香石竹斑駁病毒屬簡并引物RT-PCR檢測方法的建立

廖富榮，陳紅運，沈建國，方志鵬，黃蓬英，陳青，林玲玲，洪鈞

香石竹斑駁病毒屬簡并引物RT-PCR檢測方法的建立

廖富榮1，陳紅運1，沈建國2，方志鵬1，黃蓬英1，陳青1，林玲玲1，洪鈞1

1廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建廈門 361026；2福州海關(guān)技術(shù)中心，福州 350001

【目的】使用簡并引物RT-PCR方法并結(jié)合序列測定與分析，為甲型香石竹斑駁病毒屬（）、乙型香石竹斑駁病毒屬（）和丙型香石竹斑駁病毒屬（）病毒建立一種快速、靈敏、廣譜的檢測鑒定方法。【方法】通過基因組序列的多重比對分析，在依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守區(qū)域設(shè)計1對簡并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分別加入非互補的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，測試簡并引物RT-PCR方法的廣譜性、特異性和靈敏度，并對PCR產(chǎn)物進行測序、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析。利用該方法對來自廈門的扶桑（）樣品進行病毒檢測?！窘Y(jié)果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a兩對引物建立的RT-PCR方法，擴增甲型、乙型和丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的部分RdRp基因，擴增片段分別約為500和550 bp。該方法成功用于檢測甲型香石竹斑駁病毒屬的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus，AnFBV）、小花矮牽牛斑駁病毒（calibrachoa mottle virus，CbMV）、香石竹斑駁病毒（carnation mottle virus，CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus，PFBV），乙型香石竹斑駁病毒屬的木槿褪綠環(huán)斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV），丙型香石竹斑駁病毒屬的甜瓜壞死斑點病毒（melon necrotic spot virus，MNSV），顯示出良好的廣譜性。特異性檢測表明，簡并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus，MCMV；）、天竺葵線紋病毒（pelargonium line pattern virus，PLPV；）、香石竹環(huán)斑病毒（carnation ringspot virus，CRSV；），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未擴增到預(yù)期大小的條帶。靈敏度檢測表明，簡并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可檢測到10-2稀釋液，簡并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可檢測到10-3稀釋液，在5′端加入非互補的富含AT序列可以提高簡并引物RT-PCR檢測方法的靈敏度。BLAST分析表明，測定的序列均與相應(yīng)病毒種類具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果符合目前通讀病毒亞科（）病毒的分類情況，且可以把病毒鑒定到種的水平。采集13份疑似病毒癥狀的扶桑樣品，均檢出木槿褪綠環(huán)斑病毒。【結(jié)論】基于簡并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的篩查檢測，結(jié)合序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析可進行病毒種類的快速鑒定，并有助于發(fā)現(xiàn)新的病毒種類。廈門扶桑植物受到木槿褪綠環(huán)斑病毒的侵染。

