circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路干預(yù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的機(jī)制研究

別自東,郭 影

心肌缺血后在恢復(fù)血流灌注過(guò)程中出現(xiàn)的心肌損傷進(jìn)一步加重為心肌缺血/再灌注損傷(MI/RI)[1]。MI/RI在心血管系統(tǒng)疾病的治療過(guò)程中較常出現(xiàn),給病人的手術(shù)治療帶來(lái)了極大的困擾[2]。因此,減輕MI/RI對(duì)預(yù)后具有重要的臨床意義。研究表明,非編碼RNA在MI/RI的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。缺氧/復(fù)氧(H/R)可導(dǎo)致miR-30a在心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯減少,上調(diào)miR-30a的表達(dá)可明顯減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活力下降和凋亡[5]。另一種非編碼RNA——環(huán)狀RNA(circRNA)同樣在各種心肌疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。circRNA的功能與微小RNA(miRNA)密切相關(guān)[7]。在線工具分析顯示,circRNA-6874含有miR-30a的結(jié)合位點(diǎn),且基質(zhì)相互作用分子2(STIM2)是miR-30a的一個(gè)重要下游靶基因[8]。STIM2參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。本研究探討circRNA-6874是否通過(guò)調(diào)控miR-30a/STIM2在H/R中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人心肌細(xì)胞和專用心肌細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室;胎牛血清、雙抗、Lipofectamine 2000和SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司;Magna RIP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Merck公司;siRNAs和miRNAs購(gòu)自廣州銳博公司;熒光探針DCFH-DA、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)試劑和化學(xué)發(fā)光底物(ECL)購(gòu)自上海碧云天公司;STIM2抗體和二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所;雙熒光素酶報(bào)告載體和Dual Glo Luciferase Assay System購(gòu)自美國(guó)Promega公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司;定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司等。

1.2 心肌細(xì)胞H/R模型的構(gòu)建 人心肌細(xì)胞用含5%胎牛血清、雙抗和1%心肌細(xì)胞生長(zhǎng)添加物的專用心肌細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)糖培養(yǎng)基先用含95%N2和5%CO2的氣體預(yù)處理30 min后加入心肌細(xì)胞中。將上述細(xì)胞置于37 ℃及含94%N2、1%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)8 h,然后更換正常培養(yǎng)基于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)24 h。

1.3 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀 采用Magna RIP試劑盒進(jìn)行RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)。離心收集1×107個(gè)心肌細(xì)胞,加入RIP Lysis Buffer裂解。先將磁珠與Argonaute 2(AGO2)抗體、陰性對(duì)照免疫球蛋白G(IgG)進(jìn)行結(jié)合,然后加入到上述細(xì)胞裂解物中4 ℃孵育過(guò)夜。分離提取沉淀的RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)circRNA-6874、miR-30a的表達(dá)水平。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將circRNA-6874的全序列或STIM2的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)序列克隆到雙熒光素酶報(bào)告載體中,所得質(zhì)粒定義為野生型質(zhì)粒。將上述野生型質(zhì)粒中miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,獲得突變型質(zhì)粒。上述質(zhì)粒分別與miR-30a模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用Dual Glo Luciferase Assay System檢測(cè)熒光素酶活性的變化。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測(cè) 胰酶消化和收集心肌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于6孔培養(yǎng)板中。第2天采用Lipofectamine 2000對(duì)circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics和STIM2 siRNA分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染,同時(shí)circRNA-6874 siRNA和miR-30a抑制物(inhibitors)、miR-30a mimics和STIM2過(guò)表達(dá)載體(STIM2-O)、circRNA-6874 siRNA和STIM2-O分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后再進(jìn)行H/R處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集心肌細(xì)胞,提取RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBRTMGreen PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)circRNA-6874、miR-30a和STIM2表達(dá),采用2-ΔΔCt法分析RNA的表達(dá)水平。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè) 收集心肌細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液進(jìn)行裂解。測(cè)定上述裂解物的蛋白含量,進(jìn)行15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完畢后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜中,加入STIM2抗體孵育2 h。再繼續(xù)加入二抗孵育,用化學(xué)發(fā)光底物(ECL)顯影蛋白條帶,定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞存活力檢測(cè) 胰酶消化和收集心肌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于96孔培養(yǎng)板中。分別轉(zhuǎn)染后進(jìn)行H/R處理,然后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活力。每孔加入10 μL CCK-8溶液,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(450 nm),計(jì)算細(xì)胞存活力。

1.8 心肌細(xì)胞損傷檢測(cè) 離心收集心肌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH的濃度,由此評(píng)估心肌細(xì)胞的損傷水平。

1.9 心肌細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè) 先用無(wú)血清培養(yǎng)基將熒光探針DCFH-DA稀釋至10 μmol/L,往培養(yǎng)的細(xì)胞中加入適量DCFH-DA,放置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min,期間間隔幾分鐘混勻一下,完成后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞,最后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)ROS水平。

