TGF?β1調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機(jī)制

孫梓越，錢力，李丹，朱瑞芳，韓永康，劉學(xué)軍*

·科研論著·

TGF?β1調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機(jī)制

孫梓越1，錢力2，李丹2，朱瑞芳2，韓永康1，劉學(xué)軍2*

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞A549觀察脫氧核糖核酸（DNA）甲基化酶和端粒酶的變化。采用TGF?β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞建立體外肺纖維化模型，分為對(duì)照組、TGF?β12 μmol/L干預(yù)組、TGF?β15 μmol/L干預(yù)組和TGF?β110 μmol/L干預(yù)組。采用β?gal染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老程度；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法和逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT?qPCR）檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6表達(dá)變化；RT?qPCR檢測(cè)I型膠原蛋白（COL?I）、纖維連接蛋白1（FN1）、張力蛋白C（Tensin?C）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNM）T3a、DNMT3b、鈣黏蛋白（CDH1）及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)。對(duì)照組幾乎未見(jiàn)衰老細(xì)胞，干預(yù)組細(xì)胞衰老程度隨TGF?β1濃度升高而增加；TGF?β1干預(yù)組白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6含量明顯升高（<0.05）；對(duì)照組A549細(xì)胞形態(tài)呈典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，TGF?β1干預(yù)組出現(xiàn)典型的間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，Masson染色結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞幾乎未見(jiàn)藍(lán)色膠原蛋白，而TGF?β1干預(yù)組藍(lán)染膠原蛋白表達(dá)明顯增多，發(fā)生纖維化改變；TGF?β1干預(yù)組與對(duì)照組比較，COL?I、FN1、Tensin?C、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)明顯升高（<0.05），端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和CDH1基因mRNA的表達(dá)降低（<0.05），Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)降低（<0.05）。TGF?β1導(dǎo)致A549細(xì)胞發(fā)生衰老，并促進(jìn)炎癥因子和致纖維化因子高表達(dá)發(fā)生纖維化改變；TGF?β1促進(jìn)了DNA甲基化酶的表達(dá)，抑制了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。

特發(fā)性肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1；A549細(xì)胞；脫氧核糖核酸甲基化；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種與衰老相關(guān)的慢性進(jìn)展性間質(zhì)性肺疾病[1]，好發(fā)于老年男性，確診后中位生存期為3～5年[2]。特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏有效的治療手段。近年來(lái),隨著藥食同源理論的快速發(fā)展，關(guān)于食療在治療慢性病方面的研究日益成為熱點(diǎn)，多種研究發(fā)現(xiàn)槲皮素(quercetin，QUE)可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1)誘導(dǎo)的A549細(xì)胞進(jìn)行間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕肺纖維化小鼠的炎癥反應(yīng)[3?6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥通過(guò)作用于脫氧核糖核酸（DNA）甲基化、miRNA表達(dá)調(diào)控和組蛋白修飾等方面在特發(fā)性肺纖維化形成和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]，但具體機(jī)制尚未得到充分研究。已有研究證實(shí)，特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與端粒變短、端粒酶活性改變、DNA甲基化等表觀遺傳改變相關(guān)，而TGF?β1作為致纖維化因子在特發(fā)性肺纖維化形成中發(fā)揮重要作用。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNM）T3a、DNMT3b分別被認(rèn)為是端粒酶活性及DNA甲基化的關(guān)鍵因子，反映端粒酶活性及DNA甲基化水平。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DNMT3a、DNMT3b、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)變化在肺纖維化小鼠中與年齡因素相關(guān)[8?9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TGF?β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）構(gòu)建體外肺纖維化模型，分析A549細(xì)胞纖維化表型改變及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、DNMT3a、DNMT3b表達(dá)變化，以闡明TGF?β1與端粒酶活性及DNA甲基化的作用關(guān)系，旨在探討TGF?β1與端粒酶活性和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系，闡述其在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用，同時(shí)也為藥食同源理論治療肺纖維化提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1主要試劑A549細(xì)胞（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM?F12、trypsin/EDTA、RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、白細(xì)胞介素?1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素?6 ELISA試劑盒（美國(guó) Invitrogen公司）；β?半乳糖苷酶原位染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒（北京聚合美）；Masson染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、凝膠制備試劑盒、彩色預(yù)染蛋白marker（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體（美國(guó)abcam公司）；羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Sigma公司）；PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞復(fù)蘇后加入90%高糖培養(yǎng)液（DMEM)?F12+10%胎牛血清蛋白（FBS），在37 ℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。通過(guò)加入TGF?β1干預(yù)7 d后建立肺上皮細(xì)胞復(fù)制性衰老模型分組進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h；TGF?β1干預(yù)組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下，給予不同濃度TGF?β1（分別為2 μmol/L、5 μmol/L及10 μmol/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.3β?gal染色法通過(guò)β?gal染色法檢測(cè)TGF?β1梯度刺激對(duì)A549細(xì)胞衰老的影響。取對(duì)照組、TGF?β12 μmol/L干預(yù)組、TGF?β15 μmol/L干預(yù)組及TGF?β110 μmol/L干預(yù)組各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后可以使用β?半乳糖苷酶原位染色試劑盒對(duì)正常對(duì)照組及TGF?β1干預(yù)組進(jìn)行原位染色，將各組細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察藍(lán)綠熒光蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，檢測(cè)β?半乳糖苷酶的表達(dá)。

