circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路干預心肌細胞缺氧/復氧損傷的機制研究

別自東,郭 影

心肌缺血后在恢復血流灌注過程中出現(xiàn)的心肌損傷進一步加重為心肌缺血/再灌注損傷(MI/RI)[1]。MI/RI在心血管系統(tǒng)疾病的治療過程中較常出現(xiàn),給病人的手術治療帶來了極大的困擾[2]。因此,減輕MI/RI對預后具有重要的臨床意義。研究表明,非編碼RNA在MI/RI的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。缺氧/復氧(H/R)可導致miR-30a在心肌細胞中的表達明顯減少,上調miR-30a的表達可明顯減少H/R誘導的心肌細胞存活力下降和凋亡[5]。另一種非編碼RNA——環(huán)狀RNA(circRNA)同樣在各種心肌疾病中發(fā)揮關鍵作用[6]。circRNA的功能與微小RNA(miRNA)密切相關[7]。在線工具分析顯示,circRNA-6874含有miR-30a的結合位點,且基質相互作用分子2(STIM2)是miR-30a的一個重要下游靶基因[8]。STIM2參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。本研究探討circRNA-6874是否通過調控miR-30a/STIM2在H/R中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人心肌細胞和專用心肌細胞培養(yǎng)基購自ScienCell研究實驗室;胎牛血清、雙抗、Lipofectamine 2000和SYBR Green PCR Master Mix購自美國賽默飛公司;Magna RIP試劑盒購自美國Merck公司;siRNAs和miRNAs購自廣州銳博公司;熒光探針DCFH-DA、細胞計數試劑盒(CCK-8)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)試劑和化學發(fā)光底物(ECL)購自上海碧云天公司;STIM2抗體和二抗購自美國Abcam公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑購自南京建成生物工程研究所;雙熒光素酶報告載體和Dual Glo Luciferase Assay System購自美國Promega公司;細胞培養(yǎng)箱購自日本三洋公司;定量PCR儀購自美國ABI公司;熒光酶標儀購自美國賽默飛公司等。

1.2 心肌細胞H/R模型的構建 人心肌細胞用含5%胎牛血清、雙抗和1%心肌細胞生長添加物的專用心肌細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。無糖培養(yǎng)基先用含95%N2和5%CO2的氣體預處理30 min后加入心肌細胞中。將上述細胞置于37 ℃及含94%N2、1%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)8 h,然后更換正常培養(yǎng)基于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)24 h。

1.3 RNA結合蛋白免疫沉淀 采用Magna RIP試劑盒進行RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗。離心收集1×107個心肌細胞,加入RIP Lysis Buffer裂解。先將磁珠與Argonaute 2(AGO2)抗體、陰性對照免疫球蛋白G(IgG)進行結合,然后加入到上述細胞裂解物中4 ℃孵育過夜。分離提取沉淀的RNA,逆轉錄后采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測circRNA-6874、miR-30a的表達水平。

1.4 雙熒光素酶報告基因實驗 將circRNA-6874的全序列或STIM2的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)序列克隆到雙熒光素酶報告載體中,所得質粒定義為野生型質粒。將上述野生型質粒中miR-30a的結合位點進行突變,獲得突變型質粒。上述質粒分別與miR-30a模擬物(mimics)轉染細胞,用Dual Glo Luciferase Assay System檢測熒光素酶活性的變化。

