致馬屬動(dòng)物流產(chǎn)沙門氏菌通用型間接ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用

郭奎，張澤楠，李帥杰，初曉雨，王垚鑫，郭巍，胡哲，王曉鈞

致馬屬動(dòng)物流產(chǎn)沙門氏菌通用型間接ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用

郭奎，張澤楠，李帥杰，初曉雨，王垚鑫，郭巍，胡哲，王曉鈞

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069

【目的】通過篩選引起馬流產(chǎn)的4種沙門氏菌（）共同的優(yōu)勢抗原，建立一種敏感高、特異強(qiáng)的通用型間接ELISA（iELISA）抗體檢測方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)馬群中沙門氏菌抗體的快速高通量檢測?！痉椒ā渴紫壤民R流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清、陰性血清分別與馬流產(chǎn)沙門氏菌全菌抗原進(jìn)行免疫共沉淀（pull down）試驗(yàn)，篩選出馬流產(chǎn)沙門氏菌優(yōu)勢抗原；根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果找到優(yōu)勢抗原基因，將優(yōu)勢抗原基因與其他3種致馬流產(chǎn)沙門氏菌病的鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌進(jìn)行序列比對(duì)驗(yàn)證其保守性；其次根據(jù)抗原性分析對(duì)優(yōu)勢抗原編碼基因進(jìn)行分段表達(dá)，設(shè)計(jì)3對(duì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增沙門氏菌優(yōu)勢抗原基因并將其分別克隆至原核表達(dá)載體pET28a；測序分析后將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌()Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，觀察蛋白的表達(dá)形式；蛋白純化后通過Western blot驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性和廣譜性；然后利用純化后蛋白作為包被抗原，通過對(duì)包被抗原量、血清和第二抗體濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化建立馬流產(chǎn)沙門氏菌病間接ELISA抗體診斷方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性進(jìn)行評(píng)估。最后將該方法應(yīng)用于試驗(yàn)感染馬血清及臨床樣本的檢測，并將檢測結(jié)果同凝集試驗(yàn)結(jié)果比較。【結(jié)果】篩選出的馬流產(chǎn)沙門氏菌優(yōu)勢抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通過序列比對(duì)，該蛋白氨基酸序列與同屬鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR擴(kuò)增后成功獲得3條與預(yù)期符合的目的基因；成功構(gòu)建了pET28a-、pET28a-、pET28a-3個(gè)重組質(zhì)粒。SDS-PAGE結(jié)果表明，在24 ℃、0.6 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)5 h下，含有pET28a-、pET28a-、pET28a-的重組菌均表達(dá)了相應(yīng)蛋白，其中重組ompA1和ompA2蛋白以包涵體形式表達(dá)，重組ompA3蛋白以可溶性形式表達(dá)；Western blot顯示，重組蛋白o(hù)mpA3可與馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明重組ompA3蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為沙門氏菌屬抗血清檢測用抗原；以ompA3蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA方法，在最大P/N比確定的最佳反應(yīng)條件如下：最佳包被抗原濃度為1 μg·mL-1，待檢血清（1﹕200）37 ℃作用1 h，酶標(biāo)抗馬二抗（1﹕10 000稀釋），TMB在37 ℃孵育10 min，待檢血清OD450＞0.143判定為陽性，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該包被抗原與常見馬傳染病陽性血清無交叉反應(yīng)。通過對(duì)沙門氏菌靜脈注射感染馬的血清樣品進(jìn)行抗體檢測，iELISA可以持續(xù)監(jiān)測抗體陽性到116 d，相比微量凝集（69 d）多監(jiān)測了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法對(duì)8個(gè)不同牧場180份血清進(jìn)行抗體檢測，其抗體平均陽性檢出率為63.3%，比微量凝集陽性檢出率高53.9%?！窘Y(jié)論】成功篩選到了馬流產(chǎn)沙門氏菌病4種病原的共同優(yōu)勢抗原ompA，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該蛋白的可溶性表達(dá)，建立了馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用型iELISA抗體診斷方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體的檢測，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高，可以作為馬流產(chǎn)沙門菌病抗體檢測的一種有效工具。

