紫蘇提取物的揮發(fā)性成分及抑菌活性研究

周瀟 李康銀 李佳 高偉 楊玉森 李祥睿 李井敏 王遠麗

摘要 紫蘇為我國藥食同源植物及重要芳香經(jīng)濟作物，利用潛力巨大。為研究紫蘇提取物的揮發(fā)性成分及抑菌活性，本研究以新鮮紫蘇不同植物學部位（葉、籽）為原料，采用不同極性的溶劑浸提濃縮制備得到提取物，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS）分析各組分的揮發(fā)性成分，使用濾紙片瓊脂擴散法和二倍微量稀釋法評估不同提取物的抑菌效果。結(jié)果表明：紫蘇各提取組分中共鑒定出55種化合物，紫蘇葉無水乙醇提取物32種、正丁醇提取物20種、乙酸乙酯提取物29種、石油醚提取物19種，紫蘇籽無水乙醇提取物11種、乙酸乙酯提取物7種；紫蘇葉無水乙醇提取物對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強抑菌效果，MIC 16 mg/mL，MBC 16 mg/mL；紫蘇葉乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌具有中等強度的抑菌效果，MIC 64 mg/mL，MBC 128 mg/mL，對大腸桿菌有較弱的抑菌效果，MIC 256 mg/mL，MBC 256 mg/mL，其余提取物組分具有不同程度的抑菌效果。因此，紫蘇不同的植物學部位及提取溶劑極性不同，獲得提取物的揮發(fā)性成分數(shù)量、相對含量及種類均存在差異，各提取組分對革蘭氏陽性菌和陰性菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。該研究旨在對芳香植物紫蘇的進一步研究、開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紫蘇；植物學部位；極性溶劑；揮發(fā)性成分；抑菌活性

中圖分類號 R284. 1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）09-0038-07

Abstract Perilla frutescens is an important "medicinal and edible homologous" plant and an important aromatic cash crop in China. It has great potential for utilization. The volatile components and antibacterial activities of its extracts were studied. In this study， different botanical parts （leaves and seeds） of fresh Perilla frutescens were used as raw materials， and the extracts were prepared by solvent extraction with different polarity and concentration， The volatile components of each component were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The bacteriostatic effects of different extracts were evaluated by filter paper agar diffusion method and double microdilution method. The results showed that 55 compounds were identified from the extracted components of Perilla frutescens， including 32 kinds of absolute ethanol extract， 20 kinds of n-butanol extract， 29 kinds of ethyl acetate extract， 19 kinds of petroleum ether extract from perilla leaves; 11 kinds of absolute ethanol extract and 7 kinds of ethyl acetate extract from perilla seeds; The absolute ethanol extract of perilla leaves showed strong antibacterial effect on Staphylococcus aureus， MIC 16 mg/mL， MBC 16 mg/mL; The ethyl acetate extract of perilla leaves had moderate antibacterial effect on Staphylococcus aureus， MIC 64 mg/mL， MBC 128 mg/ml， and weak antibacterial effect on Escherichia coli， MIC 256 mg/mL， MBC 256 mg/mL; The other extract components have different degrees of antibacterial effects. The above results show that different botanical parts of Perilla frutescens and the polarity of extraction solvent are different， and the quantity， relative content and types of volatile components obtained from the extracts are different. Each component shows different degrees of antibacterial effect on Gram-positive and Gram-negative bacteria. This study aims to provide basis for further research， development and utilization of the aromatic plant Perilla frutescens.

Keywords Perilla frutescens; botanical parts; polar solvent; volatile components; bacteriostatic activity

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt]，又名引子、蘇子、白蘇、蘇麻、香蘇、蘇草及桂芢等，唇形科紫蘇屬一年生草本植物。紫蘇既是藥食同源植物，也是我國重要的芳香經(jīng)濟作物[1-2]。據(jù)《中國藥典》記載，紫蘇葉具有解表散寒、行氣和胃之功效，可用于治療風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒等[3-5]。