1.10 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用PBS洗滌培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,然后在4 ℃下用4%甲醛固定25 min。加入0.2% tritonx-100繼續(xù)孵育5 min后,加入100 μL平衡緩沖液于室溫下放置10 min。細(xì)胞繼續(xù)與50 μL含核苷酸混合物和TdT的TUNEL反應(yīng)混合物于37 ℃下作用60 min,然后用檸檬酸鈉鹽緩沖液(SSC)洗滌細(xì)胞15 min。分別用0.3% H2O2和鏈霉親和素工作液于室溫下處理細(xì)胞10 min和30 min。最后加入0.5 μg/mL DAPI作用5 min,于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.11 Caspase-3活性檢測(cè) 將心肌細(xì)胞裂解物和特定底物置于96孔板中,37 ℃培養(yǎng)2 h。在激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm的熒光酶標(biāo)儀中,通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度測(cè)定Caspase-3酶的活性。

2 結(jié) 果

2.1 H/R誘導(dǎo)circRNA-6874表達(dá)而抑制miR-30a的表達(dá) 用ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)在線工具分析具有潛在miR-30a結(jié)合位點(diǎn)的circRNAs發(fā)現(xiàn),circRNA-6874(hsa_circ_0077722)具有多個(gè)miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步用RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可見(jiàn),AGO2抗體顯著富集circRNA-6874和miR-30a(見(jiàn)圖2)。另外,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明,含野生型circRNA-6874序列的質(zhì)粒與miR-30a共轉(zhuǎn)染時(shí),熒光素酶活性明顯下降(P<0.05);當(dāng)將circRNA-6874序列中miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變(突變型)后,熒光素酶活性變化不明顯(見(jiàn)圖3,P>0.05)。上述實(shí)驗(yàn)表明,circRNA-6874能與miR-30a直接結(jié)合。將心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R處理時(shí),circRNA-6874的表達(dá)明顯上調(diào),而miR-30a的表達(dá)明顯下降(P<0.05);抑制circRNA-6874表達(dá)(H/R+circRNA-6874 siRNA)后,miR-30a的表達(dá)明顯回升(見(jiàn)圖4、圖5,P>0.05)。因此,H/R會(huì)導(dǎo)致circRNA-6874在心肌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而抑制miR-30a的表達(dá)。

圖1 circRNA-6874序列中miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)

與IgG比較,＊ P<0.05。圖2 RIP檢測(cè)AGO2抗體富集circRNA-6874和miR-30a的量

與NC miRNA比較,＊ P<0.05圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)circRNA-6874和miR-30a的結(jié)合能力

與空白對(duì)照比較,＊P<0.05。圖4 RT-qPCR檢測(cè)circRNA-6874表達(dá)水平

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖5 RT-qPCR檢測(cè)miR-30a表達(dá)水平

2.2 H/R通過(guò)circRNA-6874/miR-30a促進(jìn)STIM2的表達(dá) 同時(shí)用ENCORI分析miR-30a的下游靶基因發(fā)現(xiàn),STIM2是其中一個(gè)重要的靶基因,其序列中含有多個(gè)miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)。將STIM2的3′非編碼區(qū)克隆進(jìn)雙熒光素酶載體(野生型)后與miR-30a模擬物共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,可見(jiàn)熒光素酶活性明顯下降(P<0.05);將miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變(突變型)后,熒光素酶活性明顯回升(見(jiàn)圖7,P>0.05),表明miR-30a能與STIM2結(jié)合。與空白對(duì)照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組、H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組和H/R+circRNA-6874 siRNA+STIM2-O組中STIM2的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),而H/R+circRNA-6874 siRNA組和H/R+miR-30a mimics組中STIM2的表達(dá)明顯回調(diào)(見(jiàn)圖8～圖10,P>0.05)。因此,H/R能通過(guò)circRNA-6874/miR-30a促進(jìn)心肌細(xì)胞表達(dá)STIM2。

圖6 STIM2序列中miR-30a的結(jié)合位點(diǎn)

與NC miRNA比較,＊ P<0.05。圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)STIM2和miR-30a的結(jié)合能力

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖8 RT-qPCR檢測(cè)STIM2的mRNA水平

圖9 Western Blot檢測(cè)STIM2的蛋白表達(dá)條帶圖

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖10 Western Blot檢測(cè)STIM2的蛋白表達(dá)水平(NC為心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性siRNA、miRNA和空載體)

2.3 circRNA-6874/miR-30a/STIM2參與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激 進(jìn)一步檢測(cè)circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路在心肌細(xì)胞中的功能發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組的細(xì)胞存活力下降、心肌損傷主要標(biāo)志物L(fēng)DH的釋放和ROS的產(chǎn)生增強(qiáng)(見(jiàn)圖3,均P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA組、H/R+miR-30a mimics組和H/R+STIM2 siRNA組的細(xì)胞存活力明顯恢復(fù)、LDH釋放量減少和ROS生成下降(見(jiàn)圖11,P>0.05),表明H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激水平明顯減弱。因此,H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激通過(guò)circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路進(jìn)行。