馬流產(chǎn)沙門氏菌??；ompA；通用型；iELISA；診斷

0 引言

【研究意義】通過免疫共沉淀法（pull down）試驗(yàn)篩選到了馬流產(chǎn)沙門氏菌的優(yōu)勢抗原，建立了一種馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用性的ELISA抗體檢測方法，為馬流產(chǎn)沙門氏菌病的診斷和防控奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】沙門氏菌病是一種重要的細(xì)菌性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)、禽業(yè)、鴿業(yè)、馬、驢等產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。馬流產(chǎn)沙門氏菌?。╡quine abortus salmonellosis），又稱為馬副傷寒（equi paratyphoid），是由馬流產(chǎn)沙門氏菌（Abortusequi，Abortusequi）、鼠傷寒沙門氏菌（Typhimurium）、都柏林沙門氏菌（Dublin）、腸炎沙門氏菌（Enteritidis）等引起的以孕馬流產(chǎn)為主要特征的馬屬動(dòng)物傳染病[5-6]。其中馬流產(chǎn)沙門氏菌是最主要的病原，先前也有鼠傷寒沙門氏菌單獨(dú)或與馬流產(chǎn)沙門氏菌混合感染導(dǎo)致驢流產(chǎn)及驢駒腹瀉[7]的報(bào)道，而都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌引起的馬驢發(fā)病并不多見，鮮有報(bào)道。早在18世紀(jì)末19世紀(jì)初，歐美地區(qū)發(fā)生過大批馬流產(chǎn)的現(xiàn)象，20世紀(jì)70年代末，我國華北、西北、東北等養(yǎng)馬地區(qū)也陸續(xù)暴發(fā)馬流產(chǎn)沙門氏菌病，并給當(dāng)時(shí)的馬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。盡管該病在歐洲國家及美國等得到嚴(yán)格控制[8]，但仍有一些國家零散發(fā)生疫情，2016年克羅地亞[9]報(bào)道發(fā)生了2起由馬流產(chǎn)沙門氏菌導(dǎo)致的馬匹流產(chǎn)，流產(chǎn)率分別為11%（2/18）和44%（18/38）；在阿根廷和日本等國家也有報(bào)道[10-11]；我國在20世紀(jì)80年代多次報(bào)道該病[12-15]，但在之后的30多年中鮮有該病的報(bào)道，因此也一直沒有引起行業(yè)內(nèi)對(duì)該病的關(guān)注。關(guān)于馬流產(chǎn)沙門氏菌病，國內(nèi)外的相關(guān)研究并不深入，是一種常被忽視的傳染病。自2014年我國內(nèi)蒙古東部最先出現(xiàn)大批馬流產(chǎn)，流產(chǎn)率高達(dá)66.7%（80/120），此后的幾年里，我國頻繁報(bào)道該病的發(fā)生[4, 16-19]，流產(chǎn)率為20%—100%，該病的發(fā)生直接影響了我國馬匹的存欄量并對(duì)馬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著集約化飼養(yǎng)模式的發(fā)展，驢群感染馬流產(chǎn)沙門氏菌病的現(xiàn)象也不斷出現(xiàn)，給我國養(yǎng)驢業(yè)帶了災(zāi)難性打擊[16-18, 20]。該病目前仍呈蔓延的趨勢，對(duì)我國馬、驢業(yè)的持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了潛在的威脅和巨大的影響，將會(huì)嚴(yán)重阻礙我國馬、驢業(yè)的發(fā)展。關(guān)于馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷血清學(xué)方法，主要有試管凝集試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)、ELISA等；本團(tuán)隊(duì)前期建立了馬流產(chǎn)沙門氏菌微量凝集試驗(yàn)[19]，并利用微量凝集檢測方法對(duì)151份馬血清樣品進(jìn)行了檢測，流產(chǎn)暴發(fā)區(qū)馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體陽性率27.3%—42.9%，相比試管凝集敏感性提高，但陽性檢出率與臨床流產(chǎn)率差距仍很大；國外研究人員利用脂多糖（LPS）建立iELISA抗體檢測方法用于馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體檢測，具有較好敏感性，但特異性仍需要進(jìn)一步評(píng)估[21]。【本研究切入點(diǎn)】目前沒有關(guān)于馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用型的ELISA血清學(xué)診斷方法，傳統(tǒng)的試管凝集和微量凝集都存在敏感性低的缺點(diǎn)，急需建立一種敏感性高、特異性好且可同時(shí)檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌抗體的通用型的ELISA方法。獲得體外表達(dá)的候選蛋白是建立間接ELISA檢測血清抗體的先決條件，本研究首先利用Pull-down試驗(yàn)篩選出馬流產(chǎn)沙門氏菌的優(yōu)勢抗原ompA，而是編碼沙門氏菌的外膜蛋白（outer membrane protein, OMP），編碼的蛋白也是其主要表面抗原成分，在致病機(jī)制中起到重要作用[22]，該蛋白具有良好的免疫原性能刺激宿主產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫和體液免疫[23]；外膜蛋白基因分布廣泛，序列高度保守，屬內(nèi)同源性達(dá)95%以上，與其他屬同源性在68%以下，具有良好的種屬特異性，適合用作沙門氏菌早期感染的診斷特異蛋白[24]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用Pull down篩選馬流產(chǎn)沙門氏菌的優(yōu)勢抗原，明確該抗原的檢測特異性范圍，并將其克隆到表達(dá)載體通過截短分段表達(dá)來實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，旨在建立一種馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用型ELISA抗體診斷方法，為臨床馬流產(chǎn)沙門氏菌病的診斷和防控提供一種有效工具。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年3月至2022年3月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由馬傳染病與慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)進(jìn)行。