1.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子通過(guò)ELISA法檢測(cè)TGF?β1梯度刺激對(duì)A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6蛋白表達(dá)的影響。收集對(duì)照組、TGF?β12 μmol/L干預(yù)組、TGF?β15 μmol/L干預(yù)組及TGF?β110 μmol/L干預(yù)組各組細(xì)胞，加入60 μL放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液，在4 ℃裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃，離心10 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度，用RIPA裂解液調(diào)整樣本蛋白濃度至5 μg/μL。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，配制標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過(guò)加樣、孵育、清洗、顯色、終止等過(guò)程，利用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的OD值。

1.5逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real?time Quantitative PCR，RT?qPCR）利用RT?qPCR檢測(cè)TGF?β1對(duì)A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6、I型膠原蛋白（COL?I）、纖維連接蛋白（FN1）、張力蛋白C（Tensin?C）、DNMT3a、DNMT3b、鈣黏蛋白1（CDH1）及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)的影響。首先檢測(cè)TGF?β1梯度刺激對(duì)A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6 mRNA表達(dá)的影響，取對(duì)照組、TGF?β12 μmol/L干預(yù)組、TGF?β15 μmol/L干預(yù)組及TGF?β110 μmol/L干預(yù)組各組細(xì)胞，用Trizol法提取核糖核酸（RNA），根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明將RNA合成cDNA，采用2X M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒進(jìn)行RT?qPCR，結(jié)果采用相對(duì)定量法，以2?△△Ｃt表示基因的相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取對(duì)照組細(xì)胞和TGF?β110 μmol/L干預(yù)組細(xì)胞檢測(cè)COL?I、FN1、Tensin?C、DNMT3a、DNMT3b、CDH1及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)方法采用RT?qPCR。mRNA引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列

1.6Masson染色取對(duì)照組細(xì)胞和TGF?β110 μmol/L干預(yù)組細(xì)胞，用4%多聚甲醛細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30 min后，PBS清洗3次，每次10 min。按Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，封片，顯微鏡下觀察，藍(lán)色為膠原蛋白，通過(guò)軟件Image Pro Plus計(jì)算。

