天然純鮮粉葛飲料通過TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制小鼠酒精性肝損傷研究

謝雪勤　李志杰　吳靜宜　鄧欣　洪玉冰　車彥云　趙毅

【摘要】目的：探討超高溫瞬時滅菌全新工藝制備的無化學添加劑的天然純鮮粉葛飲料對酒精性肝損傷小鼠的保護作用以及對TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響。方法：采用高效液相色譜法對鮮粉葛飲料中異黃酮成分進行含量測定。采取 43% 酒精灌胃的方法建立小鼠酒精性肝損傷模型。檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）及炎癥因子水平；蘇木素-伊紅（HE）染色分析各組肝臟病理形態(tài)變化；免疫組化檢測肝組織 Toll 樣受體 4 （TLR4）、髓樣分化分子88（MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB p65）的表達。結(jié)果：天然純鮮粉葛飲料中檢測到 6種異黃酮成分，其中葛根素含量最高，達到 622.6 μg/mL。天然純鮮粉葛飲料預處理能降低小鼠體內(nèi)兩種血清轉(zhuǎn)氨酶含量水平（P<0.01）；飲料高劑量組能降低血清中 TG、TC、LDL、白細胞介素-6 （IL-6）、白細胞介素-1β （IL-1β）和腫瘤壞死因子-α （TNF-α）含量水平（P<0.001），提高HDL含量水平 （P<0.05）。病理切片結(jié)果顯示天然純鮮粉葛飲料能有效改善小鼠肝組織出現(xiàn)的脂肪空泡，胞質(zhì)疏松，細胞核排列不規(guī)則等情況，并抑制小鼠肝組織中 TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達（P<0.01，P<0.001）。結(jié)論：無化學添加劑的天然純鮮粉葛飲料可減少小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積和降低炎癥因子水平，對酒精性肝病具有一定的預防保護作用，其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】天然純鮮粉葛飲料；無化學添加劑；酒精性肝損傷；肝保護；炎癥反應

【中圖分類號】R932【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）12-0012-08

Study on Natural Pure Fresh Pueraria Beverage Inhibited Alcoholic Liver Injury

Via TLR4/MyD88/NF-κB Pathway in MiceXIE Xueqin LI Zhijie WUJingyi DENG Xin HONG Yubing CHE Yanyun ZHAO Yi

1.College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Engineering research center for homology of medicine and food beverage of Yunnan Province， Kunming 650500， ChinaAbstract：Objective To investigate the protective effects of natural pure fresh pueraria beverage without chemical additives prepared by the brand new process of ultra-high temperature instantaneous sterilization on mice with alcoholic liver injury and its effects on TLR4/MyD88/NF-κB pathway.Methods The content of isoflavones in natural pure fresh pueraria beverage was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. A mice model of alcoholic liver injury was established by intragastric gavage with 43% alcohol. The levels of aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low-density lipoprotein （LDL）， high-density lipoprotein （HDL）， and inflammatory factors in serum were determined. And the pathological changes of the liver of each group were observed by （hematoxylin-eosin， HE） staining. In addition， the expression of Toll like receptors 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88） and nuclear factor kappa-B p65 （NF-κB p65） in the liver were measured by immunohistochemical staining.Results Six isoflavones were detected in natural fresh Pueraria beverage， and the content of puerarin was the highest， reaching 622.6 μg/mL. The experiments showed that the levels of AST and ALT in mice were reduced by the pretreatments with natural pure freshpueraria beverage （P<0.01）. The serum TG， TC， LDL， the interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1beta （IL-1β） and tumor necrosis factor-alpha （TNF-α）levels were reduced in the beverage high-dose group （P<0.001）， while the content of HDL was increased （P<0.05）.Pathological sections showed that the fatty vacuoles， loose cytoplasm and irregular arrangement of nuclei in the liver tissue of mice were improved effectively， while the expressions of TLR4， MyD88 and NF-κB p65 proteins in those of mice were inhibited with natural pure fresh pueraria beverage （P<0.01， P<0.001）.Conclusion These results suggested that natural pure fresh pueraria beverage without chemical additives could reduce the fatty deposition and levels of inflammatory factors in the liver of mice， thus had a certain preventive and protective effect on alcoholic liver injury. Its mechanism may be related with inhibition of the activation of TLR4/MyD88/NF-κB pathway.