1.1 質(zhì)粒和菌株及樣品

馬流產(chǎn)沙門氏菌菌種180316H.AES.G（其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No.18341）由哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)分離鑒定，原核表達(dá)宿主菌Rosetta（DE3）購自TIANGEN，pET28a載體由動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；180份臨床樣品來自8個(gè)不同的牧場，130份沙門氏菌陰性血清、感染馬及對(duì)照馬共58份血清由動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備及保存。馬傳染性貧血病毒（equine infections anemia virus，EIAV）、馬流感病毒（equine influenza virus，EIV）、馬皰疹病毒（equine herpes virus，EHV）、馬動(dòng)脈炎病毒（equine arteritis virus，EAV）、馬泰勒蟲（，）、駑巴貝斯蟲（，）馬鏈球菌（）、大腸桿菌（）、馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等陽性血清由該實(shí)驗(yàn)室制備及保存。

1.2 主要試劑

IPTG購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker DL 2000，T4 DNA連接酶，購自上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品，兔源馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN。HRP標(biāo)記的抗馬IgG二抗（KPL）。

1.3 馬流產(chǎn)沙門氏菌優(yōu)勢抗原的篩選

首先對(duì)馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性、陰性血清IgG的純化，利用0.45 μm濾膜分別將2 mL馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清和陰性血清進(jìn)行過濾處理，抗體純化按照HiTrap Protein G HP（GE）說明書進(jìn)行操作。其次制備馬流產(chǎn)沙門氏菌抗原復(fù)合物，在生物安全柜中取8 mL處于對(duì)數(shù)期的馬流產(chǎn)沙門氏菌新鮮菌液，4 ℃，10 000 r/mim 離心2 min后收集菌體，然后加入2 mL 無菌PBS重懸，離心棄上清，充分清洗菌體2次。然后加入1.5—2 mL無菌PBS重懸，進(jìn)行超聲破碎。功率39%，工作3 s，間歇5 s，工作5 min。最后將細(xì)菌裂解物，4 ℃，10 000 r/min 離心2 min，取上清，利用BCA測蛋白濃度，并調(diào)蛋白濃度為1 mg·mL-1備用。然后參照文獻(xiàn)[25]方法對(duì)馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體與抗原進(jìn)行pull-down試驗(yàn)；最后對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 ompA的克隆

根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果參考序列，將ompA基因按照以下引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1），反應(yīng)體系20 μL：2×Taq Master Mix，10 μL；上下游引物，1 μL；ddH2O，6 μL；模板，2 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃5 min；95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（600 bp 以內(nèi)延伸30 s、600—1 000 bp延伸60 s、1 000—1 500 bp 延伸90 s），共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；待PCR反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。依據(jù)Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書，純化回收特異的DNA條帶。pET28a載體和目的片段分別用H I和I I進(jìn)行雙酶切，回收純化基因和線性化的pET-28a。用T4 DNA連接酶連接ompA基因和線性化的pET-28a，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Rosetta，涂布于卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。對(duì)陽性克隆菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR方法鑒定陽性質(zhì)粒送庫美生物進(jìn)行測序，測序正確后質(zhì)粒命名為pET28a-1、pET28a-2、pET28a-3。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.5 ompA蛋白的表達(dá)