1.7蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)取對(duì)照組細(xì)胞和TGF?β110 μmol/L干預(yù)組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，隨后加入一抗（GAPDH 1∶5 000，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶1∶2 500），4 ℃過(guò)夜。次日洗膜3次，加入羊抗兔IgG二抗（1∶8 000），室溫孵育2 h，再次洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒顯色。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK檢驗(yàn)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1β?gal染色法檢測(cè)TGF?β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生衰老的程度從對(duì)照組、TGF?β12 μmol/L干預(yù)組、TGF?β15 μmol/L干預(yù)組及TGF?β110 μmol/L干預(yù)組各組細(xì)胞的β?gal染色可以看出，對(duì)照組幾乎未出現(xiàn)衰老細(xì)胞，而TGF?β1干預(yù)組隨著TGF?β1濃度的不斷升高，衰老細(xì)胞越多，詳見(jiàn)圖1。各組細(xì)胞衰老細(xì)胞百分比隨TGF?β1濃度升高而升高，詳見(jiàn)表2。

圖1　β?gal染色圖（A為對(duì)照組，B為TGF?β1 2 μmol/L干預(yù)組，C為TGF?β1 5 μmol/L干預(yù)組，D為TGF?β1 10 μmol/L干預(yù)組）

表2　β?gal染色法檢測(cè)各組衰老細(xì)胞陽(yáng)性率

① 與對(duì)照組比較，<0.05。

2.2ELISA法檢測(cè)TGF?β1梯度刺激A549細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6含量的影響隨著TGF?β1濃度的升高，A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6含量也進(jìn)一步升高，而TGF?β15 μmol/L干預(yù)組、TGF?β110 μmol/L干預(yù)組與TGF?β12 μmol/L干預(yù)組比較，A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6含量明顯升高（<0.05），提示TGF?β1促進(jìn)了A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6蛋白的分泌。詳見(jiàn)表3。

表3　各組白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6含量 單位：pg/mL

① 與對(duì)照組比較，<0.05；② 與TGF?β12 μmol/L干預(yù)組比較，<0.05；③ 與TGF?β15 μmol/L干預(yù)組比較，>0.05。

2.3各組細(xì)胞因子、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA檢測(cè)結(jié)果TGF?β1干預(yù)組與對(duì)照組比較，白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6 mRNA表達(dá)明顯升高（<0.05）；TGF?β110 μmol/L干預(yù)組COL?I、FN1、Tensin?C mRNA表達(dá)明顯升高（<0.05）；TGF?β110 μmol/L干預(yù)組DNMT3a和DNMT3b mRNA的表達(dá)明顯升高，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和CDH1基因mRNA的表達(dá)明顯降低（<0.05），詳見(jiàn)表4～表6。

表4　各組白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6 mRNA表達(dá)

① 與對(duì)照組比較，<0.05；② 與TGF?β12 μmol/L干預(yù)組比較，<0.05；③ 與TGF?β15 μmol/L干預(yù)組比較，>0.05。

表5　各組細(xì)胞COL?I、FN1、Tensin?C mRNA表達(dá)

表6　各組細(xì)胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA表達(dá)

2.4TGF?β1誘導(dǎo)前后A549細(xì)胞形態(tài)和膠原蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組細(xì)胞光鏡下為凸角的鋪路石結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間存在連接緊密，呈現(xiàn)上皮細(xì)胞樣形態(tài)；TGF?β110 μmol/L干預(yù)組細(xì)胞多為紡錘形或星形的扁平細(xì)胞樣改變，呈間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，詳見(jiàn)圖2。Masson染色顯示對(duì)照組細(xì)胞幾乎未見(jiàn)膠原蛋白表達(dá)，而TGF?β110 μmol/L干預(yù)組細(xì)胞出現(xiàn)大量藍(lán)染膠原蛋白，其表達(dá)量及表達(dá)范圍均明顯增加，詳見(jiàn)圖3。

圖3　兩組細(xì)胞Masoon染色（×200）（A為對(duì)照組，B為TGF?β1 10 μmol/L干預(yù)組）

2.5Western Blot法檢測(cè)TGF?β1對(duì)A549細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)結(jié)果TGF?β110 μmol/L干預(yù)組與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)明顯降低（<0.05）。提示TGF?β1抑制了A549細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達(dá)。詳見(jiàn)表7、圖4。

表7　各組細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖4　Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白相對(duì)表達(dá)量