Keywords：Natural PureFresh Pueraria Beverage;No Chemical Additives; Alcoholic Liver Injury; Liver Protection; Inflammation

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是一種慢性肝病，早期可從酒精性脂肪肝發(fā)展為酒精性脂肪肝炎（alcoholic steatohepatitis，ASH），慢性的ASH 可導致肝纖維化，最后演變?yōu)楦斡不踔粮渭毎?-2］。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，亞洲ALD總患病率為4.81%，且患病率還在逐年增加［3］。ALD 的病因復雜，包括酒精及其代謝物對肝細胞的損傷、炎癥因子、膽汁淤積、Kupffer 細胞和中性粒細胞的募集和激活等［4］。藥理研究［5-7］表明，急性和慢性酒精肝損傷會通過TLR4激活 NF-κB通路產(chǎn)生各種促炎因子，同時，長期飲酒會使腸道菌群失調(diào)和腸道毒素積聚，進而增加腸道通透性，導致肝臟和其他器官發(fā)生炎性病變。此外，研究［8］發(fā)現(xiàn)酒精會影響肝細胞中的缺氧誘導因子1和脂肪酸代謝調(diào)節(jié)等轉(zhuǎn)錄因子水平，導致脂肪性病變。早期臨床上的治療手段主要包括預防、戒酒、補充營養(yǎng)、化學藥物和肝移植等，但存在療效一般、肝毒性和存活率低等缺陷［9-10］。藥理研究表明具有抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)脂肪代謝藥理活性的中草藥及其提取物，可用于治療酒精性肝?。?1-15］。

粉葛是豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth. 的干燥根，具有生津止渴，解酒毒，解肌退熱等功效?！肚Ы鸱健酚涊d，將鮮葛搗爛，榨汁，飲之，可治“酒醉不醒”?，F(xiàn)代研究［16-19］表明，葛根中具有異黃酮類、萜類、甾體類等多種活性成分。藥理研究［20-22］發(fā)現(xiàn)，葛根提取物具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等藥理活性，可治療酒精引起的肝臟損傷。葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷元、大豆苷等異黃酮成分肝保護作用的主要活性成分。臨床研究［23］表明，葛根提取物有助于降低人對酒精飲用的需求，延長飲酒的時間間隔，有助于飲酒者降低對酒精的依賴。

目前市場上粉葛飲料開發(fā)主要集中于酶解或發(fā)酵型復配飲料，掩蓋了粉葛的天然風味，且多添加化學食品添加劑，長期飲用存在安全隱患。因此，云南省藥食同源飲品工程研究中心結(jié)合粉葛藥食兩用的特征，融合超高溫瞬時滅菌等現(xiàn)代高新技術(shù)，研發(fā)了一款口感天然清香、無添加、質(zhì)量穩(wěn)定、易于攜帶與儲存的天然純鮮粉葛飲料，市場應用前景廣闊。采用小鼠體內(nèi)酒精肝損傷模型，初步探討其對酒精誘導小鼠肝損傷的保護作用以及與TLR4/MyD88/NF-κB 通路的關(guān)聯(lián)性，為天然純鮮粉葛飲料在保護肝損傷方面的應用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料與試劑無添加天然純鮮粉葛飲料主要由超純水、鮮粉葛組成（粉葛：購自德陽遠知藥材經(jīng)營部，由云南中醫(yī)藥大學中藥學院趙毅正高級工程師鑒定為豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth. 的根，標本現(xiàn)存于云南省藥食同源飲品工程研究中心）。

