疊鞘石斛組織培養(yǎng)及植株再生體系優(yōu)化

張玨 鄔江 趙心怡 劉帆

文章編號：1004－5422（2023）02－0139－07

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.005

收稿日期：2022-10-24

基金項目：四川中醫(yī)藥文化協(xié)同發(fā)展研究中心項目（2021XT42）

作者簡介：張玨（1976—），女，博士，講師，從事藥用植物資源利用與開發(fā)研究.E-mail：8926596@qq.com

通信作者：劉帆（1967—），男，碩士，副教授，從事藥用植物種苗繁育研究.E-mail：541169023@qq.com

摘要：以疊鞘石斛成熟種子為材料，使用IBA、6-BA和NAA共3種生長調(diào)節(jié)劑與香蕉泥和椰子汁有機物等組合，采用3因素3水平正交設(shè)計及單因素設(shè)計進行組織培養(yǎng)研究.結(jié)果顯示，最佳疊鞘石斛原球莖培養(yǎng)基為MS+50 g/L椰子汁+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，40 d增殖系數(shù)為6.75，分化率為84.38%；最佳疊鞘石斛壯苗生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂.通過該技術(shù)，可以在較短時間獲得大批量優(yōu)質(zhì)疊鞘石斛種苗，為大規(guī)模疊鞘石斛藥材生產(chǎn)提供基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：疊鞘石斛；生長調(diào)節(jié)劑；組織培養(yǎng)；形態(tài)指標；植物再生；煉苗

中圖分類號：S567.239

文獻標志碼：A

0引言

疊鞘石斛（又稱迭鞘石斛）為蘭科石斛屬多年生草本植物，以莖入藥，收載于《四川省中藥材標準》中.其味甘、微寒，具有益胃生津，滋陰清熱等功效［1］.疊鞘石斛在生產(chǎn)過程中，以無性繁殖為主，主要采用分株繁殖方式［2］，該方法費時費力，且環(huán)境適應(yīng)性較差，不適合為大規(guī)模生產(chǎn)提供種苗.

目前對疊鞘石斛組織培養(yǎng)研究較少，已有研究表明，一定濃度的香蕉泥和椰子汁有利于石斛屬植物原球莖增殖［3-5］.6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）是一種具有多種生物功能的植物生長調(diào)節(jié)劑，除了能促進細胞分裂，也可以促進種子發(fā)芽，抑制或促進根的生長；3-吲哚丁酸鉀（IBA）促進生根作用較強，但產(chǎn)生的不定根細而長；萘乙酸（NAA）促進根生長和芽的分化作用較強.當適宜濃度的6-BA與適宜濃度的NAA與IBA混合使用，既有利于原球莖的增殖分化，又可以提前生根發(fā)芽，明顯促進根系生長［6-9］. 因此本研究采用植物組織快速培養(yǎng)方法，通過對培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的配比與有機添加物的濃度等進行篩選，探究疊鞘石斛組培苗的最佳增殖有機物濃度與增殖培養(yǎng)條件，建立疊鞘石斛快速繁殖體系.

1材料與方法

1.1材料

疊鞘石斛成熟種子，由四川省雅安市石棉縣豐樂鄉(xiāng)種植基地提供，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)田孟良教授鑒定為疊鞘石斛種子.

1.2方法

1.2.1原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

以成熟未開裂、外表有黃褐色斑點的疊鞘石斛蒴果為外植體，對蒴果進行滅菌處理后，吸干外表水分，將其切開，抖動果莢將種子均勻撒播于MS空白培養(yǎng)基中.培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，光照時數(shù)為12 h/d，光照強度為35～40 μmol/m2·s.