（A為條帶圖；B為柱狀圖）

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是不可逆的間質(zhì)性肺病，其病理特征是肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)損傷引起肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）大量沉積，間質(zhì)組織瘢痕形成，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)被破壞，肺功能進(jìn)行性下降[10]。肺組織纖維化重塑的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)動(dòng)態(tài)、協(xié)調(diào)的過(guò)程，與衰老密切相關(guān)[11]。流行病學(xué)顯示，特發(fā)性肺纖維化隨著年齡的增長(zhǎng)，患病率、死亡率逐漸升高[12]。證據(jù)表明，衰老因素參與了特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[13]，包括基因組不穩(wěn)定性、表觀遺傳改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失、線粒體功能障礙、干細(xì)胞衰竭、細(xì)胞間通路改變、端粒縮短等[14?15]。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子?α、白細(xì)胞介素?1β、白細(xì)胞介素?6、白細(xì)胞介素?8等）、趨化因子、生長(zhǎng)因子[成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF），TGF?β1等]、基質(zhì)金屬蛋白酶(如MMP?2、MMP?9等)和白三烯[16]的異常表達(dá)與肺纖維化的形成有密切關(guān)系。其中，TGF?β1是促進(jìn)組織發(fā)生纖維化和細(xì)胞衰老的關(guān)鍵致病因子，能誘導(dǎo)A549細(xì)胞建立肺纖維化模型并發(fā)生復(fù)制性衰老。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在A549細(xì)胞中加入TGF?β1的方式建立肺纖維化衰老模型，探究DNA甲基化和端粒酶的變化。

從β?gal染色結(jié)果可以看出，對(duì)照組幾乎未出現(xiàn)衰老細(xì)胞，而TGF?β1干預(yù)組隨著TGF?β1濃度的不斷升高，衰老細(xì)胞增多，證實(shí)了TGF?β1促進(jìn)了A549細(xì)胞發(fā)生衰老。前期研究表明，TGF?β可以引起白細(xì)胞介素?1β[17]、白細(xì)胞介素?6等炎性衰老因子水平的升高[16]，導(dǎo)致高促炎癥反應(yīng)狀態(tài)，也進(jìn)一步加速特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素?1β和白細(xì)胞介素?6在肺纖維化復(fù)制性衰老模型中顯著增加，證實(shí)TGF?β1明顯促進(jìn)了A549細(xì)胞白細(xì)胞介素?1β和白細(xì)胞介素?6和mRNA的表達(dá)，也證實(shí)炎癥因子在細(xì)胞衰老中起重要作用。從結(jié)果可以看出TGF?β15 μmol/L干預(yù)組與TGF?β110 μmol/L干預(yù)組作用相當(dāng)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇TGF?β110 μmol/L干預(yù)組與對(duì)照組進(jìn)行研究和結(jié)果比較。

通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)和Masson染色可以看到TGF?β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的纖維化改變，也與前期實(shí)驗(yàn)中肺纖維化小鼠肺組織膠原表達(dá)增多的結(jié)果相一致。COL?I、FN1、Tensin?C也被認(rèn)為是纖維化形成的表型[18]。本研究結(jié)果顯示，TGF?β1干預(yù)組A549細(xì)胞COL?I、FN1、Tensin?C表達(dá)明顯升高，可以認(rèn)為TGF?β1促進(jìn)了A549細(xì)胞COL?I、FN1、Tensin?C的表達(dá)，加速了A549細(xì)胞纖維化進(jìn)程。證明了TGF?β1是強(qiáng)大的致纖維化因子，可以改變A549細(xì)胞形態(tài)變化，增強(qiáng)膠原蛋白的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞復(fù)制性衰老與端粒縮短有關(guān)，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，包括調(diào)節(jié)亞基、端粒酶RNA成分(TERC)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，其在維持端粒長(zhǎng)度上發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。其中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是人端粒酶活性調(diào)節(jié)的一個(gè)主要機(jī)制，可反映端粒酶活性。端粒酶相關(guān)基因突變約占家族性肺纖維化（FPF）病例總數(shù)的25%，在散發(fā)性特發(fā)性肺纖維化中占1%～3%[20?21]。Naikawadi等[22]在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TRFl缺失會(huì)導(dǎo)致端?？s短和肺重構(gòu)，主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚、間質(zhì)膠原纖維沉積、羥脯氨酸含量增加及β半乳糖苷酶累積。據(jù)報(bào)道，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在上皮細(xì)胞中的表達(dá)能夠抵抗博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，而缺乏端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)影響上皮細(xì)胞的增殖，并可能導(dǎo)致上皮再生受損，并導(dǎo)致肺纖維化加重[23]。在本實(shí)驗(yàn)中TGF?β1干預(yù)組與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)明顯降低，提示TGF?β1通過(guò)抑制A549細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)降低了端粒酶的活性，表明端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性減弱與細(xì)胞衰老有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏會(huì)影響上皮細(xì)胞的增殖，并可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞再生受損使肺纖維化加重[23]，與本研究結(jié)果一致。

