蒙藥藍盆花抑制肝星狀細胞增殖的作用及機制初探

顏羽昕, 高曉陽, 張春艷, 金 蓉, 袁宏偉, 馬月宏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 呼和浩特 010000

肝纖維化是慢性肝損傷進展至肝硬化的必經(jīng)階段,主要表現(xiàn)為細胞外基質(extracellular matrixc, ECM)合成和降解失調,內(nèi)皮間隙的ECM從正常的低密度基底膜樣基質向含有纖維形成膠原的間質型基質轉變,使ECM異常沉積,膠原成分大量增加,最終影響肝臟正常的功能[1-2]。其中,肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[3],HSC向成肌纖維細胞過渡的過程中,會受到肝細胞及其他細胞的相互影響,并參與傷口愈合反應范圍內(nèi)的細胞通路激活的調節(jié),其激活后產(chǎn)生大量ECM,這是導致肝纖維化形成的主要原因[4]。在激活狀態(tài)下,HSC失去儲備維生素A脂滴的能力,表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和ECM成分[5-6]。不過,肝纖維化是可逆的,特別是在早期纖維化階段,及時阻斷發(fā)病原因或增加ECM降解可以使纖維化緩解或消退[7]。藍盆花為常用蒙藥,又名蒙古山蘿卜花,具有澀、鈍、燥、膩、熏、涼等特性,清熱平“希拉”之功效[8-9],此外它在蒙醫(yī)中可單用,主要用于發(fā)熱、黃疸、肝熱癥、肝中毒等治療[10],但其對肝纖維化的作用機制尚不明確。課題組前期研究[11-13]已明確了額力根-7能通過調控Janus激酶2(JAK2)/信號傳導及轉錄激活蛋白(STAT3)、核因子κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(Akt)等信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用,而藍盆花是該復方中較為重要的藥材,因此本研究通過細胞實驗,探討藍盆花對PI3K/Akt信號通路的影響,為肝纖維化治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞系 SPF級雄性Wistar大鼠20只,體質量180～220 g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006,使用許可證編號:SYXK(蒙)2015-0001,均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心,室溫18～22 ℃,自由進食、飲水。大鼠HSC-T6購自北京北納科技有限公司。

1.1.2 藥品和主要試劑 藍盆花購自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)有限責任公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;兔抗-α-SMA、兔抗-Collagen Ⅰ、兔抗-PTEN、兔抗-PI3K、兔抗-Akt、兔抗-p-Akt購自武漢三鷹生物技術有限公司;FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍盆花含藥血清制備 將藍盆花粉碎過100目篩得到粉末,以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解。20只Wistar大鼠隨機分為對照組和給藥組,每組10只。對照組以生理鹽水代替藥物,給藥組藍盆花按成人最低劑量的10倍折算給藥(1 800 mg·kg-1·d-1)[10],兩組均每日灌胃1次。1周后腹主動脈取血,靜置20 min,3 000 r/min離心,56 ℃ 30 min滅活,0.22 μm濾膜過濾,得到含藥血清保存于-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)細胞實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 HSC-T6細胞均采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),保存于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。待細胞貼壁且生長密度達到80%～90%時,分別加入對照組血清(10%)、藍盆花含藥血清低劑量組(10%)、藍盆花含藥血清中劑量組(15%)及藍盆花含藥血清高劑量組(20%),繼續(xù)上述條件下培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測藍盆花對HSC的影響 參照碧云天MTT試劑盒說明書。將HSC-T6細胞配成5×103/mL細胞懸液,200 μL/孔接種于96孔板,待細胞貼壁繼續(xù)培養(yǎng)6 h,棄掉原上清,按上述分組加入不同劑量含藥血清培養(yǎng)液,每組設4個復孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h,加入10 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,于酶標儀490 nm處檢測各孔OD值并記錄結果,同時計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=[(對照組A值-處理組A值)/(對照組A值-調零組A值)]×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒檢測HSC-T6的凋亡率。調整細胞密度為5×104～1×105個/孔(6孔板),用胰蛋白酶消化收集細胞,離心棄上清,加入195 μL結合液重懸細胞。再分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,避光孵育10～20 min后上機。

1.2.5 qRT-PCR檢測mRNA表達 用Trizol法提取各組細胞的RNA,然后逆轉錄得到的cDNA進行q-PCR技術檢測。所有引物均由上海生工設計如下,β-actin:F 5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′,R 5′-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3′;α-SMA:F 5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′R 5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCGCAGC-3′;Collagen Ⅰ:F 5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC -3′,R 5′- CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′;PTEN:F 5′-TTGAAGACCATAACCCACCACAGC-3′,R 5′-CATTACACCAGTCCGTCCTTTCCC-3′;PI3K:F 5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3′,R 5′-CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′;Akt:F 5′-CAAGCACCGTGTGACCATGA-3′,R 5′-TCAGTAA-GCGTGTGGGCAAC-3′。所有體系分析均設3個重復,結果采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 提取各組細胞的蛋白,所得蛋白樣品95 ℃熱變性5 min,SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉膜,常溫封閉1 h,兔抗鼠GAPDH(1:20 000)為內(nèi)參,α-SMA(1∶2 500)、Collagen Ⅰ(1∶1 000)、PTEN(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)一抗4 ℃過夜。次日二抗(1∶1 000)常溫1 h后掃膜進行灰度值分析。以上實驗步驟獨立進行3次。

2 結果

2.1 藍盆花含藥血清對HSC-T6增殖的影響 MTT結果顯示,與對照組比較,給藥24 h后,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值顯著降低(P值均<0.01),抑制率分別為44.7%、35.23%和77.73%;給藥48 h后,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值顯著降低(P值均<0.01),抑制率分別為34.44%、27.65%、38.89%;給藥72 h后,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組的OD值降低(P值均<0.05),抑制率分別為13.02%、16.80%、21.44%(表1)。