紫蘇起源于我國長江中下游流域，中國、韓國及緬甸地區(qū)為紫蘇遺傳多樣性保持較豐富的區(qū)域，在我國主要集中分布在云南、甘肅、四川和貴州等地區(qū)[6-8]。紫蘇葉中揮發(fā)性成分為單萜類、倍半萜類、苯丙素類和呋喃酮類物質(zhì)，揮發(fā)性成分具有抗氧化、抗癌、消炎、抑菌、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、止嘔、解熱、舒張血管等功效[9]。李慧琳等[10]采用水蒸氣蒸餾法，分析了貴州不同香型紫蘇揮發(fā)油成分；王健等[11]采用同時蒸餾萃取法提取紫蘇不同部位精油，進一步研究體外抗氧化活性；王晴藝和金荷仙[12]發(fā)現(xiàn)紫蘇植株香氣可以使人精神放松并減少消極情緒；袁康等[13]研究了紫蘇精油對稻谷中灰綠曲霉的最小抑制濃度和最小殺菌濃度；袁蓮蓮等[14]研究了紫蘇乙醇粗提取物對煙蚜的生物控制作用；朱雙全[15]對紫蘇化學成分及藥理學研究進展進行了綜述。目前，對芳香植物紫蘇不同植物學部位，采用不同極性的溶劑浸提濃縮制備得到提取物進一步分析其揮發(fā)性成分和抑菌活性等研究鮮見報道。為此，本研究以新鮮紫蘇的葉、籽為原料，采用極性大小不同的溶劑進行提取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS）分析提取物的揮發(fā)性成分并進一步考察不同極性溶劑的提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌活性，旨在改善目前紫蘇利用過程中科技附加值及競爭力低等問題，同時為紫蘇及提取物作為載體的功能性日化產(chǎn)品、保健食品開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉、籽為市售新鮮樣品，經(jīng)王遠麗副教授鑒定為紫蘇［Perilla frutescens （Linn.） Britt.］；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）購自北京保藏生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；吐溫80、二氯甲烷、無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚（分析純），購自四川西隴科學有限公司；無水硫酸鈉（分析純），購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

R-220SE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi公司）；BG-50隔水式培養(yǎng)箱（上海博迅）；GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅）；KT-60A上下立式搖床（中貝儀器）；ZL220.4電子天平，（感量0.000 1 g）（上海贊維）；7890B/5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 紫蘇提取物的制備。新鮮紫蘇的葉、籽，剔除異物及病變部分，葉切段（長1～3 cm），使用無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚4種極性溶劑，按固液質(zhì)量比為1∶12浸提12 h，期間人工間歇式攪拌，提取后固渣棄之，提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55 ℃及100 mbar條件下減壓濃縮，分別獲得紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫蘇籽使用無水乙醇、乙酸乙酯2種極性溶劑，以同樣處理方式制備得到紫蘇籽無水乙醇提取物（B1）和乙酸乙酯提取物（B2）。無水硫酸鈉對各組分脫水干燥后，各取0.1 g使用二氯甲烷定容至10 mL容量瓶中，超聲混勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，供GC-MS分析用[16]。

1.3.2 GC-MS條件。色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃。程序升溫：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至260 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。進樣方式為分流進樣，分流比為10∶1，進樣體積為1 μL。離子源為EI，電離能70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度260 ℃。檢測模式為全離子掃描監(jiān)測，質(zhì)量掃描范圍：33～550 amu，溶劑延遲3.5 min。根據(jù)NIST11譜庫檢索，取正、反匹配度≥800的鑒定結(jié)果，以面積歸一化法計算揮發(fā)油各組分的相對含量。

1.3.3 菌懸液制備。冰箱中取出菌株，無菌操作下將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）接種于LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h 條件下連續(xù)活化2次后，挑取少量菌落用無菌生理鹽水制成菌體濃度為1×107 cfu/mL的菌懸液待用[16]。

1.3.4 紫蘇提取物的抑菌活性。利用濾紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑（Diameter of inhibition zone，DIZ），分別吸取濃度約1×107 cfu/mL的4種細菌菌懸液各100 μL，在肉湯培養(yǎng)基LB固體平板上均勻涂布，并放置無菌濾紙片（直徑6 mm），分別滴加10 μL紫蘇葉提取物組分（A2～A5）及紫蘇籽提取物組分（B1～B2），以10 μg/disc氨芐青霉素為陽性對照，以滴加10 μL無菌水的無菌濾紙片為陰性對照；37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑。上述每個樣品重復3次，取平均值[17-18]。

采用2倍微量稀釋法測定紫蘇葉提取物組分（A2～A5）和紫蘇籽提取物組分（B1～B2）的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）與最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。96孔板中依次加入紫蘇葉提取物組分（A2～A5）和紫蘇籽提取物組分（B1～B2），使其樣品濃度梯度為512.00、256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL（含2%的吐溫80），然后每孔依次加入濃度約1×107 cfu/mL的各菌懸液100 μL，每個梯度重復3次，2%吐溫80溶液為陰性對照，氨芐青霉素為陽性對照，體系置于37 ℃條件培養(yǎng)24 h后，若培養(yǎng)孔內(nèi)無渾濁，則判斷該樣品的濃度為MIC。從無菌生長的孔中吸取100 μL溶液接種于LB固體平板上，涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，完全無菌落生長的最低濃度為MBC[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇各組分的揮發(fā)性成分

按照1.3.2的分析方法對紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫蘇籽無水乙醇提取物B1和乙酸乙酯提取物B2組分進行GC-MS分析，共檢索出55種化合物，其總離子流見圖1，分析結(jié)果見表1。