表觀遺傳因素改變導(dǎo)致特發(fā)性肺纖維化肺組織中基因表達(dá)失調(diào)，最常見(jiàn)的表觀遺傳機(jī)制包括DNA甲基化和組蛋白修飾以及非編碼RNA（NcRNA）調(diào)控[24]。DNMT3a、DNMT3b是DNA甲基化的關(guān)鍵限速因子。Velagacherla等[25]研究提示特發(fā)性肺纖維化中DNMT3a、DNMT3b表達(dá)增加，而細(xì)胞黏附相關(guān)基因CDH1甲基化可能參與特發(fā)性肺纖維化發(fā)病，CDH1編碼的E?鈣黏素（E?cad）是上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，對(duì)細(xì)胞極性和組織完整性的維持具有重要作用。E?鈣黏素水平下降是促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要因素之一，可導(dǎo)致細(xì)胞黏附力降低，促進(jìn)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生[26]。另有研究指出，TGF?β1是一種DNA甲基化調(diào)節(jié)劑，影響著一些重要元素[27]。本實(shí)驗(yàn)中TGF?β1干預(yù)組與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞CDH1表達(dá)明顯降低，這也進(jìn)一步說(shuō)明了CDH1降低，其編碼的上皮表型的標(biāo)志蛋白E?鈣黏素水平有可能下降，導(dǎo)致細(xì)胞黏附力降低，也進(jìn)一步加快了纖維化的進(jìn)程。Negreros等[24]研究結(jié)果表明，TGF?β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞DNMT3a和TET3的表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的DNA甲基化模式發(fā)生深刻變化。本實(shí)驗(yàn)TGF?β1干預(yù)組與對(duì)照組相比較顯示A549細(xì)胞DNMT3a和DNMT3b 表達(dá)明顯升高，與Negreros等[24?25]的研究結(jié)果一致。