1.2.2原球莖增殖培養(yǎng)

以疊鞘石斛種子萌發(fā)出的原球莖為試驗材料，以市售新鮮成熟香蕉與椰子作為天然有機物附加物，香蕉切塊、搗碎，椰子取其汁液.采用單因素設(shè)計，并設(shè)置各有機物濃度梯度，見表1.將有機物分別添加到MS空白培養(yǎng)基.選出大小基本一致的原球莖，每瓶接種2叢（每4個原球莖為1叢），每處理接種10瓶，3次重復(fù).培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，暗培養(yǎng)7 d后，再轉(zhuǎn)入光照恒溫室培養(yǎng)，光照時數(shù)為12 h/d，光照強度為35～40 μmol/m2·s.每3 d觀察1次并記錄數(shù)據(jù)，40 d后統(tǒng)計結(jié)果.

1.2.3壯苗生根培養(yǎng)

以不定芽生長高度約2.5 cm，長勢基本一致的疊鞘石斛組培苗為試驗材料，采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，設(shè)置生長調(diào)節(jié)劑濃度配比，共9個處理組，見表2.將生長調(diào)節(jié)劑分別添加到培養(yǎng)基（1/2 MS），每瓶接種2株，每個處理15瓶，3次重復(fù).采用光照恒溫培養(yǎng)，溫度（23±2）℃，光照時數(shù)為12 h/d，光照強度為35～40 μmol/m2·s，每3 d觀察1次.

1.2.4煉苗移栽

當約80%的苗生長高度達到約4 cm，根長約3 cm時，開蓋后于溫室煉苗，煉苗3 d后將苗取出，用清水洗去根部培養(yǎng)基后移栽至由紅砂石∶松樹皮∶苔蘚比例為2∶1∶1的基質(zhì)中，每個處理移栽10株苗，3次重復(fù).溫度保持在（23±2）℃，每隔3 d澆水并記錄組培苗生長情況，30 d后統(tǒng)計存活率.

2結(jié)果與分析

2.1種子萌發(fā)

疊鞘石斛種子在40 d內(nèi)隨時間的增長萌發(fā)率逐漸提高，由黃色粉狀種子發(fā)育成黃綠色原球莖，直徑1.0 mm左右，形如芝麻粒，部分直徑2.5 mm左右，如綠豆大小，結(jié)果見表3和圖1，

2.2原球莖增殖

由疊鞘石斛原球莖增殖試驗結(jié)果可知，100 g/L椰子汁的增殖效果最佳，40 d原球莖增殖系數(shù)為8.25；其次是50 g/L椰子汁，增殖系數(shù)為6.75；空白培養(yǎng)基增殖效果最差，增殖系數(shù)為3.25.隨有機物濃度的增加，原球莖的增殖系數(shù)也隨之提高，40 d原球莖增殖效果均優(yōu)于空白培養(yǎng)基，且色澤淺綠、生長致密、健壯.結(jié)果見表4和圖2.

2.3原球莖分化

由疊鞘石斛原球莖分化試驗可知，50 g/L椰子汁分化效果最佳，40 d原球莖分化率為84.38%；空白培養(yǎng)基分化率最低，為67.65%.添加了香蕉泥或椰子汁的培養(yǎng)基，分化苗顏色淺綠，分化程度均高于空白培養(yǎng)基.添加香蕉泥（50 g/L）的培養(yǎng)基，分化苗雖高但較細長，且有少數(shù)畸形；而添加椰子汁的培養(yǎng)基，分化苗整齊且粗壯.結(jié)果見表5和圖3.

2.4生長調(diào)節(jié)劑對生長的顯著性差異

由生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛生長影響試驗可知，IBA對疊鞘石斛的主根長度、側(cè)根數(shù)目、株高與莖粗均有極顯著性影響（P<0.01）；6-BA對疊鞘石斛的莖粗有極顯著性影響（P<0.01）；NAA對疊鞘石斛的主根長度、側(cè)根數(shù)目與株高有極顯著性影響（P<0.01）.3種生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛的葉片數(shù)均無顯著性影響（P>0.05），結(jié)果見表6.