由圖1和表1得出，紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）共檢測出32種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為97.64%；其中，揮發(fā)性成分中特有成分10種，分別為1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇乙酸酯、（4-丙-1-烯-2-基環(huán)己基）甲醇、1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亞基-2-丙-1-烯-2-基環(huán)己烷、3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯、甲基（6E，9E，12E，15E）-6，9，12，15-二十二四烯酸酯、甘油亞麻酸酯、2-單棕櫚酸甘油、（9Z，12Z）-9，12-十八碳二烯酸2，3-二羥基丙基酯、亞麻酸、烏宋酸甲酯。

紫蘇葉正丁醇提取物（A3）共檢測出20種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為94.38%；其中揮發(fā)性成分中特有成分6種，分別為異丁酸丁酯、丁酸異丁酯、丁酸丁酯、1-丁氧基-1-異丁氧基丁烷、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、2-十八烯酸單甘油酯。

紫蘇葉乙酸乙酯提取物（A4）共檢測出29種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為98.90%；其中揮發(fā)性成分中特有成分9種，分別為乙酸丁酯、苯甲醛、2-亞乙基-6-甲基庚-3，5-二烯醛、香茅醇、順式-檸檬醛、7-（甲基乙亞基）-雙環(huán)[4.1.0]庚烷、4-（1-甲基乙烯基）-1-環(huán)己烯-1-甲醇乙酸酯、畢澄茄烯、反式橙花醇。

紫蘇葉石油醚提取物（A5）共檢測出19種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為98.64%；其中揮發(fā)性成分中特有成分2種，分別為十二烷和丁香酚。

紫蘇籽無水乙醇提取物（B1）共檢測出11種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為98.59%；揮發(fā)性成分中特有成分為甘油亞麻酸酯；紫蘇籽乙酸乙酯提取物（B2）共檢測出7種揮發(fā)性香氣成分，總相對含量為95.47%。

2.2 紫蘇各組分的抑菌活性

按照1.3.4的分析方法對紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）、正丁醇提取物（A3）、乙酸乙酯提取物（A4）、石油醚提取物（A5）；紫蘇籽無水乙醇提取物（B1）和乙酸乙酯提取物（B2）組分進行DIZ檢測，結(jié)果見圖2。

由圖2得出，紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌效果；紫蘇葉正丁醇提取物（A3）對大腸桿菌具有抑菌效果；紫蘇葉乙酸乙酯提取物（A4）對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑菌效果；紫蘇葉石油醚提取物（A5）對枯草芽孢桿菌具有抑菌效果；紫蘇籽無水乙醇提取物（B1）對供試菌株均無抑菌效果；紫蘇籽乙酸乙酯提取物（B2）對枯草芽孢桿菌具有抑菌效果。

2.3 紫蘇各組分的MIC及MBC檢測

按照1.3.4的分析方法對供試菌株具有抑菌作用的提取物組分，進一步進行MIC及MBC檢測，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

將新鮮的紫蘇葉、籽采用不同極性的溶劑進行浸提并進一步減壓濃縮制備得到各提取物組分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS）進行各組分的揮發(fā)性成分分析，共檢測出55種化合物，其中紫蘇葉無水乙醇提取物檢測出32種、正丁醇提取物檢測出20種、乙酸乙酯提取物檢測出29種、石油醚提取物檢測出19種；紫蘇籽無水乙醇提取物（B1）檢測出11種、乙酸乙酯提取物（B2）檢測出7種。

紫蘇不同的植物學部位及提取溶劑極性不同，獲得的提取物揮發(fā)性成分的數(shù)量、相對含量及種類均存在差異；紫蘇葉提取物和紫蘇籽的提取物，揮發(fā)性化合物差異較大，相同溶劑提取時，紫蘇籽提取物較紫蘇葉提取物揮發(fā)性強的小分子物質(zhì)較少，主要集中在揮發(fā)性較弱的大分子物質(zhì)。各提取物組分中，檢測出共有化合物2種，分別為（-）-反式石竹烯、（Z，E）-α-法尼烯；紫蘇葉各提取物組分中均檢測出反-薄荷烯醇、紫蘇醛、紫蘇醇、α-廣藿香烯、葉綠醇-1和葉綠醇-2，但在紫蘇籽提取物中未被發(fā)現(xiàn)；而紫蘇籽提取物中檢測出的2-己?；秽?、角鯊烯、3，4-二氫-2，7，8-三甲基-2-（4，8，12-三甲基十三烷）-2H-1-苯并吡喃-6-醇在紫蘇葉提取物中未被檢測出。