甲型香石竹斑駁病毒屬；乙型香石竹斑駁病毒屬；丙型香石竹斑駁病毒屬；簡并引物；RT-PCR；扶桑；木槿褪綠環(huán)斑病毒

0 引言

【研究意義】香石竹斑駁病毒屬（）又稱麝香石竹斑駁病毒屬、康乃馨斑點病毒屬，為番茄叢矮病毒科（）最大的一個病毒屬（共有8個病毒屬），根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）第九次分類報告，該屬有16種確定種（而后增至19種）、11種暫定種，香石竹斑駁病毒（carnation mottle virus，CarMV）為代表種[1]。在我國僅發(fā)現(xiàn)CarMV[2]、甜瓜壞死斑點病毒（melon necrotic spot virus，MNSV）[3]、木槿褪綠環(huán)斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV）[4]等病毒，多數(shù)病毒還未在我國發(fā)生，具有潛在的檢疫重要性。因此，建立快速、靈敏的廣譜檢測方法，對于保護我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和環(huán)境生態(tài)安全、縮短口岸檢疫部門的檢測周期均具有重要意義。【前人研究進展】目前，番茄叢矮病毒科的分類已經(jīng)進行較大調(diào)整，由原來的8個病毒屬重新劃分為3個亞科（、、）、18個病毒屬，共96種病毒[5-6]。香石竹斑駁病毒屬成員及其暫定種先后被劃分為5個病毒屬，包括牛膝菊病毒屬（）、天竺葵線紋病毒屬（）、甲型香石竹斑駁病毒屬（）、乙型香石竹斑駁病毒屬（）和丙型香石竹斑駁病毒屬（）[7-9]。香石竹斑駁病毒屬病毒粒體為等軸對稱二十面體，直徑約32—35 nm，無包膜，粒體呈圓形，表面粗糙[1,10]。基因組為單分子線形正義ssRNA，長3 879—4 450 nt[1,6]。單分體基因組，含有4個開放閱讀框（ORF），RNA的3′末端無Poly（A）結(jié)構(gòu)，5′端可能有一個甲基化的核苷酸帽子結(jié)構(gòu)[1]。該屬多數(shù)病毒的自然寄主范圍較窄，但實驗寄主范圍較寬。如CarMV自然侵染石竹科植物，但在接種的98種植物中可侵染其中的15科43種植物[11]。該屬病毒極易通過機械傳播，一些病毒可以通過種子或昆蟲種類傳播，以及土壤中的油壺菌傳播[12-13]。如MNSV不僅可以通過機械傳播、還可以通過甜瓜種子[14-15]、黃瓜葉甲（和）[16]、油壺菌（和）[17-18]傳播?；赑CR技術(shù)的分子檢測方法已被廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測中。在該屬病毒中碎米薺褪綠斑點病毒（cardamine chlorotic fleck virus，CCFV）[19]、CarMV[20-21]、豇豆斑駁病毒（cowpea mottle virus，CPMoV）[13]、HCRSV[22]、日本鳶尾壞死環(huán)斑病毒（Japanese iris necrotic ring virus，JINRV）[23]、MNSV[24]、PFBV[25]等均有相應(yīng)的RT-PCR檢測方法。這些特異性RT-PCR檢測方法為該屬提供了一種快速的分子檢測方法，但一次只能用于檢測一種特定的病毒?；诤啿⒁锏耐ㄓ肦T-PCR檢測方法則可實現(xiàn)多目標檢測，即在一次實驗中可以檢測一個屬、科中不同種類的病毒，如雙生病毒[26]、馬鈴薯Y病毒科[27]、馬鈴薯X病毒屬[28]。針對香石竹斑駁病毒屬及其相關(guān)病毒，Morozov等[29]據(jù)依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）保守區(qū)域設(shè)計簡并引物Carmo-II/Carmo-VI，成功用于檢測玉米褪綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus，MCMV）、TCV、紅三葉草壞死花葉病毒（red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）、香石竹環(huán)斑病毒（carnation ringspot virus，CRSV）、番茄叢矮病毒（tomato bushy stunt virus，TBSV）、PFBV。楊雷亮等[30]根據(jù)外殼蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計了引物CarMV-F1/CarMV-F2，成功檢測了8種病毒。此外，美國Agdia公司也有商品化的檢測引物在出售，并通過16種病毒的實驗驗證[31]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，隨著研究的不斷深入，對原香石竹斑駁病毒屬病毒的分類進行了較大調(diào)整，分類歸屬趨于完善，并且不斷有新的病毒種類被發(fā)現(xiàn)。在原屬的16種病毒中已有14種病毒的基因組序列均被測定，原暫定種中也已測定6種病毒的基因組序列。因此，根據(jù)新的分類情況，研究建立甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的RT-PCR檢測方法，可以為該類病毒提供一種快速、靈敏、特異的檢測方法，進一步提高檢測效率、縮短檢測周期、節(jié)約檢測成本?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過病毒基因組序列比對分析、根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，研究建立甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬的廣譜RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)一次試驗檢測不同種類的病毒；同時，經(jīng)序列測定、比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，實現(xiàn)病毒種類的快速鑒定。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在廈門海關(guān)技術(shù)中心植物檢疫實驗室完成。

1.1 試驗材料

供試病毒分離物樣品來自各商業(yè)公司（表1），健康植物樣品來自本實驗室，扶桑病葉（褪綠、黃化、斑駁、卷葉等癥狀）采自廈門湖里區(qū)（XM1—XM3）、海滄區(qū)（XM4—XM9）、思明區(qū)（XM10—XM13）。

1.2 引物設(shè)計與合成

從NCBI中下載甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒完整的基因組序列（表2），用BioEdit中的ClustalW進行序列多重比對[32-33]，根據(jù)保守性區(qū)域設(shè)計簡并引物，包括上游引物Carmo-F2和下游引物Carmo-R2，以及引物Carmo-F2a/R2a，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表3）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取緩沖液 樣品提取緩沖液為ELISA常規(guī)使用的緩沖液。1 L緩沖液中含NaCl 8.0 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO41.15 g、KCl 0.2 g、聚乙烯吡咯烷酮（(C6H9NO)n，MW 24 000—40 000）20 g，pH 7.4。