表1 各組細胞OD值的檢測結果Table 1 Results of OD value of cells in each group

2.2 藍盆花含藥血清對HSC-T6凋亡的影響 與對照組比較,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組的細胞總凋亡率均顯著增高(P值均<0.05),且均以早期凋亡率增高為主(圖1,表2)。

圖1 藍盆花含藥血清各組細胞凋亡的流式圖Figure 1 The flow chart of cell apoptosis in each group of serum containing blue pot flower

表2 各組細胞凋亡率的檢測結果Table 2 Detection results of apoptosis rate in each group

2.3 HSC-T6中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt通路mRNA表達情況 qRT-PCR結果顯示:與對照組比較,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt mRNA表達顯著下調,PTEN mRNA表達顯著增高(P值均<0.05)(表3)。

表3 HSC-T6細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt及PTEN 的mRNA水平Table 3 The mRNA expression levels of α-SMA, Collagen Ⅰ, PI3K, Akt and PTEN in HSC-T6 cells

2.4 HSC-T6細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt通路蛋白表達情況 Western blot結果顯示:與對照組比較,藍盆花含藥血清低、中、高劑量組α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達顯著下調,PTEN蛋白表達顯著增高(P值均<0.05)(表4,圖2)。

圖2 各組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ和PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的電泳圖Figure 2 Electrophoresis plots of Collagen Ⅰ, α-SMA and PI3K/Akt signaling pathway-related protein expression in each group of cells

表4 HSC-T6細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt及PTEN的蛋白表達水平Table 4 The protein expression levels of α-SMA, Collagen Ⅰ, PI3K, Akt, p-Akt and PTEN in HSC-T6 cells

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病的常見病理基礎,若不及時治療,將會導致疾病進一步發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計,全球約33%的肝纖維化患者將進展為肝硬化,約85%的肝硬化患者被診斷為肝細胞癌[14]。肝纖維化有多種病因,這些致病因素最終通過炎癥和氧化應激損傷誘導肝臟發(fā)生纖維化[15]。在纖維化的病理狀態(tài)下,ECM在肝臟損傷處大量分泌和沉積,進而破壞肝臟的正常結構和功能[16]。因此,預防和治療肝纖維化具有重要臨床意義。

肝纖維化常以HSC的激活、遷移和增殖,以及纖維化發(fā)生為特征[17]。激活后的HSC不斷增殖、收縮,上調ECM成分和ECM修飾酶的合成,還產(chǎn)生促纖維細胞因子、生長因子和形態(tài)發(fā)生蛋白等,進而調節(jié)和影響組織結構[18]。α-SMA的表達是識別激活HSC的最突出標志物,通過改變細胞骨架和/或驅動細胞運動、收縮,參與傷口愈合期間的相關信號傳導過程[19-20]。而激活的HSC產(chǎn)生的纖維生成成分主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白組成,如纖維連接蛋白和蛋白多糖[21]。有大量研究[22-23]表明,在一些促纖維形成介質的刺激下,活化的HSC明顯上調α-SMA和Collagen Ⅰ的表達,使HSC遷移到受損部位,最終導致纖維化不可逆地持續(xù)進展。本研究基于前期的一些實驗結果進一步從細胞層面對單味藥展開探討,發(fā)現(xiàn)不同劑量的藍盆花含藥血清能抑制HSC-T6細胞增殖,并促進其凋亡。qRT-PCR和Western blot結果顯示,藍盆花各劑量組均不同程度地降低α-SMA和Collagen Ⅰ的mRNA及蛋白的表達。除此之外,實驗還探討了PI3K/Akt信號通路在肝纖維化中的作用機制。

PI3K/Akt通路是細胞周期過程中重要的細胞內(nèi)信號通路,它與細胞靜止、增殖、分化和自噬等有關。激活的PI3K發(fā)生磷酸化后能激活定位于細胞膜中的Akt,有助于Akt從細胞質轉移至細胞核,并進一步介導酶生物學效應,包括參與細胞增殖、凋亡抑制、細胞遷移、囊泡運輸和細胞癌轉化效應[24]。此外,PI3K/Akt信號通路還接受PTEN的調控,PTEN是該通路中的主要拮抗劑。PTEN作為3,4,5-三磷酸脂酸肌醇(PIP3)的最常見底物,多通過脫磷酸化反應維持PIP3處于低水平狀態(tài),進而下調PI3K/Akt通路表達[25]。Xiu等[26]和Liu等[27]研究得出,PI3K/Akt通路與ECM積累相關,當給予LY294002(PI3K/Akt信號轉導途徑的抑制劑)時,PTEN高表達、Akt(Ser 473、Thr 308)低表達,并減少了結締組織生長因子、纖連蛋白和膠原蛋白的產(chǎn)生。本研究結果與上述相一致,在HSC活化過程中,藍盆花各劑量組PTEN顯著上調,PI3K、Akt、p-Akt的表達下調,提示藍盆花的抗肝纖維化與PI3K/AKT信號通路有關。

綜上所述,藍盆花能通過下調PI3K/Akt信號通路直接或間接改善肝纖維化,促使激活的HSC凋亡,提示它可能是治療肝纖維化的潛在藥物。

倫理學聲明:本研究方案于2015年3月11日經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學生物醫(yī)學科研倫理委員會審批,批號:YKD2015153,符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明:顏羽昕、高曉陽負責課題設計,資料分析,撰寫論文;張春艷、金蓉參與收集數(shù)據(jù),修改論文;袁宏偉、馬月宏負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿。