產(chǎn)氣柯林斯菌聯(lián)合丁酸梭菌干預(yù)局灶性缺血性腦卒中小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

徐曉松,蔡祥勝,周 輝,李瑞瑩,陳小明,官煜彬

缺血性腦卒中是由于腦部血管發(fā)生暫時(shí)或永久性阻塞從而引發(fā)的組織損傷,具有致殘率高及致死率高的特點(diǎn),缺血性腦卒中的發(fā)生與高血壓、糖尿病、心臟病、肥胖、血脂異常、代謝異常等因素有關(guān)[1-4]。腦梗死體積大小和神經(jīng)系統(tǒng)功能受損程度與疾病發(fā)生后側(cè)支血流循環(huán)的建立、血壓灌注及藥物的使用密切相關(guān)。目前,缺血性腦卒中的治療手段主要以組織型纖溶酶原激活物溶栓為主,其中藥物治療以改善腦部血循環(huán)的抗血栓藥物及腦神經(jīng)保護(hù)藥物為主[5-6]。但是,使用抗凝藥時(shí),要充分考慮藥物之間的相互作用及其療效等,而腦神經(jīng)保護(hù)藥物的療效及安全性也有待進(jìn)一步的觀察與研究[6]。腦卒中后可引起腸道菌群失調(diào),而腸道菌群的失調(diào)又可影響腦卒中的預(yù)后,研究表明,腦卒中發(fā)生前后相關(guān)生化指標(biāo)濃度會(huì)發(fā)生變化[7-8]。改變腸道菌群結(jié)構(gòu)特征可改善病人生理功能,延緩疾病進(jìn)展[9]。因此,本研究擬通過(guò)建立局灶性缺血性腦卒中小鼠模型,觀察經(jīng)產(chǎn)氣柯林斯菌及丁酸梭菌聯(lián)合干預(yù)后,小鼠神經(jīng)行為學(xué)、腦卒中后腦組織梗死體積及相關(guān)炎性指標(biāo)的變化,探討該特定菌群對(duì)缺血性腦卒中的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)8～10周齡C57BL/6J雄性小鼠48只,購(gòu)自珠海百試通生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0051]。所有小鼠均在 SPF 級(jí)動(dòng)物房中分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,室溫(24±2)℃,每12 h晝夜交替,自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)、生理鹽水組(9只)、產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組(9只)、丁酸梭菌懸液組(9只)、混合菌懸液組(9只),生理鹽水組、產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組每日分別給予生理鹽水、產(chǎn)氣柯林斯菌懸液、丁酸梭菌懸液、混合菌懸液灌胃1次,灌胃容積為10 g(0.1～0.2 mL),最大容積不超過(guò)0.8 mL。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,BSC-1304ⅡB2)、低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司,海爾DW-25L262)、灌胃器(自制)、小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷：粑鼨C(jī)(卡爾文公司,KW-10)、麻醉機(jī)(Matrx,7025)等。小鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6檢測(cè)試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司),無(wú)菌生理鹽水(購(gòu)自石家莊四藥有限公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(Sigma公司)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種獲取及配制 將缺血性腦卒中病人糞便進(jìn)行厭氧培養(yǎng),篩選后進(jìn)行多次增菌培養(yǎng),獲得產(chǎn)氣柯林斯菌和丁酸梭菌并留取菌種備用,分別將產(chǎn)氣柯林斯菌菌懸液和丁酸梭菌菌懸液按1∶1混合配制成含菌個(gè)數(shù)約為1×1010菌落形成單位(cfu)/mL的混合菌懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 采用吸入異氟烷誘導(dǎo)麻醉的方法對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉處理。采用頸外動(dòng)脈插線(xiàn)法建立局灶性缺血性腦卒中小鼠模型[10],小鼠缺血2 h后抽出線(xiàn)栓形成腦部血管再灌注,期間保持小鼠肛溫為(37.0±0.5)℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 IL-1β、IL-6檢測(cè) 采用尾尖取血法采集各組小鼠建模成功后2 h、1周、2周0.3 mL血后離心,檢測(cè)IL-1β、IL-6濃度。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及模型成功判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)建模成功后2 h、1周、2周,根據(jù)Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)相應(yīng)模型進(jìn)行美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分。Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:無(wú)神經(jīng)功能損傷,小鼠表現(xiàn)正常計(jì)0分;提尾時(shí),小鼠右前肢屈曲,伸直不完全計(jì)1分;小鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分;小鼠向右側(cè)傾倒計(jì)3分;小鼠不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失計(jì)4分。1～3分表明造模成功。

1.3.3 腦卒中病灶體積測(cè)定 在上述相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間段處死實(shí)驗(yàn)小鼠(對(duì)照組每次處死4只,其他各組每次處死3只)并取新鮮腦組織,低溫冰凍后行冠狀面連續(xù)切片并進(jìn)行TTC染色,采用Image J軟件測(cè)定腦卒中病灶體積。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠NIHSS評(píng)分比較 與對(duì)照組及生理鹽水組比較,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組建模成功后2周NIHSS評(píng)分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠NIHSS評(píng)分比較(±s) 單位:分

2.2 各組小鼠IL-1β、IL-6比較 與對(duì)照組及生理鹽水組比較,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組建模成功后2周L-1β、IL-6降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠IL-1β、IL-6水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.3 各組小鼠腦卒中病灶體積比較 與對(duì)照組及生理鹽水組比較,在建模成功后1周,混合菌懸液組小鼠腦卒中病灶體積已開(kāi)始減少(P<0.05);建模成功后2周,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組小鼠相對(duì)腦卒中病灶體積減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1～圖3及表3。

表3 各組小鼠腦卒中病灶體積比較(±s) 單位:%

圖1 各組小鼠建模成功后2 H腦組織TTC染色圖(白色為腦缺血組織,紅色為正常腦組織)

圖2 各組小鼠建模成功后1周腦組織TTC染色圖(白色為腦缺血組織,紅色為正常腦組織)

圖3 各組小鼠建模成功后2周腦組織TTC染色圖(白色為腦缺血組織,紅色為正常腦組織)

2.4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織相對(duì)缺血體積與非缺血體積百分比比較 與建模成功后2 h比較,建模成功后1周,各組小鼠腦組織相對(duì)缺血體積均發(fā)生了增大的趨勢(shì),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);建模成功后2周,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組小鼠腦組織相對(duì)缺血體積降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠腦組織相對(duì)缺血體積與非缺血體積百分比直方圖

2.5 IL-1β、IL-6與小鼠腦卒中病灶體積的相關(guān)性 IL-1β、IL-6與小鼠腦卒中病灶體積呈正相關(guān)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 IL-1β與小鼠腦卒中病灶體積相關(guān)性的散點(diǎn)圖

圖6 IL-6與小鼠腦卒中病灶體積相關(guān)性的散點(diǎn)圖

3 討 論

研究顯示,益生菌活菌制劑聯(lián)合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可提升重癥腦卒中病人的治療效果、調(diào)節(jié)菌群平衡、降低不良反應(yīng)發(fā)生率,具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。Liu等[12]采用灌胃的方法將多形擬桿菌移植到小鼠腸道內(nèi),發(fā)現(xiàn)小鼠的體重發(fā)生了變化,同時(shí)代謝途徑及機(jī)體炎癥狀態(tài)得到顯著改善。腸道微生物群中的丁酸梭菌可減少中樞神經(jīng)功能損傷[13]。柯林斯菌為代謝產(chǎn)物,與中樞神經(jīng)及免疫系統(tǒng)顯著相關(guān),可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[14]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組及生理鹽水組比較,建模成功后2周,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組NIHSS評(píng)分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明產(chǎn)氣柯林斯菌及丁酸梭菌單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)一定時(shí)間后均可對(duì)局灶性缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)功能起保護(hù)作用。

