迷迭香酸及咖啡酸的ESI 四級桿飛行時間高分辨質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

劉靜，霍志鵬，田介峰，何毅，于治國

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司研究院 現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410；3.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司 創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

迷迭香酸（Rosmarinic acid，分子式C18H16O8）是一種含多酚羥基的酸，由咖啡酸（Caffeic acid，分子式C9H8O4）和丹參素（Danshensu，分子式C9H10O5）縮合產(chǎn)生，在自然界中分布廣泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中。迷迭香酸、咖啡酸有著多方面的生物活性，如強抗氧化性、腦神經(jīng)保護活性、抗血栓活性、抑菌抗病毒活性、抗炎和免疫抑制活性等[1-2]。液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-Q-TOF-MS）是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中最具代表性的方法之一，具有高分辨率、高選擇性等特點；目前最常用的離子源為電噴霧（ESI）源，ESI 源是軟電離質(zhì)譜技術(shù)，通?？傻玫綔史肿与x子峰。Q-TOF-MS 可以提供精確質(zhì)量數(shù)，同時多級質(zhì)譜能提供較為豐富的碎片離子信息，在化合物的定性檢測中起到越發(fā)重要的作用[3]。近年來有多篇文獻采用LC-Q-TOF-MS 的方法對復(fù)雜組分中的咖啡酸、迷迭香酸進行定性鑒別以及含量測定[4-5]，但并未對其質(zhì)譜行為做全面考察，本實驗在UPLCQ-TOF-MS 二級質(zhì)譜（MS2）模式下，通過設(shè)置不同的碰撞能量觀察咖啡酸以及迷迭香酸形成的各種碎片離子，總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律。結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1 咖啡酸（Caffeic acid）、迷迭香酸（Rosmarinic acid）結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structures of caffeic acid and rosmarinic acid

實驗部分

1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Synapt G2 Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Waters 公司）；MassLynx V4.1 質(zhì)譜工作站（美國 Waters 公司）。

乙腈（質(zhì)譜級，德國默克公司）；超純水（杭州娃哈哈集團有限公司）；甲酸（質(zhì)譜級，東京化成工業(yè)株式會社（TCI））；甲醇（色譜級，德國默克公司）；迷迭香酸（純度96%，美國 Sigma 公司）；咖啡酸（純度98.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液制備

準確稱取迷迭香酸10 mg 置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為100 μg/mL 的迷迭香酸溶液。

準確稱取咖啡酸10 mg 置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為100 μg/mL 的咖啡酸溶液。

2.2 質(zhì)譜分析條件

自動進樣器進樣，在流動相中通過雙通導(dǎo)入離子源。流動相為0.1%甲酸水（A），乙腈（B），等度洗脫0～ 1 min，6%（B），流速0.4 mL/min，進樣量2 μL。

電噴霧電離離子源（ESI），掃描范圍m/z為 50～ 1 000，負離子模式檢測：毛細管電壓為2.5 kV（ESI-），錐孔電壓40 V，提取錐孔電壓 5 V，離子源溫度為 110 ℃，脫溶劑溫度為 350 ℃，脫溶劑氣體（氮氣）流速為 800 L·h-1，錐孔氣流量 50 L·h-1；氬氣為碰撞氣，準確質(zhì)量數(shù)用亮氨酸腦啡肽作校正液，質(zhì)核比為m/z554.261 5（ESI-）?？Х人岫壻|(zhì)譜實驗?zāi)鸽x子為179.03 Da，碰撞電壓為0～ 40 eV，依次遞增5 eV；迷迭香酸二級質(zhì)譜實驗?zāi)鸽x子為359.07 Da，碰撞電壓為0～ 40 eV，依次遞增5 eV。