2.4.1IBA對壯苗生根的影響

IBA對疊鞘石斛壯苗生根的影響結(jié)果見表7.在主根長度方面，最佳濃度為0.5 mg/L，且與0.1 mg/L及1.0 mg/L相比，均出現(xiàn)顯著（P＜0.05）提高作用；同理，在側(cè)根數(shù)目方面，最佳濃度為1.0 mg/L；在株高方面，最佳濃度為0.1 mg/L；在莖粗方面，最佳濃度為0.5 mg/L.

2.4.26-BA對壯苗生根的影響

6-BA對疊鞘石斛壯苗生根的影響結(jié)果見表8.

2.4.3NAA對壯苗生根的影響

NAA對疊鞘石斛壯苗生根的影響結(jié)果見表9.在主根長度方面，最佳濃度為0.1 mg/L，與其他組相比，均出現(xiàn)顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）提高作用；在側(cè)根數(shù)目方面，最佳濃度為0.5 mg/L；在株高方面，最佳濃度為0.1 mg/L，與0.5 mg/L及1.0 mg/L相比，均出現(xiàn)顯著（P<0.05）提高作用；在莖粗方面，最佳濃度為0.5 mg/L，但與0.1 mg/L及1.0 mg/L相比，差異均不顯著（P>0.05）.

2.5壯苗生根與煉苗移栽

單一生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛壯苗生根培養(yǎng)無影響則Kx（Kx代表對應(yīng)水平生長調(diào)節(jié)劑的試驗指標和，kx代表Kx的平均值，x=1、2和3）相等，Kx不相等則有影響，且Kx越大，影響越大.根據(jù)極差R的大小，可以判斷各生長調(diào)節(jié)劑對試驗指標的影響主次.實驗結(jié)果詳見表10.

從主根長度單方面分析，IBA的K2、6-BA和NAA的K1最大，說明促進主根生長的最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其中IBA的極差最大，NAA次之，6-BA最小，故各生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛組培苗主根長度的影響主次順序為IBA＞NAA＞6-BA；從側(cè)根數(shù)目單方面分析，IBA的極差最大，NAA次之，6-BA最小，故各生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛組培苗側(cè)根數(shù)目的影響主次順序為IBA＞NAA＞6-BA；從株高單方面分析，各生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛組培苗株高的影響主次順序為IBA＞NAA＞6-BA；從莖粗單方面分析，各生長調(diào)節(jié)劑對疊鞘石斛組培苗莖粗的影響主次順序為IBA＞6-BA＞NAA.組培苗與移栽苗如圖4和圖5所示.

3.1MS培養(yǎng)基對種子萌發(fā)影響

MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最為廣泛的一種培養(yǎng)基，大多數(shù)蘭科植物均可在MS培養(yǎng)基中萌發(fā).鄭志仁等［10］發(fā)現(xiàn)，野生鐵皮石斛在多種培養(yǎng)基中1個月的萌發(fā)率，以MS培養(yǎng)基萌發(fā)率最高，高達87%；方香香等［11］發(fā)現(xiàn)，霍山石斛在MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率可達85.46%.在疊鞘石斛種子萌發(fā)階段采用MS培養(yǎng)基，不添加生長調(diào)節(jié)劑就能萌發(fā)出原球莖，且40 d萌發(fā)率＞90%，證明了疊鞘石斛種子萌發(fā)可以不需要外源生長調(diào)節(jié)劑.

3.2有機物對原球莖增殖分化的影響

植物組織培養(yǎng)中不同種類與不同濃度有機物對石斛屬植物誘導(dǎo)生根發(fā)芽都有顯著影響.研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的香蕉泥和椰子汁有利于石斛屬植物原球莖增殖［3-5］，香蕉泥與椰子汁等有機物能夠?qū)κ吭鲋澈驮蚯o的形成有明顯的促進作用［6］，本研究結(jié)果與之相符.添加香蕉泥和椰汁的組培苗生長得更好，移栽成活率高，可能是其不僅含有較多的碳水化合物，還含有多種氨基酸、鉀和鈣等營養(yǎng)元素，可以顯著促進細胞的增殖［8］.本研究結(jié)果顯示，疊鞘石斛原球莖的增殖效果最佳有機物濃度為100 g/L椰子汁；原球莖的分化以濃度為100 g/L香蕉泥與50 g/L椰子汁最佳.