1.3.2 樣品前處理 凍干粉末：加入1 mL樣品提取緩沖液，混勻，取200 μL上清液用于核酸提取。

病葉或其他組織：取50—100 mg病葉或莖稈，用研缽研磨；或放入2 mL離心管中并加入兩粒直徑4 mm的不銹鋼珠，用組織研磨儀研磨（MM400，Retsch GmbH），在振蕩頻率18次/s下運行1 min。去除不銹鋼珠，加入1 mL的樣品提取緩沖液，混勻，8 000×離心2 min（或4 ℃冰箱中靜置過夜），取200 μL上清液用于核酸提取。

圖4為控制系統(tǒng)的主電路，主電路主要包括：總電源回路、主油泵電動機電源回路、控制器電源回路、直流電源回路和伺服電源回路。

1.4 核酸提取

用E.Z.N.A.TM植物RNA提取盒（R6827，Omega Bio-Tek）提取總核酸，略有刪減。即：取200 μL的樣品上清液，省略去基因組DNA步驟后，根據(jù)操作說明提取總核酸，最后分兩次加入50 μL經(jīng)65 ℃預(yù)熱的DEPC處理水，在10 000×下洗脫核酸。

1.5 RT-PCR方法

采用上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液Eastep?RT Master Mix（LS2052）進行反轉(zhuǎn)錄。在0.6 mL離心管中加入5×RT Mix 4 μL、RNA模板16 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)30 min（如需要可延長至1 h）、98 ℃滅活5 min。

表1 本研究使用的病毒分離物

*中國檢驗檢疫科學研究院 Chinese Academy of Inspection and Quarantine

表2 用于引物設(shè)計的病毒基因組序列

表3 根據(jù)甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒基因組序列保守區(qū)域設(shè)計的簡并引物

* R (A,G), Y (C,T), M (A,C), K (G,T), S (G,C) , W (A,T), H (A,T,C), B (G,T,C), V (G,A,C), D (G,A,T), N (A,T,G,C)；下劃線為非互補的富含AT序列Underlines are the non-complementary 5′ AT-rich sequences

采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的Easy Taq DNA聚合酶（AP111）進行PCR擴增。10×PCR緩沖液5 μL、dNTP（10 mmol·L-1）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.6 μL、上游引物（10 μmol·L-1）4 μL、下游引物（10 μmol·L-1）4 μL、cDNA模板3 μL、無核酸酶水32.4 μL，總體積50 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；接著94 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，5個循環(huán)；然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

取5 μL擴增產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察、拍照。

1.6 一步RT-PCR方法

利用南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript?II One Step RT-PCR Kit（P612）進行一步RT-PCR擴增，在PCR管中配制反應(yīng)液。2×One Step Mix 25 μL、One Step Enzyme Mix 2.5 μL、上游引物（10 μmol·L-1）4 μL、下游引物（10 μmol·L-1）4 μL、RNA模板3 μL、無核酸酶水11.5 μL，總體積50 μL。

反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.7 特異性檢測

分別提取健康寄主植物（西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆）葉片及其他相關(guān)病毒（MCMV、CRSV、PLPV）病葉總RNA，利用所建立的RT-PCR方法進行檢測，驗證方法的特異性。

1.8 靈敏度檢測

把含有HCRSV的總RNA進行10倍系列稀釋（即10-1—10-6），然后用建立的方法進行RT-PCR擴增，以檢測其靈敏度。

1.9 序列測定與分析

PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行正反向測序。序列拼接后，用BLAST、MEGA X、PhyloSuite等軟件進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析[34-36]。其中，用MAFFT進行多重序列比對分析[37]，最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗（bootstrap）1 000次[38]。

2 結(jié)果

2.1 簡并引物設(shè)計

通過對16種甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的基因組序列比對分析，根據(jù)RdRp基因的保守區(qū)域設(shè)計上游引物Carmo-F2和下游引物Carmo-R2（圖1、表3）。其中，引物Carmo-F2a/R2a為在引物Carmo-F2/R2的5′端分別加入一段非互補的富含AT序列后組成的新引物。這兩對引物用于擴增RdRp部分序列，預(yù)計擴增長度分別約為500和550 bp。序列比對分析表明，本研究所設(shè)計的簡并引物Carmo-F2/R2與Morozov等設(shè)計的簡并引物Carmo-II/VI[29]都是根據(jù)兩個相同的保守區(qū)域設(shè)計的、擴增同一區(qū)域的RdRp基因，但簡并引物的長短及個別堿基上存在差別。通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)文獻報道的簡并引物Carmo-II在中間位置缺少1個堿基，這可能是早期排版錯誤造成的。根據(jù)序列比對結(jié)果，對原引物進行修正，形成引物Carmo-II2/VI2（表4）。

