetate,-3-hexenyl 2-methylbutanoate,-ocimene,-caryophyllene,-pinene and limonene, and the inhibition constant (Ki) for each ligand above was less than 5.0 μmol·L-1. The molecular docking results showed that hydrogen bonds, donor-donor interactions, and alkyl interactions are the main weak interactions between GfunOBP2 and ()-2-hexen-1-ol, 1-heptanol, and 1-decanol. The conventional hydrogen bonds and carbon hydrogen bonds are the main weak interactions between GfunOBP2 and-3-hexenyl acetate and-3-hexenyl 2-methylbutanoate. The alkyl interaction is the only weak force of GfunOBP2 interacting with-ocimene and-caryophyllene. Several hydrophobic amino acid residues, including Ile, Pro, Phe, Ala, Leu, and Val, play an important role in GfunOBP2’s binding to odorant ligands.【Conclusion】2 is mainly expressed in the antennae of adults ofand the corresponding recombinant protein has strong binding affinities to 12 of the 35 volatile compounds of apple trees, and has moderate binding affinities to 10 compounds, indicating that GfunOBP2 plays an important role in the process of perceiving and recognizing the volatile compounds of host plants. This study provides a theoretical basis for confirming that Plus-C OBP was involved in the peripheral olfactory communication of.

; chemoreception; odorant binding protein (OBP); host-plant volatile; molecular docking

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.006

2023-03-15；

2023-04-21

國家自然科學(xué)基金（32160636）、延安大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作培育項(xiàng)目（CXY202118）、2021年延安大學(xué)校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃訓(xùn)練項(xiàng)目（D2021099）

年和粉，E-mail：nhf762786194@163.com。通信作者李廣偉，E-mail：liguangwei@yau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）