1.5 細胞轉染和RT-qPCR檢測 胰酶消化和收集心肌細胞,調整細胞濃度后接種于6孔培養(yǎng)板中。第2天采用Lipofectamine 2000對circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics和STIM2 siRNA分別進行轉染,同時circRNA-6874 siRNA和miR-30a抑制物(inhibitors)、miR-30a mimics和STIM2過表達載體(STIM2-O)、circRNA-6874 siRNA和STIM2-O分別進行共轉染。轉染4 h后再進行H/R處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集心肌細胞,提取RNA后進行逆轉錄。根據SYBRTMGreen PCR Master Mix說明書進行RT-qPCR檢測circRNA-6874、miR-30a和STIM2表達,采用2-ΔΔCt法分析RNA的表達水平。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測 收集心肌細胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液進行裂解。測定上述裂解物的蛋白含量,進行15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完畢后將蛋白條帶轉移到硝化纖維素膜中,加入STIM2抗體孵育2 h。再繼續(xù)加入二抗孵育,用化學發(fā)光底物(ECL)顯影蛋白條帶,定量分析蛋白相對表達水平。

1.7 細胞存活力檢測 胰酶消化和收集心肌細胞,調整細胞濃度后接種于96孔培養(yǎng)板中。分別轉染后進行H/R處理,然后用CCK-8法檢測細胞存活力。每孔加入10 μL CCK-8溶液,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用酶標儀測定光吸收值(450 nm),計算細胞存活力。

1.8 心肌細胞損傷檢測 離心收集心肌細胞的培養(yǎng)上清液,按試劑盒說明書用全自動生化分析儀檢測LDH的濃度,由此評估心肌細胞的損傷水平。

1.9 心肌細胞活性氧(ROS)檢測 先用無血清培養(yǎng)基將熒光探針DCFH-DA稀釋至10 μmol/L,往培養(yǎng)的細胞中加入適量DCFH-DA,放置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min,期間間隔幾分鐘混勻一下,完成后用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞,最后用熒光分光光度計檢測ROS水平。

1.10 TUNEL檢測細胞凋亡 用PBS洗滌培養(yǎng)的心肌細胞,然后在4 ℃下用4%甲醛固定25 min。加入0.2% tritonx-100繼續(xù)孵育5 min后,加入100 μL平衡緩沖液于室溫下放置10 min。細胞繼續(xù)與50 μL含核苷酸混合物和TdT的TUNEL反應混合物于37 ℃下作用60 min,然后用檸檬酸鈉鹽緩沖液(SSC)洗滌細胞15 min。分別用0.3% H2O2和鏈霉親和素工作液于室溫下處理細胞10 min和30 min。最后加入0.5 μg/mL DAPI作用5 min,于熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

1.11 Caspase-3活性檢測 將心肌細胞裂解物和特定底物置于96孔板中,37 ℃培養(yǎng)2 h。在激發(fā)波長為380 nm和發(fā)射波長為440 nm的熒光酶標儀中,通過測量熒光強度測定Caspase-3酶的活性。

2 結 果

2.1 H/R誘導circRNA-6874表達而抑制miR-30a的表達 用ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)在線工具分析具有潛在miR-30a結合位點的circRNAs發(fā)現(xiàn),circRNA-6874(hsa_circ_0077722)具有多個miR-30a的結合位點(見圖1)。進一步用RIP實驗檢測可見,AGO2抗體顯著富集circRNA-6874和miR-30a(見圖2)。另外,雙熒光素酶報告基因實驗表明,含野生型circRNA-6874序列的質粒與miR-30a共轉染時,熒光素酶活性明顯下降(P<0.05);當將circRNA-6874序列中miR-30a的結合位點進行突變(突變型)后,熒光素酶活性變化不明顯(見圖3,P>0.05)。上述實驗表明,circRNA-6874能與miR-30a直接結合。將心肌細胞進行H/R處理時,circRNA-6874的表達明顯上調,而miR-30a的表達明顯下降(P<0.05);抑制circRNA-6874表達(H/R+circRNA-6874 siRNA)后,miR-30a的表達明顯回升(見圖4、圖5,P>0.05)。因此,H/R會導致circRNA-6874在心肌細胞中的表達上調,進而抑制miR-30a的表達。