葛根素（Puerarin）、3′-甲氧基葛根素（3′-MethoxyPuerarin）、葛根素芹菜糖苷（Puerarin apioside）、大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein），均購于德斯特生物技術(shù)有限公司（純度≥98.0%）；水飛薊賓（天士力制藥集團股份有限公司）； 43°紅星藍瓶二鍋頭（成都金龍酒廠）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT，批號：20220901）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST，批號：20220831）、總膽固醇（total cholesterol，TC，批號：20220112）、甘油三酯（triglyceride，TG，批號：202201012）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL，批號：20220111）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL，批號：20220112）試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6，批號：A20620845）、白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β，批號：A201BH20445）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α，批號：A28220747）酶聯(lián)免疫試劑盒均為聯(lián)科生物產(chǎn)品；蘇木素-伊紅染色試劑盒（hematoxylin-eosin，HE，批號：C0105S，碧云天生物技術(shù)公司）；冰乙酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；水（超純水，云南省藥食同源飲品工程研究中心）；甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich）。

1.2儀器與設(shè)備BP-PB02S 破壁料理機（廣州藍寶智能科技有限公司）；MLS-3751L-PC高壓滅菌機（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；FT74XTS-A 超高溫瞬時滅菌機（英國 Armfield 公司）；DL6M 大容量冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；SHIMADZU LC-2030 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AR224CN型分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；22331Hamburg5452型高速冷凍離心機（德國 Eppendorf AG 公司）；VE-10LH-A超純水機（深圳市洪森環(huán)?？萍加邢薰荆籗PARK 10M 多功能酶標儀（瑞士 Tecan 公司）；BCD-610W冰箱（西門子股份公司）；Teksqray SQS-1000 玻片掃描影像系統(tǒng)（深圳市生強科技有限公司）；CUT5062 石蠟切片機［萊比信（北京）儀器有限公司］。

1.3實驗動物健康雄性 KM 小鼠（SPF級，18～20g），由昆明醫(yī)科大學提供，合格證號：SCXK（滇）K2020-0004；動物由云南中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會批準于動物實驗中心飼養(yǎng)（批準審批號：R-06202009，許可證號：SYXK（滇）K2022-0004）；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 21～25 ℃，相對濕度為45%～55%，自由飲水和攝食。

1.4實驗方法

1.4.1天然純鮮粉葛飲料的制備首先挑選新鮮粉葛清洗、切小塊，用破壁料理機粉碎制漿，過藥典 9 號篩，濾液連續(xù)離心，兩次離心后取上清液進行高壓均質(zhì)，再將均質(zhì)后的粉葛飲料進行超高溫瞬時滅菌與無菌灌裝，整個過程中不使用任何防腐劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等化學添加劑，最后制得澄清透明并具有粉葛清香味的天然純鮮粉葛飲料。天然純鮮粉葛飲料成人推薦攝入量為 300 mL/60 kg（受試物為 10 倍濃縮液）。

1.4.2高效液相色譜條件利用 C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm），流動相：0.2% 冰乙酸水（A）-甲醇（B）；洗脫梯度：0～10 min，20% B→23% B；10～30 min，23% B→35% B；30～55 min，35% B→70% B；55～65 min，70% B→20% B，檢測波長 250 nm，流速 1.0 mL/min，進樣量：10 μL；柱溫 30 ℃。

1.4.3動物分組和給藥60只小鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后隨機分成 5 組（n=12）：正常組、模型組、水飛薊賓陽性藥組（100 mg/kg）、天然純鮮粉葛飲料低劑量組（4.0 mL/kg），天然純鮮粉葛飲料高劑量組（8.0 mL/kg），正常組和模型組分別給予 0.02 mL/g 體積的蒸餾水，給藥組連續(xù)按劑量給藥 20 d （均灌胃給藥），灌胃 1 h 后，除正常組給予同等體積蒸餾水外，其余組均灌胃紅星藍瓶二鍋頭（43%）（10 mL/kg）。20 d 后進行眼球取血，經(jīng)低溫離心得到血清；將小鼠脫頸處死，立即取出肝組織，將各肝臟用4%多聚甲醛溶液進行固定，用于后續(xù)實驗。