3 結(jié)果與討論

3.1 咖啡酸二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析及裂解規(guī)律

咖啡酸的碎片離子強度曲線見圖2。負離子模式下咖啡酸的準分子離子峰為m/z179.03，二級質(zhì)譜碰撞電壓為0～ 10 eV 范圍內(nèi)，咖啡酸主要形成準分子離子以及m/z135.04 碎片離子。隨著碰撞電壓升高，m/ z135.04 碎片離子相對豐度逐漸增大，在碰撞電壓為15～ 30 eV 范圍內(nèi)，m/z135.04 碎片離子相對豐度達到100%，準分子離子m/z179.03 相對豐度逐漸降低至0。該范圍內(nèi)可觀察到m/z134.03、m/z133.02、m/z117.03、m/z108.02 碎片離子出現(xiàn)，其相對豐度也隨碰撞電壓的增大而增大。在碰撞電壓為35～ 40 eV時，m/z134.03 碎片離子成為基峰。

圖2 碰撞能0～ 40 eV 下咖啡酸的碎片離子強度曲線Fig.2 Breakdown curves of caffeic acid (collision energy 0-40 eV)

根據(jù)質(zhì)譜裂解特征，推測的咖啡酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律如圖3。在負離子模式下咖啡酸的準分子離子峰為m/z179.03，低碰撞能下主要脫去羧基形成m/z135.04 碎片離子。隨著碰撞電壓升高，m/z135.04 一方面脫去一分子水形成m/z117.02 碎片離子；另一方面發(fā)生O-H 共價鍵均裂生成m/z134.03 的自由基離子，該自由基離子可在高碰撞能下繼續(xù)裂解，其裂解途徑有三種：（1）失去氫自由基形成m/z133.02 碎片離子；（2）丟失乙烯基側(cè)鏈形成m/z108.02 碎片離子；（3）丟失CO 碎片形成m/z106.04 碎片離子[6]。結(jié)合圖1可推斷出m/z135.04碎片離子結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在碎裂過程中優(yōu)先失去氫自由基。m/z134.03 碎片離子裂解途徑1、2 所需要的能量相當，幾乎同時進行，途徑3 需在高碰撞能下才能發(fā)生。圖4～5 為不同碰撞能下的咖啡酸二級質(zhì)譜。

圖3 咖啡酸可能的裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathway of caffeic acid

圖4 咖啡酸二級質(zhì)譜（碰撞能20 eV）Fig.4 Secondary mass spectrum of caffeic acid（collision energy 20 eV）

圖5 咖啡酸二級質(zhì)譜（碰撞能40 eV）Fig.5 Secondary mass spectrum of caffeic acid（collision energy 40 eV）

3.2 迷迭香酸二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析及裂解規(guī)律

迷迭香酸的碎片離子強度曲線見圖6。負離子模式下迷迭香酸的準分子離子峰為m/z359.07，二級質(zhì)譜碰撞電壓為0～ 10 eV 范圍內(nèi)，迷迭香酸主要形成準分子離子、m/z197.04、m/z179.03、m/z161.02碎片離子。隨著碰撞電壓升高，m/z161.02 碎片離子相對豐度逐漸增大，在碰撞電壓為15～ 35 eV 范圍內(nèi)，m/z161.02 碎片離子相對豐度達到100%，準分子離子峰m/z359.07 在25eV 電壓下相對豐度降低至0；該范圍內(nèi)可觀察到m/z135.04、m/z133.02、m/z123.02 碎片離子出現(xiàn)，其相對豐度也隨著碰撞電壓的增大而增大。m/z197.04、m/z179.03 碎片離子在20～ 35 eV 時，相對豐度逐漸下降，推測這兩種離子碎片在高能條件下裂解形成其他離子碎片。

圖6 碰撞能0～ 40 eV 下迷迭香酸的碎片離子強度曲線Fig.6 Breakdown curves of rosmarinic acid (collision energy 0-40 eV)