圖1 circRNA-6874序列中miR-30a的結合位點

與IgG比較,＊ P<0.05。圖2 RIP檢測AGO2抗體富集circRNA-6874和miR-30a的量

與NC miRNA比較,＊ P<0.05圖3 雙熒光素酶報告基因實驗檢測circRNA-6874和miR-30a的結合能力

與空白對照比較,＊P<0.05。圖4 RT-qPCR檢測circRNA-6874表達水平

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖5 RT-qPCR檢測miR-30a表達水平

2.2 H/R通過circRNA-6874/miR-30a促進STIM2的表達 同時用ENCORI分析miR-30a的下游靶基因發(fā)現(xiàn),STIM2是其中一個重要的靶基因,其序列中含有多個miR-30a的結合位點(見圖6)。將STIM2的3′非編碼區(qū)克隆進雙熒光素酶載體(野生型)后與miR-30a模擬物共轉染進細胞,可見熒光素酶活性明顯下降(P<0.05);將miR-30a的結合位點進行突變(突變型)后,熒光素酶活性明顯回升(見圖7,P>0.05),表明miR-30a能與STIM2結合。與空白對照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組、H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組和H/R+circRNA-6874 siRNA+STIM2-O組中STIM2的表達明顯上調(P<0.05),而H/R+circRNA-6874 siRNA組和H/R+miR-30a mimics組中STIM2的表達明顯回調(見圖8～圖10,P>0.05)。因此,H/R能通過circRNA-6874/miR-30a促進心肌細胞表達STIM2。

圖6 STIM2序列中miR-30a的結合位點

與NC miRNA比較,＊ P<0.05。圖7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測STIM2和miR-30a的結合能力

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖8 RT-qPCR檢測STIM2的mRNA水平

圖9 Western Blot檢測STIM2的蛋白表達條帶圖

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖10 Western Blot檢測STIM2的蛋白表達水平(NC為心肌細胞轉染陰性siRNA、miRNA和空載體)

2.3 circRNA-6874/miR-30a/STIM2參與H/R誘導的心肌細胞損傷和氧化應激 進一步檢測circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路在心肌細胞中的功能發(fā)現(xiàn),與空白對照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組的細胞存活力下降、心肌損傷主要標志物LDH的釋放和ROS的產生增強(見圖3,均P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA組、H/R+miR-30a mimics組和H/R+STIM2 siRNA組的細胞存活力明顯恢復、LDH釋放量減少和ROS生成下降(見圖11,P>0.05),表明H/R誘導的細胞損傷和氧化應激水平明顯減弱。因此,H/R誘導心肌細胞損傷和氧化應激通過circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路進行。

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖11 H/R通過circRNA-6874/miR-30a/STIM2誘導心肌細胞損傷和氧化應激[心肌細胞分別轉染circRNA-6874 siRNA、miR-30a mimics、circRNA-6874 siRNA和miR-30a inhibitors、miR-30a mimics和STIM2過表達載體(STIM2-O)、STIM2 siRNA后再進行H/R處理。A為用CCK-8法檢測心肌細胞存活力;B為生化分析儀檢測LDH釋放量;C為熒光探針DCFH-DA檢測ROS生成量。NC:心肌細胞轉染陰性siRNA、miRNA和空載體]

2.4 circRNA-6874/miR-30a/STIM2調控H/R條件下心肌細胞的凋亡進程 同時檢測心肌細胞凋亡表明,與空白對照組比較,H/R組、H/R+circRNA-6874 siRNA+miR-30a inhibitors組和H/R+miR-30a mimics+STIM2-O組的細胞凋亡和Caspase-3活性明顯增加(見圖12～圖14,P<0.05);H/R+circRNA-6874 siRNA組、H/R+miR-30a mimics組和H/R+STIM2 siRNA組的細胞凋亡水平和Caspase-3活性回落(P>0.05)。因此,H/R通過circRNA-6874/miR-30a/STIM2而激活凋亡通路,進而促進心肌細胞凋亡。