目前，已有研究證實(shí)DNA甲基化限速酶和端粒酶在特發(fā)性肺纖維化中起重要調(diào)控作用。本研究旨在探究TGF?β1對(duì)A549細(xì)胞中DNA甲基化關(guān)鍵酶DNMT3a、DNMT3b和端粒酶活性標(biāo)志物端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的影響。研究表明，TGF?β1促進(jìn)了A549細(xì)胞發(fā)生復(fù)制性衰老并導(dǎo)致纖維化改變，同時(shí)提示DNA甲基化關(guān)鍵限速酶DNMT3a、DNMT3b表達(dá)上調(diào)和端粒酶活性（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶）降低與衰老有關(guān)。TGF?β1作為重要的致纖維化因子與DNA甲基化和端粒酶之間有著密切關(guān)系，這為治療纖維化提供了方向。中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬于“肺痿”“肺痹”等范疇，中醫(yī)藥治療特發(fā)性肺纖維化以副作用少、價(jià)格低、藥物依賴性小等優(yōu)勢(shì)逐漸成為熱點(diǎn)[28]。同時(shí)，基于韓世范教授等[29]提出的非營(yíng)養(yǎng)素防治慢性病的理論模型，很多兼具食品和藥品特性的食物成為防治慢性病的新選擇，如水果、蔬菜中含量豐富的多酚類化合物具有抗感染、抗過(guò)敏、抗氧化、保護(hù)DNA和提高免疫力等多種藥學(xué)作用，其中槲皮素作為酚類化合物的一種，廣泛存在于銀杏葉、柴胡等中草藥和蘋果、卷心菜、西藍(lán)花等果蔬中[30]。目前，關(guān)于中醫(yī)藥材和食物對(duì)抗纖維化的研究集中在抗氧化、抑制上皮細(xì)胞?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)免疫平衡、改善細(xì)胞外基質(zhì)沉積等方面[31]，其中作用最顯著的是抑制TGF?β信號(hào)通路。最近越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)中藥材通過(guò)表觀遺傳修飾發(fā)揮抗纖維化作用[7]。本研究也為探索藥食同源物質(zhì)發(fā)揮抗纖維化作用機(jī)制提供了思路。

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Regulatory mechanism of TGF?β1on DNA methylase and telomerase in human alveolar epithelial cells

SUNZiyue, QIANLi, LIDan, ZHURuifang, HANYongkang, LIUXuejun

Shanxi Medical University, Shanxi 030001 China

Changes in DNA methylase and telomerase were observed by TGF?β1?induced human alveolar epithelial cells A549.A549 cells were induced by TGF?β1to establish an in vitro pulmonary fibrosis model，which was divided into a control group，TGF?β12μmol/L intervention group，TGF?β15 μmol/L intervention group，and TGF?β110 μmol/L intervention group.β?gal staining to detect the degree of cell senescence；ELISA and RT?qPCR detected the expression of inflammatory factors IL?1β and IL?6.RT?qPCR detects the expression of Type I collagen（COL?I），F(xiàn)ibronectin 1（FN1），Tensin?C，DNMT3a，DNMT3b，CDH1，and TERT mRNA.Western Blot method detected TERT protein expression.There were almost no senescent cells in the control group，and the degree of senescence of cells in the intervention group increased with the increase of TGF?β1concentration；IL?1β and IL6 expression were significantly increased in the TGF?β1intervention group（<0.05）；The A549 cell morphology of the control group showed a typical epithelial cell?like morphology，and the TGF?β1 intervention group had a typical mesenchymal cell?like morphology，and the Masson staining results showed that the control group cells hardly saw blue collagen，while the expression of indigen?stained collagen in the TGF?β1intervention group was significantly increased；Compared with the control group，the expression of COL?I，F(xiàn)N1，Tensin?C，DNMT3a，and DNMT3b mRNA was significantly increased（<0.05），the expression of mRNA of TERT and CDH1 genes was reduced（<0.05），and the expression of TERT protein was further verified by Western Blot（<0.05）.TGF?β1can induce senescence of A549 cells，and promote the high expression of inflammatory factors and fibrogenic factors，resulting in fibrosis changes.TGF?β1promoted the expression of DNA methylase and inhibited the expression of TERT.

idiopathic pulmonary fibrosis， IPF； TGF?β1； A549 cells； DNA methylation； TERT

10.12102/j.issn.1009-6493.2023.12.010

（2023?02?16；

2023?05?24）

山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：201601D011105；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目青年科技研究基金項(xiàng)目，編號(hào)：201701D221271

孫梓越，醫(yī)師，碩士

劉學(xué)軍，E?mail：lxj20041205@sina.com

孫梓越,錢力,李丹,等.TGF?β1調(diào)控人肺泡上皮細(xì)胞中DNA甲基化酶和端粒酶的機(jī)制[J].護(hù)理研究,2023,37(12):2138?2143.

LIU Xuejun, E?mail: lxj20041205@sina.com

（本文編輯 曹妍）