2.2 簡并引物的廣譜性檢測

利用簡并引物Carmo-F2/R2對7種不同種類的香石竹斑駁病毒屬病毒進行RT-PCR擴增。結(jié)果表明，7種病毒的11個分離物中，AnFBV的LPC36600（Agdia）、CbMV的LPC83000（Agdia）、HCRSV的LPC12300（Agdia）、PFBV的LPC90000（Agdia）、CbMV的07008PC（Loewe）、PFBV的07073PC（Loewe）、MNSV的07097PC（Loewe）等6種病毒的8個分離物可以擴增到約500 bp的預(yù)期大小條帶（圖2-A）。其中，CarMV的LPC68000（Agdia）分離物還產(chǎn)生約550 bp的非預(yù)期大小條帶，而07057PC分離物（Loewe）產(chǎn)生的預(yù)期大小條帶則很弱。PLPV的07094PC（Loewe）可以產(chǎn)生一條約600 bp的條帶，但重復(fù)性差。

表4 香石竹斑駁病毒屬相關(guān)病毒的簡并引物

* R (A,G), Y (C,T), M (A,C), K (G,T), S (G,C) , W (A,T), H (A,T,C), B (G,T,C), V (G,A,C), D (G,A,T), N (A,T,G,C)；下劃線為I和I的位置Underlines are the sites ofI andI

圖1 用于設(shè)計簡并引物的香石竹斑駁病毒屬保守區(qū)域

引物Carmo-F2a/R2a的核心序列與引物Carmo-F2/R2相同，區(qū)別在于引物的5′端分別加入一段非互補的富含AT的序列。RT-PCR結(jié)果表明，在6種病毒的8個分離物可以擴增到約550 bp的預(yù)期大小條帶，CarMV的LPC68000（Agdia）分離物還產(chǎn)生一條約400 bp的非預(yù)期大小條帶，而CarMV的07057PC（Loewe）和PLPV的07094PC（Loewe）分離物產(chǎn)生的條帶很弱（圖2-B）。該結(jié)果與簡并引物Carmo-F2/R2的RT-PCR結(jié)果類似。

利用一步法試劑進行一步RT-PCR擴增，結(jié)果表明也可以擴增到約500 bp的預(yù)期條帶，但在常規(guī)RT-PCR條帶比較弱的樣品中沒有擴增到預(yù)期大小條帶（圖2-C、2-D）。在常規(guī)RT-PCR擴增中，CbMV的LPC83000（Agdia）和07008PC（Loewe）分離物均擴增到約400 bp的非特異性條帶，而在一步RT-PCR中沒有該非特異性條帶。因此，該結(jié)果初步表明，本研究所使用的一步RT-PCR試劑的檢測靈敏度可能比較低，但具有更好的特異性。

M：100 bp DNA Ladder；1：AnFBV (Agdia LPC36600)；2：CarMV (Agdia LPC68000)；3：CbMV (Agdia LPC83000)；4：HCRSV (Agdia LPC12300)；5：PFBV (Agdia LPC90000)；6：CarMV (Loewe 07057PC)；7：CbMV (Loewe 07008PC)；8：PFBV (Loewe 07073PC)；9：PLPV (Loewe 07094PC)；10：MNSV (Agdia LPC12402)；11：MNSV (Loewe 07097PC)；12：空白對照Blank control

2.3 特異性檢測

利用所建立的方法對健康寄主植物葉片及其他相關(guān)病毒進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，簡并引物Carmo-F2/R2及Carmo-F2a/R2a均不能從健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆擴增到與陽性樣品大小一致的條帶（圖3）。此外，在含有MCMV、CRSV、PLPV的陽性樣品中，也沒有擴增到預(yù)期大小條帶（部分結(jié)果未顯示）。因此，該方法具有良好的特異性，在寄主植物中及同科的其他病毒中均未產(chǎn)生非特異性擴增。