圖12 TUNEL檢測心肌細胞凋亡水平熒光圖

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖13 TUNEL檢測心肌細胞凋亡水平

與空白對照比較,＊ P<0.05。圖14 熒光酶標儀檢測Caspase-3活性

3 討 論

多種非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)和作用機制的研究表明,其在多種疾病的進展過程中具有重要價值[10]。其中,miRNA是發(fā)現(xiàn)較早且研究較多的非編碼RNA,其在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵的調控作用,并有可能成為疾病的特異性標志物[11-12]。本研究表明,miR-30a在H/R心肌細胞中的表達明顯下調,上調miR-30a的表達會明顯逆轉H/R誘導的心肌細胞損傷、氧化應激和凋亡增加,表明miR-30a是一種心肌保護性miRNA,在心肌損傷過程中具有重要意義。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn),miR-30a在MI/RI小鼠心肌細胞中的表達明顯下調,而丹酚酸B可通過上調miR-30a表達增強細胞存活力、減少LDH釋放和抑制自噬,用miR-30a抑制物下調miR-30a表達可逆轉丹酚酸B抑制MI/RI損傷的作用。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-30a在氧糖剝奪的大腦皮質神經元和大腦中動脈閉塞再灌注的小鼠大腦皮質中的表達明顯下調,其表達增強會抑制自噬和缺血損傷,從而減輕缺血性腦卒中病人的神經細胞死亡。另外,miR-30a可靶向抑制結締組織生長因子(CTGF)的表達而減少心肌梗死后心肌膠原的生成,進而抑制心肌纖維化,從而改善心功能[15]。

本研究結果顯示,miR-30a可靶向抑制STIM2的表達。研究表明,STIM2和STIM1通過促進Ca2+內流而在多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用[16-18]。Tu等[19]在H9c2和原代新生兒心肌細胞中的研究發(fā)現(xiàn),STIM2在MI/RI損傷的細胞中表達上調,抑制STIM2表達會減少內質網鈣釋放和線粒體鈣超載,從而減輕線粒體損傷并維持線粒體功能,最終減少MI/RI損傷誘導的細胞凋亡。同時,在神經系統(tǒng)中的研究也有類似的發(fā)現(xiàn),研究表明,STIM2是缺血誘導神經元胞漿Ca2+積聚所必需的;與野生型對照組比較,STIM2-/-小鼠神經元在缺氧條件下的存活率明顯提高;在體內局灶性腦缺血模型中,STIM2-/-小鼠對神經損傷有明顯的保護作用[20]。上述結果均與本研究結果類似。

circRNA是具有多種調控功能的非編碼RNA[21]。研究表明,circRNA通過多種作用機制在心血管等各種疾病中發(fā)揮重要作用[22]。本研究結果顯示,circRNA-6874在H/R心肌細胞中表達上調,抑制其表達會導致miR-30a表達增強,而STIM2表達抑制,同時減少H/R誘導的心肌細胞損傷和凋亡,表明circRNA-6874/miR-30a/STIM2可能是H/R誘導損傷的一條關鍵通路。Ge等[23]分離檢測MI/RI心臟所釋放的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中circRNA的表達譜,共鑒定出185個明顯差異表達的circRNAs,其中MI/RI組與假手術組比較下調119個、上調66個,揭示了circRNA在假手術和MI/RI心臟組織胞外囊泡中的特異表達模式,為circRNA和胞外囊泡參與MI/RI損傷提供了一些可能的靶點和途徑,為circRNA和胞外囊泡在心臟MI/RI病理過程中的作用提供了重要依據。Hu等[24]研究表明,H/R誘導circSAMD4A水平上調,抑制circSAMD4A表達可減少H/R誘導的細胞凋亡和炎癥反應;circSAMD4A在體內外抑制miR-138-5p的表達,從而促進H/R誘導的心肌細胞損傷。

綜合上述,circRNA-6874/miR-30a/STIM2通路可能通過促進氧化應激和凋亡促進H/R誘導的心肌細胞損傷。