將陽性菌落接種于5 mL含有1 μg·mL-1卡那青霉素（Kanamycin，Kan）的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下170 r/min震蕩培養(yǎng)16 h，以1﹕100比例接種于Kan/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃170 r/min培養(yǎng)，等到菌液OD600nm為0.3—0.4左右時(shí)，加入終濃度為0.6 mmol·L-1的IPTG，24 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后，取4 mL菌液，進(jìn)行富集菌體并加入1.5 mL PBS進(jìn)行超聲破碎，38%功率，超5 s停5 s，工作時(shí)長2 min；破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，上清備用。沉淀同樣用等量PBS沖洗兩遍，再用等量PBS重懸。分別取40 μL上清樣品和沉淀重懸樣品并各加入10 μL 5 x SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻，95 ℃煮沸5 min，利用4%—12%或12%的蛋白膠進(jìn)行SDS- PAGE；電泳結(jié)束后，用于考馬斯亮藍(lán)染色，分析蛋白的表達(dá)情況。對(duì)可溶性蛋白純化后進(jìn)行Western blot分析，分別以馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清和沙門氏菌陰性血清為一抗（1﹕200稀釋），HRP標(biāo)記的抗馬IgG為二抗（1﹕5 000）進(jìn)行Western blot分析，驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性和廣譜性。

1.6 間接ELISA方法的建立

用棋盤法確定最佳ompA3蛋白包被濃度和血清樣品、酶標(biāo)二抗（HRP標(biāo)記抗馬IgG二抗）的稀釋倍數(shù)。用磷酸鹽緩沖液將重組ompA3蛋白稀釋成1、0.5及0.25 μg·mL-1，取100 μL/孔包被96孔酶標(biāo)板4 ℃過夜，將馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性、陰性血清按1﹕200—1﹕1 600進(jìn)行2倍倍比系列稀釋，酶標(biāo)二抗做1﹕8 000、1﹕10 000、1﹕12 000、1﹕15 000稀釋，進(jìn)行間接ELISA，加入TMB，作用10 min酶標(biāo)儀檢測OD450nm值。選取P/N值最大（P/N為陽性血清與陰性血清在相同稀釋度下OD450nm值的比值），且滿足陰性血清OD450 nm＜0.1時(shí)的抗原包被濃度、血清稀釋度、酶標(biāo)二抗稀釋度為最佳反應(yīng)條件。利用建立的間接ELISA方法對(duì)130份馬流產(chǎn)沙門氏菌陰性血清進(jìn)行檢測，計(jì)算全部陰性血清OD450nm的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），并確定X+3SD作為該方法檢測臨床馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體陽性和陰性的臨界值。

1.7 間接ELISA方法的特異性、敏感性檢測

利用建立的iELISA檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌、馬傳染性貧血病病毒、馬流感病毒（H7N7、H3N8）、馬動(dòng)脈炎病毒、馬皰疹病毒（I型、II型、III型、IV型、VII型）、馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、馬腺疫鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等病原的陽性血清，同時(shí)設(shè)立陰性血清對(duì)照，重復(fù)2個(gè)孔，驗(yàn)證該方法的特異性。選取馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清，對(duì)陽性血清先進(jìn)行2倍系列稀釋，然后再利用iELISA方法評(píng)估4種血清的檢測敏感性，其中血清的最大稀釋度即為最大效價(jià)。

1.8 OmpA iELISA監(jiān)測馬流產(chǎn)沙門氏菌感染后馬血清中的抗體水平。

選取沙門氏菌陰性馬，以靜脈方式感染注射100億個(gè)/mL 馬流產(chǎn)沙門氏菌，動(dòng)態(tài)監(jiān)測感染后ompA抗體水平，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組馬以相同方式注射1 mL PBS。感染前采血，感染后前12 d每天采血，然后每隔1周采血一次。同時(shí)利用ompA iELISA與對(duì)感染馬及對(duì)照馬共58份血清進(jìn)行抗體監(jiān)測。