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖11 H/R通過(guò)circRNA-6874/miR-30a/STIM2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激[心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics、circRNA-6874 siRNA和miR-30a inhibitors、miR-30a mimics和STIM2過(guò)表達(dá)載體(STIM2-O)、STIM2 siRNA后再進(jìn)行H/R處理。A為用CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活力;B為生化分析儀檢測(cè)LDH釋放量;C為熒光探針DCFH-DA檢測(cè)ROS生成量。NC:心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性siRNA、miRNA和空載體]

2.4 circRNA-6874/miR-30a/STIM2調(diào)控H/R條件下心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程 同時(shí)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡表明,與空白對(duì)照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組的細(xì)胞凋亡和Caspase-3活性明顯增加(見(jiàn)圖12～圖14,P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA組、H/R+miR-30a mimics組和H/R+STIM2 siRNA組的細(xì)胞凋亡水平和Caspase-3活性回落(P>0.05)。因此,H/R通過(guò)circRNA-6874/miR-30a/STIM2而激活凋亡通路,進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

圖12 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平熒光圖

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖13 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平

與空白對(duì)照比較,＊ P<0.05。圖14 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase-3活性

3 討 論

多種非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制的研究表明,其在多種疾病的進(jìn)展過(guò)程中具有重要價(jià)值[10]。其中,miRNA是發(fā)現(xiàn)較早且研究較多的非編碼RNA,其在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,并有可能成為疾病的特異性標(biāo)志物[11-12]。本研究表明,miR-30a在H/R心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào),上調(diào)miR-30a的表達(dá)會(huì)明顯逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和凋亡增加,表明miR-30a是一種心肌保護(hù)性miRNA,在心肌損傷過(guò)程中具有重要意義。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-30a在MI/RI小鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào),而丹酚酸B可通過(guò)上調(diào)miR-30a表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞存活力、減少LDH釋放和抑制自噬,用miR-30a抑制物下調(diào)miR-30a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丹酚酸B抑制MI/RI損傷的作用。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-30a在氧糖剝奪的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注的小鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)明顯下調(diào),其表達(dá)增強(qiáng)會(huì)抑制自噬和缺血損傷,從而減輕缺血性腦卒中病人的神經(jīng)細(xì)胞死亡。另外,miR-30a可靶向抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)而減少心肌梗死后心肌膠原的生成,進(jìn)而抑制心肌纖維化,從而改善心功能[15]。

本研究結(jié)果顯示,miR-30a可靶向抑制STIM2的表達(dá)。研究表明,STIM2和STIM1通過(guò)促進(jìn)Ca2+內(nèi)流而在多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用[16-18]。Tu等[19]在H9c2和原代新生兒心肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),STIM2在MI/RI損傷的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),抑制STIM2表達(dá)會(huì)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放和線粒體鈣超載,從而減輕線粒體損傷并維持線粒體功能,最終減少M(fèi)I/RI損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí),在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究也有類似的發(fā)現(xiàn),研究表明,STIM2是缺血誘導(dǎo)神經(jīng)元胞漿Ca2+積聚所必需的;與野生型對(duì)照組比較,STIM2-/-小鼠神經(jīng)元在缺氧條件下的存活率明顯提高;在體內(nèi)局灶性腦缺血模型中,STIM2-/-小鼠對(duì)神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)作用[20]。上述結(jié)果均與本研究結(jié)果類似。

circRNA是具有多種調(diào)控功能的非編碼RNA[21]。研究表明,circRNA通過(guò)多種作用機(jī)制在心血管等各種疾病中發(fā)揮重要作用[22]。本研究結(jié)果顯示,circRNA-6874在H/R心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),抑制其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致miR-30a表達(dá)增強(qiáng),而STIM2表達(dá)抑制,同時(shí)減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡,表明circRNA-6874/miR-30a/STIM2可能是H/R誘導(dǎo)損傷的一條關(guān)鍵通路。Ge等[23]分離檢測(cè)MI/RI心臟所釋放的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中circRNA的表達(dá)譜,共鑒定出185個(gè)明顯差異表達(dá)的circRNAs,其中MI/RI組與假手術(shù)組比較下調(diào)119個(gè)、上調(diào)66個(gè),揭示了circRNA在假手術(shù)和MI/RI心臟組織胞外囊泡中的特異表達(dá)模式,為circRNA和胞外囊泡參與MI/RI損傷提供了一些可能的靶點(diǎn)和途徑,為circRNA和胞外囊泡在心臟MI/RI病理過(guò)程中的作用提供了重要依據(jù)。Hu等[24]研究表明,H/R誘導(dǎo)circSAMD4A水平上調(diào),抑制circSAMD4A表達(dá)可減少H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng);circSAMD4A在體內(nèi)外抑制miR-138-5p的表達(dá),從而促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜合上述,circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路可能通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激和凋亡促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。