M：100 bp DNA Ladder；1：西瓜Watermelon；2：甜瓜melon；3：南瓜Squash；4：大豆Soybean；5：豌豆Pea；6、8：HCRSV陽性樣品HCRSV positive sample；7、12：空白對照Blank control；9：MCMV；10：CRSV；11：PLPV

2.4 靈敏度檢測

把含有HCRSV的病葉總RNA進行10倍系列稀釋，然后用Carmo-F2/R2和Carmo-F2a/R2a分別進行常規(guī)RT-PCR和一步RT-PCR檢測。常規(guī)RT-PCR檢測結(jié)果表明，當RNA稀釋至1 000倍時，簡并引物Carmo-F2/R2擴增到條帶已經(jīng)很弱，很難看到明顯的條帶（約500 bp），而簡并引物Carmo-F2a/R2a可以明顯擴增到預(yù)期大小條帶（約550 bp）（圖4）。一步RT-PCR檢測結(jié)果表明，簡并引物Carmo-F2/R2和Carmo-F2a/R2a均可從稀釋100倍的病葉中擴增到預(yù)期大小條帶，但稀釋至1 000倍時，簡并引物Carmo-F2/R2已經(jīng)基本看不到條帶，引物Carmo-F2a/R2a擴增到的條帶也比較弱（圖5）。因此，無論是一步RT-PCR還是兩步RT-PCR，簡并引物Carmo-F2/R2和Carmo-F2a/R2a均有良好的靈敏度，可以滿足日常檢測的需要。在簡并引物中引入一段富含AT的序列后，可以提高簡并引物RT-PCR方法的檢測靈敏度。

M：100 bp DNA Ladder；1—6：10-1—10-6系列稀釋serial dilutions；7：空白對照Blank control。圖5同The same as Fig. 5

圖5 簡并引物Carmo-F2/R2和Carmo-F2a/R2a一步RT-PCR的靈敏度檢測

2.5 在檢測扶桑病毒中的應(yīng)用

利用所建立的RT-PCR方法，對疑似病毒癥狀的13份扶桑樣品進行檢測。結(jié)果表明，簡并引物Carmo- F2/R2和Carmo-F2a/R2a從扶桑樣品中均擴增到約500或550 bp條帶（圖6，部分結(jié)果）。該結(jié)果初步表明，扶桑樣品中含有香石竹斑駁病毒屬病毒。

2.6 序列測定與分析

簡并引物Carmo-F2/R2或Carmo-F2a/R2a成功用于PCR產(chǎn)物的序列測定（GenBank登錄號為OQ726001 —OQ726008）。其中，CarMV的LPC68000（Agdia）條帶比較弱，測序未成功。經(jīng)序列拼接，去除引物位置序列后，獲得458—464 bp序列。BLSATn分析表明，所獲得序列均與相應(yīng)病毒序列具有最高序列一致性（表5），與其他種類的序列一致性則較低。所獲得的序列均為RdRp基因序列，為預(yù)期的擴增區(qū)域。因此，簡并引物Carmo-F2/R2或Carmo-F2a/R2a可用于檢測不同種類的甲型、乙型和丙型香石竹斑駁病毒屬病毒，結(jié)合序列分析可用于種類的快速鑒定。

1-3: XM1-XM3; 4-6: XM4-XM6; 7-9: XM7-XM9

表5 簡并引物RT-PCR擴增序列的BLASTn結(jié)果

扶桑樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定后，進行正反向拼接，去除引物位置序列后，獲得長458 bp的序列（GenBank登錄號為OQ725988—OQ726000）。BLASTn分析表明，不同分離物均與已知的木槿褪綠環(huán)斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV）（MK279671.1、OK636421.1、OP779319.1、KY933060.1、KC876666.1、X86448.2、MT512573.1、DQ392986.1、MN080500.1）具有最高序列一致性（表6）。因此，該結(jié)果表明，扶桑上的香石竹斑駁病毒屬病毒為HCRSV。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