1.9 馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用性間接ELISA方法的臨床應(yīng)用

采用建立的iELISA方法對(duì)4個(gè)來自流產(chǎn)疫情區(qū)及4個(gè)健康區(qū)牧場送檢血清臨床樣本進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果與MAT結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Pull-down探尋馬流產(chǎn)沙門氏菌的優(yōu)勢抗原

通過pull-down試驗(yàn)，相比于對(duì)照組，試驗(yàn)組出現(xiàn)了1條特異性的條帶（圖1，框中標(biāo)記）。將pull-down下來的特異性條帶送去北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果該條帶為ompA蛋白。通過pull-down技術(shù)篩選到的優(yōu)勢抗原將為下一步建立馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

2.2 沙門氏菌ompA基因的克隆

利用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物，將分成不同大小片段擴(kuò)增出來，分別通過酶切后，連接到pET28a上，并轉(zhuǎn)化到Rosetta。測序證實(shí)為沙門氏菌序列。將3個(gè)陽性質(zhì)粒分別命名為pET28a-、pET28a-、pET28a-（圖2）。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清純化后抗體；2：馬流產(chǎn)沙門氏菌陰性血清純化后抗體；3：Beeds+馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清抗體+馬流產(chǎn)沙門氏菌抗原復(fù)合物；4：Beeds+馬流產(chǎn)沙門氏菌陰性血清抗體+馬流產(chǎn)沙門氏菌抗原復(fù)合物；5：馬流產(chǎn)沙門氏菌抗原

M:DM2000DNA Marker；1-2:ompA1；3-4：ompA2；5-6：ompA3

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將鑒定含有pET28a-、pET28a-、pET28a-質(zhì)粒的3種表達(dá)菌進(jìn)行24 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，并將誘導(dǎo)的菌超聲后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色和脫色分析。結(jié)果表明ompA1和ompA2蛋白均以包涵體形式表達(dá)，ompA3蛋白以可溶性形式表達(dá)（圖3）。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：ompA1蛋白誘導(dǎo)后的上清；2：ompA1蛋白誘導(dǎo)后的沉淀；3 ompA2蛋白誘導(dǎo)后的上清；4：ompA2蛋白誘導(dǎo)后的沉淀；5：ompA3蛋白誘導(dǎo)后的上清；6：ompA3蛋白誘導(dǎo)后的沉淀

2.4 ompA3蛋白的驗(yàn)證

以馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性和沙門氏菌陰性血清，進(jìn)行Western blot 分析。結(jié)果表明，馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清均可以與ompA3蛋白反應(yīng)，證實(shí)ompA3蛋白具有較好的保守性，可以作為馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷的通用性抗原（圖4）。

2.5 反應(yīng)條件的確定

通過對(duì)iELISA方法各條件的優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)條件如下：抗原1 μg·mL-1在4 ℃過夜包被，5%的脫脂乳，在37 ℃封閉1.5 h，血清1﹕200稀釋（5%脫脂乳稀釋）37 ℃作用1 h，二抗1﹕10 000稀釋（5%BSA稀釋）37℃作用30 min，TMB顯色10 min（37 ℃）。

2.6 ELISA cut off值的確定

根據(jù)130份沙門氏菌陰性血清的檢測結(jié)果，平均值（X=0.097，和標(biāo)準(zhǔn)差（SD= 0.018）通過生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)算出臨床血清檢測時(shí)陽性和陰性血清的臨界值（X+3SD）為0.143，當(dāng)臨床血清OD值大于臨界值則判為陽性，低于臨界值則判為陰性。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清；2：鼠傷寒沙門氏菌陽性血清；3：都柏林沙門氏菌陽性血清；4：腸炎沙門氏菌陽性血清；5：沙門氏菌陰性血清

2.7 特異性鑒定

利用建立的iELISA方法對(duì)馬流產(chǎn)沙門氏菌、馬傳染性貧血病病毒、馬流感病毒（H7N7、H3N8）、馬動(dòng)脈炎病毒、馬皰疹病毒（I型、II型、III型、IV型、VII型）、馬腺疫鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等陽性血清檢測，結(jié)果顯示，只有馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清的檢測結(jié)果為陽性，而其他病原陽性血清檢測結(jié)果均為陰性。

2.8 敏感性鑒定

對(duì)馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行效價(jià)測定，結(jié)果表明，馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌陽性血清效價(jià)均可以達(dá)到16x。