局灶性缺血性腦卒中是由于小鼠腦組織缺血、缺氧及缺血再灌注損傷導(dǎo)致相關(guān)區(qū)域神經(jīng)組織細(xì)胞的部分死亡,從而表現(xiàn)出腦神經(jīng)損傷及神經(jīng)功能缺失等癥狀[15]。研究顯示,丁酸梭菌可通過(guò)激活與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡密切相關(guān)的蛋白激酶B(AKT)通路,降低促凋亡相關(guān)蛋白含量及提高抗凋亡相關(guān)蛋白濃度,具有保護(hù)腦部神經(jīng)組織細(xì)胞、減輕腦組織損傷的作用[16]。在一項(xiàng)動(dòng)物研究中,經(jīng)過(guò)相關(guān)藥物有效治療后的大鼠腸道中的短鏈脂肪酸(SCFA)產(chǎn)生菌-產(chǎn)氣柯林斯菌的比例明顯升高,且炎癥顯著改善[17]。SCFA是腸道細(xì)菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)生的溶于水的游離脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸[18]。研究表明,SCFA產(chǎn)生菌可減輕缺血性腦卒中小鼠腦卒中后的神經(jīng)功能障礙和炎癥,同時(shí)也可提高腸道、大腦和血漿中的SCFA濃度[19]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,混合菌懸液組小鼠無(wú)論是在建模成功后1周或2周的時(shí)間點(diǎn)上,腦卒中病灶體積增大趨勢(shì)均明顯減緩(P<0.05),而產(chǎn)氣柯林斯菌組及丁酸梭菌組建模成功后1周腦卒中病灶體積增大趨勢(shì)暫未發(fā)現(xiàn)有明顯減緩趨勢(shì)(P>0.05)。

進(jìn)一步分析各組小鼠的腦卒中病灶體積百分比,相較于建模成功后2 h,在建模成功后1周,各組小鼠腦卒中病灶體積均增大(P<0.05),但在建模成功后2周,與相應(yīng)的建模成功后1周比較,各組小鼠腦卒中病灶體積縮小(P<0.05)。動(dòng)物研究表明,缺血腦卒中大鼠缺血再灌注后第7天梗死灶體積最嚴(yán)重,第14天梗死灶有自發(fā)縮小趨勢(shì)[20],這與本研究結(jié)果基本一致。然而,本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,產(chǎn)氣柯林斯菌懸液組、丁酸梭菌懸液組、混合菌懸液組建模成功后2周小鼠腦卒中病灶體積明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但對(duì)照組和生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究表明,產(chǎn)氣柯林斯菌及丁酸梭菌聯(lián)合干預(yù)對(duì)局灶性缺血性腦卒中小鼠的腦部神經(jīng)組織損傷具有一定的保護(hù)作用。

宿主的免疫炎性因子與腸道菌群結(jié)構(gòu)特征相關(guān),IL-1β、IL-6等相關(guān)因子具有神經(jīng)保護(hù)作用,且與缺血性腦卒中的腦損傷程度相關(guān)[21-22]。丁酸梭菌可通過(guò)其代謝產(chǎn)物SCFA改善宿主的腸道通透性,減少炎性因子IL-1β及IL-6的分泌從而發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[23]。另有研究指出,柯林斯菌屬可通過(guò)其代謝產(chǎn)物促進(jìn)宿主體內(nèi)的酶合成脫氧熊膽酸,從而提高宿主物質(zhì)及能量代謝,發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[24]。減少缺血性腦卒中病人炎性因子IL-1β、IL-6的分泌,可改善病人的預(yù)后[25]。本研究結(jié)果顯示,混合菌懸液組在混合菌懸液干預(yù)2周后,與對(duì)照組、生理鹽水組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且IL-1β、IL-6水平與小鼠腦卒中病灶體積呈正相關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,產(chǎn)氣柯林斯菌及丁酸梭菌聯(lián)合干預(yù)2周后,對(duì)保護(hù)局灶性缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)功能、緩解小鼠腦部炎癥、減小小鼠腦卒中病灶體積均具有一定的作用。