紫蘇各提取物組分對革蘭氏陽性菌和陰性菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。紫蘇葉無水乙醇提取物（A2）金黃色葡萄球菌DIZ檢測中表現(xiàn)出較強抑菌效果，進一步檢測MIC為16 mg/mL，MBC為16 mg/mL；紫蘇葉正丁醇提取物（A3）對大腸桿菌具有中等強度的抑菌效果，MIC為128 mg/mL，MBC為128 mg/mL；紫蘇葉乙酸乙酯提取物（A4）金黃色葡萄球菌具有中等強度的抑菌效果，MIC為64 mg/mL，MBC為128 mg/mL，對大腸桿菌的同樣具有較弱的抑菌效果，MIC為256 mg/mL，MBC為256 mg/mL；紫蘇葉石油醚提取物（A5）對枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌效果，MIC為256 mg/mL，MBC為256 mg/mL；紫蘇籽乙酸乙酯提取物（B2）對枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌效果，MIC為128 mg/mL，MBC為256 mg/mL。

目前，我國對紫蘇資源的利用還不夠充分，產(chǎn)業(yè)化進程還不夠完善，對紫蘇的利用大多以簡單食用為主或直接進行原料低價銷售，未形成高附加值的功能型產(chǎn)品研發(fā)—生產(chǎn)—銷售完整的產(chǎn)業(yè)鏈。因此，亟待對紫蘇進行不同提取技術(shù)及工藝系統(tǒng)性的研究，以滿足當前我國功能性食品及增香增色、防腐抗菌等日化品的開發(fā)需求。本研究為紫蘇及提取物為載體的產(chǎn)品設計與開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 嚴興初. 蘇子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[2] 譚美蓮，嚴明芳，汪磊，等. 國內(nèi)外紫蘇研究進展概述[J]. 中國油料作物學報，2012，34（2）：225-230.

[3] 于占洋，蘇中武. 紫蘇屬植物的研究及其新進展[J]. 國外醫(yī)學：藥學分冊，1986，13（3）：173-177.

[4] 李英霞，彭廣芳. 紫蘇子的本草考證[J]. 中醫(yī)藥研究，1996（3）：60-61.

[5] 劉大川，王靜，蘇望懿，等. 紫蘇的開發(fā)研究及進展[J]. 武漢工業(yè)學院學報，2000（4）：1-3.

[6] 郭鳳根，陳娟，王仕玉，等. 云南紫蘇資源的酯酶同工酶分析[J]. 中國農(nóng)學通報，2005，21（5）：101-103.

[7] 張旭，吳衛(wèi)，鄭有良，等. 紫蘇屬植物染色體數(shù)目和核型分析[J]. 西北植物學報，2008，28（10）：1972-1977.

[8] 王仙萍，李敏，張敏琴，等. 貴州紫蘇資源收集以及葉色多樣性分析[J]. 中國農(nóng)學通報，2013，29（10）：132-136.

[9] 胡曉丹，孫愛東，張德權(quán). 高速逆流色譜分離紫蘇葉花色素苷的研究[J]. 中藥材，2010，29（10）：1586-1588.

[10] 李慧琳，奉斌，于二汝，等. 貴州不同香型紫蘇揮發(fā)油成分分析與評價[J]. 植物遺傳資源學報，2020，21（1）：269-274.

[11] 王健，薛山，趙國華. 紫蘇不同部位精油成分及體外抗氧化能力的比較研究[J]. 食品科學，2013，34（7）：86-91.

[12] 王晴藝，金荷仙. 紫蘇植株香氣對人體生理和心理健康的影響[J]. 浙江林業(yè)科技，2021，41（1）：98-102.

[13] 袁康，胡振陽，陳可欣，等. 紫蘇精油抑制灰綠曲霉的活性與機理[J]. 食品科學，2020，41（23）：63-69.

[14] 袁蓮蓮，王耀鋒，靳志偉，等. 紫蘇乙醇粗提取物對煙蚜的生物控制作用[J]. 中國煙草科學，2016（2）：11-15.

[15] 朱雙全. 紫蘇化學成分及藥理學研究進展概要[J]. 生物化工. 2018（2）：148-149.

[16] 王思思，王斌，廖陽，等. 永州薄荷精油成分分析及其與異蛇蛇蛻浸液復配劑抑菌效果研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2020（9）：1545-1551.

[17] 楊翠云，安馨，萬晶瓊，等. 不同化學型薄荷揮發(fā)油抗菌和抗氧化活性研究[J]. 食品科技，2021（1）：185-192.

[18] WANG F，WEI F Y，SONG C X，et al. Dodartia orientalis L. essential oil exerts antibacterial activity by mechanisms of disrupting cell structure and resisting biofilm[J]. Industrial Crops and Products，2017，109：358-366.

（責編：何 艷）

基金項目 云南省教育廳科學研究基金項目資助（2022J1607）；玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院藥食同源產(chǎn)品研發(fā)中心（2021YZ05）。

作者簡介 周瀟（1987—），男，碩士，工程師。研究方向：植物提取技術(shù)及工藝、植物保護、煙用及日化香精香料應用。