2.9 人工感染動(dòng)物血清的抗體監(jiān)測

利用MAT和ompA iELISA，對(duì)感染馬及對(duì)照馬進(jìn)行抗體檢測。MAT結(jié)果表明（圖5-A），在以靜脈1010CFU/mL感染馬時(shí)，MAT第4天抗體即可出現(xiàn)陽性，7—12 d達(dá)到頂峰，12 d后抗體水平逐漸下降，維持抗體陽性至69 d，之后抗體轉(zhuǎn)陰性。ompA iELISA結(jié)果表明（圖5-B），第7天抗體轉(zhuǎn)為陽性，比MAT晚3 d。第13—20天，達(dá)到頂峰。之后不斷下降。ompA iELISA維持到116 d仍為陽性水平。

圖5 對(duì)感染馬及對(duì)照馬血清中馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體的監(jiān)測結(jié)果

2.10 臨床樣品檢測

對(duì)來自8個(gè)農(nóng)場的180份血清進(jìn)行檢測（表2），微量凝集結(jié)果表明，對(duì)于有流產(chǎn)流行的4個(gè)農(nóng)場抗體陽性檢出率為7%—42.9%，而非流產(chǎn)流行區(qū)抗體陽性檢出率為0。而本研究建立的ompA iELISA方法，對(duì)于有流產(chǎn)流行4個(gè)農(nóng)場，其抗體陽性檢出率為42.9%—100%，而非流產(chǎn)流行區(qū)，抗體陽性檢出率為0。同時(shí)對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），結(jié)果表明，微量凝集和ompA iELISA檢測結(jié)果均為陽性的樣品份數(shù)是14，檢測結(jié)果均為抗體陰性的是66份，其中ompA iELISA比微量凝集多檢出97份。

表2 臨床樣本的檢測

表3 兩種方法檢測結(jié)果的比較

3 討論

3.1 關(guān)于馬流產(chǎn)沙門氏菌病血清學(xué)診斷方法的現(xiàn)狀與不足

馬、驢流產(chǎn)疾病的發(fā)生對(duì)馬、驢產(chǎn)業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理、細(xì)菌性因素等均可引起馬屬動(dòng)物的流產(chǎn)，其中細(xì)菌性流產(chǎn)占主要部分[26-27]；引起馬、驢流產(chǎn)或副傷寒的細(xì)菌主要有宿主適應(yīng)性的馬流產(chǎn)沙門氏菌，可能還有非宿主適應(yīng)性鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大及流動(dòng)性增加，沙門氏菌混合感染情況可能會(huì)越來越常見，因此建立一種馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用性的血清學(xué)診斷方法尤為重要。傳統(tǒng)的血清學(xué)凝集方法如試管凝集，每次只能稀釋一支試管，操作繁瑣不適合大量樣本的檢測，同時(shí)存在因主觀因素而導(dǎo)致的判讀不準(zhǔn)確，不能作為疾病的精確診斷，微量凝集[19]克服了試管凝集不足，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行稀釋實(shí)現(xiàn)大規(guī)模樣品檢測，但敏感性仍存在不足。而ELISA檢測方法與試管凝集、微量凝集方法相比靈敏度更高，特異性更強(qiáng)[28-29]，國內(nèi)研究人員利用馬流產(chǎn)沙門氏菌全菌包被的ELISA對(duì)樣品進(jìn)行了檢測，其敏感性相比凝集有所提高[30]，但使用全菌包被的缺點(diǎn)是抗原復(fù)雜，相比單一抗原成分特異性可能會(huì)存在不足。

3.2 本研究中候選抗原的選擇

為了提高ELISA特異性、敏感性，本研究采用馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清與馬流產(chǎn)沙門氏菌抗原復(fù)合物孵育進(jìn)行免疫沉淀優(yōu)勢抗原，最終獲得了馬流產(chǎn)沙門氏菌的優(yōu)勢抗原ompA，馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清能夠?qū)mpA抗原沉淀下來，說明ompA在體液免疫中發(fā)揮著非常重要的作用。沙門氏菌種類繁多，ompA蛋白在沙門氏菌屬內(nèi)高度保守，可以作為沙門氏菌屬診斷的候選蛋白，其中馬流產(chǎn)沙門氏菌ompA蛋白在氨基酸上與鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌同源性99.4%—100%，并且能被以上4種沙門氏菌的陽性血清同時(shí)識(shí)別，因此ompA適合作為建立馬流產(chǎn)沙門氏菌病通用型診斷候選蛋白。