1.4.4小鼠血清生化指標的測定取各組小鼠血清，根據(jù)試劑盒說明書，對血脂水平TG、TC、HDL、LDL四個指標、AST和 ALT 兩個指標以及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平進行檢測。

1.4.5組織病理學檢查取肝左葉最大面，用 4% 多聚甲醛溶液固定后脫水，石蠟包埋制成 5 μm 切片。分別用 HE 染色后在顯微鏡下觀察，以及進行免疫組化染色觀察，免疫組化圖片采用 ImageJ 軟件進行平均光密度（IOD/Area）分析。

1.4.6統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)結(jié)果均用（x±s）表示，采用 IBM SPSS Statistics 26. 0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理后采用 GraphPad Prism 9.3.1 軟件作圖，采用單因素方差分析（ANOVA）與 LSD 檢驗比較評估兩組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果與分析

2.1鮮粉葛及其飲料中化學成分分析采用高效液相色譜法，在無添加天然純鮮粉葛飲料中檢測到葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元 6 種成分，其中各成分含量分別為622.6 μg/mL、8.3 μg/mL、63.4 μg/mL、56.6 μg/mL、7.0 μg/mL、4.4 μg/mL，跟原料相比該飲料中葛根素保留率達到75.4%，有效保留了其中有效成分。上述成分可以作為指標性成分用于無添加天然純鮮粉葛飲料的質(zhì)量控制（如圖1所示）。

2.2天然純鮮粉葛飲料對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、TG、TC、HDL 和LDL 的影響轉(zhuǎn)氨酶是臨床上肝功檢查的指標，當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，會引起在血清中 AST、ALT 轉(zhuǎn)氨酶濃度偏高，且 AST 水平高于 ALT 的水平［24］。此外，實驗對 TG、TC、HDL、LDL 水平進行了檢測，此四項是反映肝臟脂肪代謝障礙的敏感指標［25］。當 TG 水平上升時，血清中 LDL 增多；當血清中 TC 水平上升時，HDL 對 TC 轉(zhuǎn)運作用增強，使循環(huán)血中 HDL 含量降低［26］。檢測結(jié)果表示，與正常組相比，43% 酒精灌胃，導致小鼠血清中 ALT、AST 水平升高（P<0.01，P<0.001），分別達到 15.25 U/L、32.08 U/L；而無添加天然純鮮粉葛飲料和水飛薊賓預給藥可降低 ALT、AST 水平，天然純鮮粉葛飲料高劑量組中 ALT、AST 下降較為顯著（P<0.01，P<0.001），降低到10.33、25.88 U/L，與水飛薊賓陽性藥組效果較為接近（如圖 2所示）。

另外，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組 TG、TC、LDL 的水平均有顯著上升（P<0.001），HDL 的含量明顯下降（P<0.05）。表明天然純鮮粉葛飲料對降低血清 TG、TC、LDL 的含量有一定作用，其中天然純鮮粉葛飲料高劑量組抑制率可達到 42.0%、42.69%、64.07%，均具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001），且該組小鼠血清中 HDL 含量也呈上升趨勢（P<0.05）。實驗結(jié)果表明天然純鮮粉葛飲料能改善酒精誘導的小鼠肝組織損傷（表 1）。注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

2.3天然純鮮粉葛飲料對小鼠 IL-6、IL-1β和 TNF-α的影響由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量均明顯上升，且差異均存在統(tǒng)計學意義（P<0.001）；與模型組相比，鮮粉葛飲料組與水飛薊賓陽性藥組血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量均顯著下降（P<0.01，P<0.001）；表明鮮粉葛飲料可通過抑制IL-6、IL-1β和 TNF-α炎癥因子的釋放而減輕炎癥反應。