3.3生長調(diào)節(jié)劑對壯苗生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物生長發(fā)育具有兩面性，既有促進萌發(fā)、生根、生長、成熟和增加產(chǎn)量等作用，也能抑制器官發(fā)育和生長.6-BA、IBA和NAA是植物組織培養(yǎng)中常用的生長調(diào)節(jié)劑.本研究表明，適量的IBA、6-BA和NAA對疊鞘石斛壯苗生根都有一定促進作用，與黃勇等［12］研究生長調(diào)節(jié)劑對鐵皮石斛壯苗生根的影響，以及陳春［13］研究獨角石斛快繁的結(jié)果相對一致.

3.4煉苗移栽與工廠化生產(chǎn)

本研究采用由紅砂石、松樹皮與苔蘚配比為2∶1∶1的基質(zhì)，成本低廉且組培苗存活率高達99%.此外，疊鞘石斛及其他石斛屬植物一般2年成苗，3年才可長出新芽.仇碩等［14］發(fā)現(xiàn)，報春石斛從種子萌發(fā)到移栽成苗的快繁培養(yǎng)需240 d左右.本研究從疊鞘石斛種子萌發(fā)到移栽成苗，共計170 d.縮短了疊鞘石斛成苗時間且成活率高，同時能保證優(yōu)質(zhì)種苗穩(wěn)定生產(chǎn).

4結(jié)論

疊鞘石斛組培苗根部最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA;疊鞘石斛組培苗株高最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA;疊鞘石斛組培苗莖粗最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA.最佳疊鞘石斛壯苗生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂.疊鞘石斛組培苗移栽馴化采用由紅砂石、松樹皮與苔蘚配比為2∶1∶1的基質(zhì)，不同生長調(diào)節(jié)劑配比培養(yǎng)的組培苗移栽后均長勢健壯，30 d后總成活率為99%.快繁培養(yǎng)操作較為簡便，成本較為低廉，適合疊鞘石斛優(yōu)質(zhì)株系的挑選及工廠化生產(chǎn).

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［14］仇碩，趙健，趙志國，等.報春石斛組培快繁技術(shù)體系的建立［J］.北方園藝，2019，43（3）：78-83.（責任編輯：伍利華）

On Optimization of Tissue Culture and Plant Regeneration System of Dendrobium Aurantiacum Rchb.f.var.Denneanum（kerr） Z.H.Tsi

ZHANG Jue1，WU Jiang2，ZHAO Xinyi3，LIU Fan3

（1.School of Pharmacy，Chengdu University，Chengdu 610106，China;

2.The Affiliated Primary School of Chengdu University of Technology，Chengdu 610051，China;

3.College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

Abstract：

Mature seeds of Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum （kerr） Z.H.Tsi were used as experimental materials，IBA，6-BA，NAA，mashed banana，and coconut juice were added in and three factors and three levels orthogonal design and single factor design were adopted.The study showed that the best corm culture medium was MS+50 g/L coconut juice+30 g/L sucrose + 6 g/L agar，the proliferation coefficient was 6.75 and the differentiation efficiency was 84.38% at 40 days.The best culture medium for strong seedling and rooting was 1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose + 6 g/L agar.It can be concluded that this tissue culture system can provide Dendrobium aurantiacum seedlings rapidly and also provide basis for the generous producation of this medicinal plants.

Key words：

Dendrobium aurantiacum Rchb.f.var.denneanum （kerr） Z.H.Tsi;growth regulator;tissue culture;shape indicators;plant regeneration;acclimatization