3.3 與前人研究方法的對(duì)比

利用ompA3蛋白，本研究通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了馬流產(chǎn)沙門氏菌病ELISA抗體診斷方法。該方法具有良好的特異性，僅與馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的陽性血清反應(yīng)，與馬傳染性貧血病毒、馬流感病毒、馬皰疹病毒等陽性血清均無交叉反應(yīng)。通過感染馬血清及臨床樣品進(jìn)一步評(píng)估了iELISA方法的檢測性能。對(duì)靜脈感染馬流產(chǎn)沙門氏菌馬血清進(jìn)行監(jiān)測，iELISA可以持續(xù)監(jiān)測抗體陽性到116 d，相比凝集試驗(yàn)多監(jiān)測抗體陽性47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。對(duì)于凝集第4天可以檢測到抗體陽性而iELISA第7天才能檢測到抗體陽性現(xiàn)象，我們推測可能與感染方式有關(guān)，后期我們通過肌肉注射方式進(jìn)行感染健康馬時(shí)，發(fā)現(xiàn)凝集試驗(yàn)第8天可以檢測到抗體陽性而iELISA第5天檢測到抗體陽性，iELISA檢測結(jié)果相比凝集提早3 d（數(shù)據(jù)未展示），結(jié)果也驗(yàn)證了我們的猜想。通過對(duì)8個(gè)不同牧場的180份樣品進(jìn)行檢測，ompA iELISA的總體陽性檢出率為63.3%，比微量凝集陽性檢出率高53.9%，證明了ompA iELISA具有更好的敏感性，因此也更適合用于馬流產(chǎn)沙門氏菌病的血清學(xué)診斷。此外，我們對(duì)發(fā)生流產(chǎn)疫情區(qū)微量凝集檢測結(jié)果陽性而ompA iELISA檢測結(jié)果為陰性的3份樣品進(jìn)行了Western blot驗(yàn)證，結(jié)果3份血清均不與ompA蛋白反應(yīng)，僅1份可以與沙門氏菌屬共有的菌鐵蛋白反應(yīng)[25]。既不與ompA反應(yīng)也不與菌鐵蛋白反應(yīng)的2份血清是否與沙門氏菌感染有關(guān)仍需要進(jìn)一步闡明。

3.4 本方法的適用場景和有待研究的問題

沙門氏菌的血清型眾多，是多種人畜共患病原體。其中目前已知可感染馬屬動(dòng)物的只有本研究中涉及的4種致病沙門氏菌，尚未有其他沙門氏菌感染馬屬動(dòng)物的報(bào)道，但理論上不能排除本方法可以檢測其他具有共同ompA抗原的沙門氏菌在感染馬屬動(dòng)物后引起的抗體反應(yīng)。因本研究建立的間接ELISA方法是利用HRP標(biāo)記的抗馬二抗進(jìn)行目標(biāo)抗體的檢測，因此并不適用于其他動(dòng)物如豬、雞沙門氏菌感染的檢測。然而，本方法選擇的包被蛋白是ompA蛋白，該蛋白不僅在馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌內(nèi)高度保守，在沙門氏菌屬內(nèi)也是保守的，如將檢測二抗換成針對(duì)不同物種抗體的標(biāo)記二抗并加以優(yōu)化，同時(shí)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的評(píng)估，也存在進(jìn)一步在其他物種檢測的可能?？傊?，本研究方法針對(duì)目前引起馬流產(chǎn)的4種沙門氏菌感染的抗體檢測具有較好的效果，對(duì)其他沙門氏菌抗體的檢測和應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過Pull-down成功獲得了馬流產(chǎn)沙門氏菌優(yōu)勢抗原ompA，通過Western blot驗(yàn)證ompA蛋白可以與馬流產(chǎn)沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和腸炎沙門氏菌陽性血清反應(yīng)，證實(shí)ompA蛋白具有廣譜性，適合作為馬流產(chǎn)沙門氏菌病的通用型診斷抗原。利用獲得的可溶性ompA3蛋白，成功建立了ELISA抗體檢測方法，并證實(shí)了該方法具有良好的特異性以及沙門氏菌屬的廣譜適用性，可以作為馬流產(chǎn)沙門氏菌病的通用型診斷方法。通過對(duì)試驗(yàn)感染馬樣品及臨床樣品評(píng)估，證實(shí)了該ELISA方法相比微量凝集試驗(yàn)具有更好的敏感性，可以作為馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷的有效工具。