2.4天然純鮮粉葛飲料對小鼠肝組織病理學變化的影響通過對各組肝臟 HE 染色切片觀察，發(fā)現(xiàn)正常組中組織細胞核排列規(guī)則整齊，形態(tài)正常，染色均勻；模型組肝細胞損傷明顯，可見脂肪空泡，胞質(zhì)疏松，細胞核排列不規(guī)則且少量有死亡現(xiàn)象；與模型組比較，天然純鮮粉葛飲料低、高劑量組小鼠肝組織損傷情況均有較明顯的改善（如圖4所示）。HE染色結(jié)果表明天然純鮮粉葛飲料對酒精誘導的小鼠肝組織病理學變化有良好的治療效果。

2.5天然純鮮粉葛飲料對小鼠肝組織 TLR4、MyD88、NF-κB p65 的免疫組化分析通過對肝臟免疫組化染色切片觀察，發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88與 NF-κB p65 在模型組高表達，在正常組、天然純鮮粉葛飲料低、高劑量組低表達或不表達。通過 ImageJ 軟件進行平均光密度分析發(fā)現(xiàn)，在天然純鮮粉葛飲料干預后，天然純鮮粉葛飲料低、高劑量均可使小鼠肝組織 TLR4 的表達降低13.19%、18.17%（低劑量組：P<0.001，高劑量組：P<0.001），使小鼠肝組織 MyD88 的表達降低10.83%、11.64%（低劑量組：P<0.01，高劑量組：P<0.01），使小鼠肝組織 NF-κB p65 的表達降低23.06%、26.74%（低劑量組：P<0.01，高劑量組：P<0.001）（如圖5～8所示）。

3結(jié)論與討論

中醫(yī)認為酒有毒，飲酒過量會使酒毒濕熱內(nèi)蘊，肝脾損傷［27］。現(xiàn)代研究［28-30］發(fā)現(xiàn)，酒精主要依靠肝臟進行代謝，長期大量飲酒會加重肝臟的負擔，造成肝損傷。同時，大量飲酒會刺激體內(nèi)內(nèi)毒素的產(chǎn)生，激活肝臟巨噬細胞，引起 TLR4 的高表達。TLR4 激活后，通過 MyD88 介導信號轉(zhuǎn)導，然后激活 NF-κB，啟動 TLR4/NF-κB 信號通路，促進炎癥因子 TNF-a、IL-1β、IL-6 的釋放，引發(fā)炎癥反應，調(diào)節(jié)免疫細胞和炎癥細胞，參與免疫細胞的增殖、分化和凋亡，從而加重肝損傷。

古代醫(yī)學對酒精性肝病的早期研究，是在唐代的《藥性論》，書中明確指出葛根能“開胃下食，解酒毒”?，F(xiàn)代藥理研究［31］發(fā)現(xiàn)，葛根異黃酮具有抗炎活性，可降低 TNF-a、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的釋放；其中，葛根素具有一定的抑制 NF-κB p65活化的作用［16］；另外，葛根素、大豆苷元還能有效減少酒精的攝入［32］。本研究采用新鮮粉葛作為原料制得無添加天然純鮮粉葛飲料，初步探究了該飲料對酒精誘導小鼠肝損傷的保護作用。

研究結(jié)果表明，無添加天然純鮮粉葛飲料能夠抑制小鼠體內(nèi)血清中炎癥因子水平的升高，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的紊亂，并能改善肝臟組織損傷情況。進一步采用免疫組化進行機制研究，發(fā)現(xiàn)無添加天然純鮮粉葛飲料可通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 通路的激活，下調(diào) TLR4、MyD88 和 NF-κB 蛋白的表達，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用，從而減輕小鼠酒精性肝損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元 6 種異黃酮成分在天然純鮮粉葛飲料中保留率較高，推測是其發(fā)揮了保肝作用。本研究為開發(fā)天然的無添加鮮粉葛護肝飲料提供基礎(chǔ)理論指導，為粉葛資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。參考文獻

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