迷迭香酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律為低碰撞能下迷迭香酸即可形成m/z161.02 以及m/z197.02、m/z179.03離子碎片。如圖7 所示迷迭香酸可在酯鍵b 處斷裂，脫去分子式為C9H8O4的中性分子，形成m/z179.034 9 的咖啡酸離子碎片；也可在酯鍵a 處斷裂形成m/z197.04 的丹參素離子碎片。關(guān)于碎片m/z161.02 的形成，一些文獻給出了不同的解釋：有文獻認為m/z161.02 可由m/z179.03 的咖啡酸離子碎片脫去一分子水形成[7-8]，還有文獻認為該碎片為酯鍵a斷裂形成的產(chǎn)物[9]；根據(jù)前文咖啡酸的二級質(zhì)譜中并未發(fā)現(xiàn)m/z161.02 的碎片離子，因此該碎片離子更有可能為酯鍵斷裂形成的產(chǎn)物。根據(jù)圖5，m/z161.02、m/z197.04 相對豐度遠大于m/z179.03，說明酯鍵a處較b 處更容易斷裂，原因有兩方面：一是羥基的電負性強于羰基，故丹參素羥基奪質(zhì)子的能力強于咖啡酰基[10]；二是a 處斷裂形成的m/z161.02 在15～ 40 eV 下相對豐度最高，可見其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好，推測羰基碳進攻苯環(huán)形成穩(wěn)定五元環(huán)結(jié)構(gòu)。碎片m/z133.02可通過兩個途徑形成，一是m/z161.02 脫去CO 形成，二是m/z179.03 即咖啡酸碎片離子脫羧基后又脫去兩個氫自由基形成，碰撞能35 eV 時，迷迭香酸二級質(zhì)譜中m/z133.02 相對豐度（46.98%）要比咖啡酸二級質(zhì)譜中m/z133.02 相對豐度（9.93%）大得多，可見迷迭香酸中m/z133.02 主要由m/z161.02 產(chǎn)生，除此之外咖啡酸碎片的裂解途徑與前文3.1 部分裂解途徑相同。丹參素碎片離子也可進一步裂解：通過CH（OH）COOH 部分與母環(huán)芐基碳碎裂形成碎片m/z123.04、m/z72.99[11]；或脫去一分子水形成咖啡酸離子碎片（m/ z179.03）；也能通過丟失CH2O2碎片形成m/z151.04 碎片離子，其中m/z72.99 碎片離子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的頻率較低。圖8～9為不同碰撞能下的迷迭香酸二級質(zhì)譜。

圖7 迷迭香酸可能的裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathway of rosmarinic acid

圖8 迷迭香酸二級質(zhì)譜（碰撞能20 eV）Fig.8 Secondary mass spectrum of rosmarinic acid（collision energy 20 eV）

圖9 迷迭香酸二級質(zhì)譜（碰撞能40 eV）Fig.9 Secondary mass spectrum of rosmarinic acid（collision energy 40 eV）

4 結(jié)論

通過使用高分辨質(zhì)譜對迷迭香酸和咖啡酸可能的裂解規(guī)律進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物在負離子模式下有較好的響應(yīng)?？Х人岷恤然?，在質(zhì)譜裂解中極易脫去一分子CO2產(chǎn)生m/z135.04 碎片離子，高碰撞能下可繼續(xù)裂解脫去水分子或氫自由基。迷迭香酸作為丹參素與咖啡酸的聚合物，在質(zhì)譜裂解中可觀察到丹參素和咖啡酸的準分子離子，隨著碰撞能的加大，這兩種離子碎片還可以繼續(xù)裂解，通過與咖啡酸裂解碎片比對，丹參素部分裂解產(chǎn)生m/ z123.04、m/ z72.99；酯鍵兩種斷裂方式分別產(chǎn)生m/ z161.02、m/z179.03 與m/z197.04 碎片離子，為迷迭香酸的特征碎片離子。本研究使用Q-TOF-MS 法研究迷迭香酸和咖啡酸質(zhì)譜行為，以二級質(zhì)譜碰撞能為橫坐標，碎片離子相對豐度為縱坐標繪制離子強度曲線圖，觀察離子碎片在不同碰撞能下的動態(tài)變化有助于推測斷裂發(fā)生的位置，從而更詳盡地了解分子結(jié)構(gòu)與裂解途徑間的關(guān)系。