對簡并引物RT-PCR擴增相應(yīng)區(qū)域的通讀病毒亞科（）病毒的核苷酸序列和氨基酸序列分別進行系統(tǒng)發(fā)育分析。核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明，甲型、乙型香石竹斑駁病毒屬、玉米褪綠斑駁病毒屬（）、番茄叢矮病毒屬（）均可單獨成一分支（圖7-A）。在7種天竺葵環(huán)斑病毒屬（）病毒中，除鐵線蓮?fù)示G斑駁病毒（clematis chlorotic mottle virus，ClCMV；NC 033777）顯示出與乙型香石竹斑駁病毒屬具有更近親緣關(guān)系外，其他6種病毒均可單獨形成一個分支，顯示出更近的親緣關(guān)系。在4種丙型香石竹斑駁病毒屬病毒中，大豆黃斑駁花葉病毒（soybean yellow mottle mosaic virus，SYMMV；NC_011643）和豇豆斑駁病毒（cowpea mottle virus，CPMoV；NC_003535），豌豆莖部壞死病毒（pea stem necrosis virus，PSNV；NC_004995）和甜瓜壞死病毒（melon necrotic spot virus，MNSV；JX879088等）可分別形成兩個明顯的分支，其中SYMMV（NC_011643）和CPMoV（NC_003535）顯示出與甲型、乙型香石竹斑駁病毒屬和天竺葵環(huán)斑病毒屬更近的親緣關(guān)系。在本研究所測定AnFBV、CarMV、CbMV、HCRSV、MNSV和PFBV的病毒分離物中，均可與已知相應(yīng)病毒種類形成獨立分支，顯示出很近的親緣關(guān)系。在所測定的13個扶桑HCRSV廈門分離物中，均可與已知的HCRSV分離物形成獨立分支，顯示很近的親緣關(guān)系，該結(jié)果進一步證實廈門的扶桑受到HCRSV侵染。因此，利用簡并引物RT-PCR擴增區(qū)域的核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，可以對甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒進行種類鑒定。

使用MAFFT進行序列比對，最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。節(jié)點上的數(shù)值為1000次重復(fù)后的自舉檢驗值。比例尺代表每個位點替代?！罕狙芯渴褂玫牟《痉蛛x物?！瘢簭B門扶桑中檢測到的HCRSV

表6 廈門扶桑病毒的BLASTn結(jié)果

氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明，通讀病毒亞科中各病毒屬均可獨立形成一個分支（圖7-B）。其中，甲型香石竹斑駁病毒屬與天竺葵環(huán)斑病毒屬具有更近的親緣關(guān)系，乙型香石竹斑駁病毒屬次之，丙型香石竹斑駁病毒屬則與這3個屬的親緣關(guān)系較遠，與Scheets等[8]、Pérez-Ca?amás等[39]分析結(jié)果相一致。此外，ClCMV（NC 033777）與其他天竺葵環(huán)斑病毒屬種類處于同一分支中；4種丙型香石竹斑駁病毒屬病毒中形成兩個明顯的分支，即SYMMV（NC_011643）和CPMoV（NC_003535），PSNV（NC_004995）和MNSV（JX879088等），但這兩個分支均處于一個大的分支中。本研究測定的AnFBV、CarMV、CbMV、HCRSV、MNSV和PFBV分離物均可與相應(yīng)病毒種類形成獨立分支，顯示出很近的親緣關(guān)系。測定的13個扶桑HCRSV廈門分離物也均可與已知的HCRSV分離物處于同一分支中。因此，與核苷酸序列相比，基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析更能準確反映各屬病毒的分類地位。

3 討論

3.1 簡并引物RT-PCR方法成功用于香石竹斑駁病毒屬病毒的檢測

簡并引物（RT-）PCR方法是一種根據(jù)病毒科、屬的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，可用于病毒科、屬的多目標分子檢測方法。多重（RT-）PCR方法也是一種多目標檢測方法，這兩者的主要區(qū)別是：簡并引物（RT-）PCR方法針對的目標是分類上同屬于一個科、一個屬的同類病毒，包括尚未報道的病毒種類；而多重（RT-）PCR方法針對的目標可以是分類上完全不相關(guān)的病毒（甚至是真菌、細菌），但檢測目標和數(shù)量是特定的。本研究根據(jù)基因組保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，建立的簡并引物RT-PCR方法成功用于檢測甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬不同種類的病毒，但獲得的PCR產(chǎn)物濃度有所差異。其中，CarMV的LPC68000（Agdia）分離物，由于PCR產(chǎn)物濃度低，測序并未成功。這種PCR產(chǎn)物的濃度差異是由于病毒的起始濃度差異造成的，還是因為簡并引物對不同病毒種類的擴增效率不同而引起的，這還有待于進一步的研究。此外，利用該方法成功用于檢測MNSV（07097PC，Loewe）分離物，但多次進行RT-PCR擴增MNSV的LPC12402（Agdia）分離物均未成功，這可能是因為該病葉凍干粉末的保存時間太長而引起病毒降解造成的。