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Development and Application of a Universal iELISA Antibody Assay for Abortion-Causingin Equidae

GUO Kui, ZHANG ZeNan, LI ShuaiJie, CHU XiaoYu, WANG YaoXin, GUO Wei, HU Zhe, WANG XiaoJun

Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Harbin 150069

【Objective】The aim for this study was to identify the predominant antigen ofand to develop a sensitive, specific and universal iELISA assay method for the rapid and accurate detection ofantibodies in equidae.【Method】For the purpose of screening out dominant antigens forAbortusequi, the immunoprecipitation (pull down) tests were performed usingAbortusequipositive/negative sera with whole bacterium antigens ofabortusequi. Then, amino acid sequence alignment of the dominant antigen were compared withtyphimuriumDublin,andEnteritidis to verify itsconservative. Three pairs of specific primers were designed and synthesized according to the nucleotide sequence of the full ompA gene published in GenBank. Three ompA genes with different lengths were amplified by PCR, and then cloned into pET28a vector and transformedRosetta (DE3) competent cell. The expressed products were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Western-blot test after induced by IPTG. The reactivity of the purified protein was verified usingAbortusequi,Typhimurium,Dublin (Dublin), andEnteritidis serums, and one negative serum by Western blot. An indirect ELISA method for the diagnosis of equine abortion salmonellosis was developed by optimizing the amount of coating antigen, serum and secondary antibody concentrations using the purified ompA3 protein as the coating antigen, and evaluating the specificity and sensitivity of the iELISA, and finally applying the iELISA to detection of clinical samples.【Result】In this study, the ompA dominant antigen ofAbortusequi was screened.AbortusequiompA was conservative and showed 99.4%-100% identical withTyphimurium,Dublin andEnteritidis strains at the amino acid level. Three target genes were successfully obtained by PCR amplification. Three recombinant plasmids, including pET28a-, pET28a-, and pET28a-were successfully constructed. The expressed products were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Western-blot test after induced by addition of IPTG to a final concentration of 0.6 mmol·L-1for 5 h at 24 ℃. The recombinant ompA1 and ompA2 were obtained in an inclusion and soluble recombinant ompA3 proteins. The soluble recombinant ompA3 were identified by Western blot, which had a specific reaction with fourpositive serums, therefore, the ompA3 was considered as a potential target candidate for serological detection ofAn iELISA method was developed in a maximum P/N ratio using the coating antigen at a concentration of 1 μg·mL-1, a serum dilution of 1﹕200 and secondary antibody was 1﹕10000. The cutoff value was 0.143, and an OD450value over 0.143 was considered as positive. The specificity test showed that the coated antigen did not cross-react with the positive serum of common equine infectious diseases. The iELISA provided better sensitivity by detecting antibodies in intravenously infected horses, as the iELISA could continue to monitor antibody positivity up to 116 days, 47 days longer than microagglutination test (69 days). The established iELISA method was used to detect antibodies in 180 serum samples from 8 different farms. The average positive rate of iELISA antibody was 63.3%, which was 53.9% higher than that of micro agglutination test.【Conclusion】The soluble ompA3 protein was successfully expressed, and a universal indirect ELISA antibody method was established for the diagnosis of equine abortus salmonellosis. The method enables detection of antibodies toAbortusequi in clinical samples.The method has good specificity and sensitivity and could be a promising candidate tools for use in the monitoring of the equine abortus salmonellosis epidemic.

Equine abortus salmonellosis; ompA; universal; iELISA; diagnostic

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.015

2022-03-25；

2022-05-30

十四五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2021YFD1800500）、“中國-哈薩克斯坦跨境動(dòng)物疫病防控聯(lián)合研究及一帶一路科技合作平臺(tái)建設(shè)”項(xiàng)目（2020YFE0203400）

郭奎，E-mail：guokuiking@163.com。通信作者王曉鈞，E-mail：wangxiaojun@caas.cn。通信作者胡哲，E-mail：huzher@126.com

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