3.2 與已有簡并引物RT-PCR方法的比較分析

目前，針對香石竹斑駁病毒屬及其相關(guān)病毒的簡并引物RT-PCR方法不僅已有公開的文獻報道，也有商品化的檢測引物在出售。Morozov等設(shè)計簡并引物Carmo-II/VI可以檢測同科的其他種類病毒，包括MCMV（）、CRSV、RCNMV（）和TBSV（）[29]，而本研究所設(shè)計的簡并引物Carmo-F2/R2或Carmo-F2a/R2a初步結(jié)果表明不能用于檢測MCMV、PLPV、CRSV，其檢測范圍小，但是否可以檢測同科的其他病毒還待進一步研究。根據(jù)序列比對分析結(jié)果，對出現(xiàn)錯誤的簡并引物Carmo-II/VI進行修正，包括增加部分簡并堿基，但還需要進一步的試驗驗證（表4）。楊雷亮等根據(jù)外殼蛋白基因設(shè)計一對簡并引物（CarMV-F1/F2），成功用于8種香石竹斑駁病毒屬病毒的檢測[30]，但在本研究所比對的病毒種類中，未在CP基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)合適的保守區(qū)域，這可能是隨著用于比對分析的病毒種類增加而導(dǎo)致難以在CP基因區(qū)域找到保守區(qū)域。與本研究的簡并引物相比，Agdia公司的PCR引物不僅在擴增片段大小上存在明顯差異，而且其可檢測范圍更廣[31]。但是，由于需要進口，使用該商業(yè)化的簡并引物還存在一定困難，不僅購置麻煩、到貨周期長，而且價格昂貴、使用成本高。因此，本研究建立的方法可以顯著降低甲型、乙型和丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的檢測成本。

3.3 在簡并引物5′端加入一段非互補序列可以提高RT-PCR檢測方法的靈敏度

在PCR引物的5′端加入一段非互補的富含AT的序列（AATAAATCATAA），不僅可以提高實時熒光PCR的熒光信號[40]，而且還可以提高普通PCR[41]和多重PCR的靈敏度[42-43]。在簡并引物的5′端加入該富含AT的序列，也可以提高簡并引物PCR的特異性和靈敏度[44]。本研究表明，在簡并引物的5′端加入該富含AT的序列后（Carmo-F2a/R2a），可以提高簡并引物RT-PCR的擴增效率，其靈敏度至少可以提高10倍。此外，在簡并引物的5′端分別加入一段非互補的測序引物RV-M和M13-47后，也可以提高簡并引物RT-PCR的檢測靈敏度[45]。因此，在簡并引物的5′端加入一段非互補的序列，可以提高簡并引物RT-PCR方法的靈敏度。在RT-PCR檢測中推薦使用簡并引物Carmo-F2a/R2a。

3.4 PCR產(chǎn)物測序峰圖分析

同一植物可同時受到不同種類病毒的侵染，包括同一科、屬的多種病毒。使用簡并引物RT-PCR方法也可以發(fā)現(xiàn)同一科、屬病毒的復(fù)合侵染情況，即當PCR產(chǎn)物直接測序出現(xiàn)雜峰、套峰時，預(yù)示著可能存在2種或2種以上同科、屬病毒的復(fù)合侵染。此時，通過克隆并挑取多個克隆子進行測序，則可明確是否具有多種病毒序列。本研究利用所建立的方法對扶桑樣品進行檢測，經(jīng)PCR產(chǎn)物直接測序，并未出現(xiàn)雜峰、套現(xiàn)現(xiàn)象，表明扶桑中沒有除HCRSV外的其他甲型、乙型及丙型香石竹斑駁病毒屬病毒。扶桑中是否還有其他科、屬的病毒，則需要進一步檢測確定。

3.5 RdRp基因在種類鑒定中的應(yīng)用

RdRp基因是番茄叢矮病毒科中屬、種的一個重要劃分指標?；谕暾腞dRp的系統(tǒng)發(fā)育分析是劃分屬的一個重要依據(jù)，而RdRp基因的氨基酸序列一致性則是劃分種的一個重要依據(jù)[1,8]。在甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬中劃分病毒種的標準為：聚合酶的氨基酸序列一致性小于75%；外殼蛋白的氨基酸序列一致性小于75%[8]。本研究所測定的各種病毒分離物的部分RdRp基因氨基酸序列與已知的相應(yīng)病毒序列的一致性均大于90%，遠高于種的劃分標準，證實了測定的序列為相應(yīng)病毒的序列。進一步系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與核苷酸序列相比，基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析更能真實反映出通讀病毒亞科中各屬病毒的分類地位，各屬、各種病毒均可以形成獨立分支，該結(jié)果與Scheets等[8]、Pérez-Ca?amás等[39]的分析結(jié)果相一致。因此，利用本研究建立的簡并引物RT-PCR方法，并結(jié)合序列與系統(tǒng)發(fā)育分析，可以實現(xiàn)甲型、乙型、丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的快速鑒定。

4 結(jié)論

4.1 根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，本研究所建立的RT-PCR檢測方法可以用于甲型、乙型和丙型香石竹斑駁病毒屬病毒的廣譜檢測，結(jié)合序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，可以實現(xiàn)病毒種類的快速鑒定。

4.2 在簡并引物中加入一段非互補的富含AT序列（AATAAATCATAA）可以提高簡并引物RT-PCR檢測靈敏度。

4.3 利用本研究所建立的方法對扶桑樣品進行檢測，初步表明木槿褪綠環(huán)斑病毒（HCRSV）在廈門地區(qū)的扶桑上普遍發(fā)生。

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Development of a degenerate primer RT-PCR assay for detection of

LIAO FuRong1, CHEN HongYun1, SHEN JianGuo2, FANG ZhiPeng1, HUANG PengYing1, CHEN Qing1, LIN LingLing1, HONG Jun1

1Xiamen Customs Technology Center, Xiamen 361026, Fujian;2Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 350001

【Objective】The objective of this study is to establish a rapid, sensitive, and broad-spectrum screening method for simultaneous detection and identification of the genera,, andusing degenerate primer RT-PCR combined with sequence analysis.【Method】Multiplexed analysis of genome sequences was aligned tosearch for suitable conserved regions for the design of the degenerate primers. One pair of degenerate primer Carmo-F2/Carmo-R2 was designed based on the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene sequences, and another pair primer Carmo-F2a/Carmo-R2a was formed by adding the non-complementary AT-rich sequences (AATAAATCATAA) to the 5′ end of the degenerate primers. The broad-spectrum, specificity, and sensitivity of RT-PCR method were analyzed. The sequencing, BLASTn analysis and phylogenetic analysis of PCR products were performed. The method was used to screen and detect viruses on Chinese hibiscus () samples from Xiamen, China.【Result】Degenerate primers Carmo-F2/Carmo-R2 and Carmo-F2a/Carmo-R2a were used to amplify partial RdRp gene of the members of genera,, andby RT-PCR. The fragment of approximately 500 and 550 bp was amplified, respectively. The developed RT-PCR assay was successfully used to detect angelonia flower break virus (AnFBV;), calibrachoa mottle virus (CbMV;), carnation mottle virus (CarMV;), and pelargonium flower break virus (PFBV;), hibiscus chlorotic ringspot virus (HCRSV;), melon necrotic spot virus (MNSV;). The specificity test showed that no specific band could be obtained from maize chlorotic mottle virus (MCMV;), pelargonium line pattern virus (PLPV;), carnation ringspot virus (CRSV;), and healthy plants which including watermelon, melon, pumpkin, soybean, and pea. The sensitivity results showed that the primers Carmo-F2/Carmo-R2 could be detected up to 10-2dilution and the primers Carmo-F2a/Carmo-R2a could be detected up to 10-3dilution, which indicated that the non-complementary AT-rich sequences added at the 5′ end of the degenerate primers could increase the sensitivity of degenerate primer RT-PCR. BLAST analysis showed that the sequences determined had the highest sequence consistency with the corresponding virus species. Phylogenetic analysis based on partial amino acid sequences of the RdRp gene showed that it is consistent with the current classification of the subfamily, and the viruses could be identified at the species level. HCRSV was detected in all 13samples with suspected virus symptoms.【Conclusion】The RT-PCR method based on the degenerate primers Carmo-F2/Carmo-R2 and Carmo-F2a/Carmo-R2a can be used for the screening and detection of viruses of the genera,, and, and can be used for rapid identification of virus species in combination with sequence analysis and phylogenetic analysis, and may be used to discover the new virus.plants were infested with HCRSV in Xiamen, China.

;;; degenerate primer; RT-PCR;; hibiscus chlorotic ringspot virus (HCRSV)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.005

2023-03-30；

2023-04-18

福建省農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性（重點）項目（2019N0029）、廈門海關(guān)科研項目（2020XK03）

廖富榮（通信作者），Tel：0592-6806943；E-mail：lfr005@163.com

（責任編輯 岳梅）