顱內(nèi)動(dòng)脈瘤術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液病原菌分布藥敏試驗(yàn)及耐藥基因分析

祖向陽 馮 森 馬 鵬

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranial aneurysm，IA）指腦動(dòng)脈管壁因先天缺陷、動(dòng)脈硬化或炎癥等異常膨出，是蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）常見原因，文獻(xiàn)報(bào)道SAH 發(fā)生后致殘和致死率可達(dá)40%～50%，因此早期診斷和干預(yù)對(duì)改善IA 患者預(yù)后極為重要［1-3］。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，血管內(nèi)介入治療已逐漸成熟并取代外科夾閉術(shù)成為IA 治療首選方案，可根據(jù)病灶位置、形態(tài)及供血區(qū)域等具體情況合理選擇器材和策略，其效果和安全性均已獲得普遍認(rèn)可［4］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）感染是IA 患者介入術(shù)后常見并發(fā)癥且治療難度較大，可對(duì)手術(shù)效果和患者預(yù)后造成不利影響，甚至威脅患者生命安全［5-6］。隨著顱腦手術(shù)大范圍開展和抗生素不合理應(yīng)用，近年來術(shù)后院內(nèi)感染患者數(shù)量快速增加，其中CNS感染發(fā)生率達(dá)2.1%～10%，因不同地區(qū)醫(yī)療水平差異而變化［7-9］。植入物污染、術(shù)后引流或長(zhǎng)期臥床等因素均可引起IA 介入術(shù)后CNS 感染，因其可直接導(dǎo)致腦組織炎癥和損傷，CNS 感染相較其他院內(nèi)感染病情進(jìn)展迅速且相對(duì)更為嚴(yán)重，對(duì)患者預(yù)后造成不利影響［10］。既往研究表明細(xì)菌耐藥性是影響抗感染治療效果的重要原因，因此明確細(xì)菌耐藥性及其作用機(jī)制對(duì)提升治療效果極為重要［11］。本研究主要探討IA術(shù)后CNS感染患者腦脊液病原菌分布、耐藥性以及抗菌治療方案，為改善患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020-03—2022-03 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院的IA介入術(shù)后CNS感染患者64例，其中男34 例，女30 例；年齡37～82（63.18±10.24）歲；IA 位置：前循環(huán)35 例，后循環(huán)29 例；術(shù)前Hunt-Hess分級(jí)：Ⅰ級(jí)19 例，Ⅱ級(jí)27 例，Ⅲ級(jí)14 例，Ⅳ級(jí)4 例。根據(jù)2017 年《中國神經(jīng)外科重癥患者感染診治專家共識(shí)》診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］，滿足以下①～④項(xiàng)者為臨床確診：①患者出現(xiàn)意識(shí)障礙和顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)，伴神經(jīng)局灶性功能障礙或全身感染癥狀、體征；②CT或MRI等影像學(xué)檢查顯示腦組織水腫、腦室擴(kuò)張或腦膜增厚等異常征象或占位性病變；③血常規(guī)示白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）＞10×109個(gè)/L 或中性粒細(xì)胞占比＞80%；④腰椎穿刺檢查顱內(nèi)壓＞200 mmH2O（1 mm H2O=0.009 8 kPa），腦脊液呈黃色、渾濁或膿性，腦脊液WBC＞100×106個(gè)/L，葡萄糖含量＜2.6 mmol/L 或蛋白含量＞4.5 g/L；⑤細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①順利完成IA 介入手術(shù)；②滿足CNS 感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡≥18歲；④患者及家屬知曉本次研究?jī)?nèi)容并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①介入術(shù)前存在感染或此前6個(gè)月內(nèi)CNS感染史者；②伴免疫功能障礙或此前6個(gè)月內(nèi)接受免疫治療者；③伴重要器官功能不全者；④合并全身其他部位感染者；⑤伴精神疾病或認(rèn)知功能障礙者。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器和試劑：Mastercycle Gradient PCR擴(kuò)增儀（德國Eppendorf 公司），電泳級(jí)瓊脂凝膠（西班牙BioWest Agarose 公司），DYY-6D 電泳儀和QD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一儀器廠），BACT/Alert 全自動(dòng)微生物培養(yǎng)系統(tǒng)（荷蘭Organon Teknika 公司），VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司），DW-86L626 型—80 ℃超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司），ST16R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Sorvall 公司），Multiskan FC 酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司），LB肉湯（杭州百思生物技術(shù)有限公司），DNA Marker（上海生工生物科技有限公司），Easy Taq 酶、10×buffer 和dNTPs（北京全式金生物技術(shù)有限公司），M-H 瓊脂平板（西班牙OXIOD公司），核酸染色劑（北京Solarbio公司），細(xì)菌DNA 提取試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司），金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853 質(zhì)控菌株（衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心），引物序列合成（上海生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 CNS 感染耐藥性分析：患者入院后詳細(xì)采集病史，完成體格檢查、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查，臨床確診后給予腰大池持續(xù)引流，150～250 mL/d，并應(yīng)用美羅培南聯(lián)合萬古霉素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，腦脊液培養(yǎng)明確病原菌后換用敏感抗生素，若培養(yǎng)為陰性則在用藥72 h后觀察病情變化，好轉(zhuǎn)者保持用藥3周，無效者立即更換抗菌藥物，至腦脊液檢查顯示W(wǎng)BC 正常后鞏固治療2 周。病原菌培養(yǎng)方法：采集患者入院第1 天腦脊液并接種于專用瓶?jī)?nèi)，采用BACT/Alert全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)在37 ℃環(huán)境下進(jìn)行振搖培養(yǎng)，提示細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)接種于血瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后采用VITEK-2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀分析病原菌類型，同時(shí)采用K-B 紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株分別為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.3 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)：將菌株采用LB液態(tài)培養(yǎng)基在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，采集1.5 mL菌液以12 000 r/min 離心2 min 后去上清，然后加入Buffer BS 500 μL重懸細(xì)胞，采用50 μL溶菌酶37 ℃溫育60 min，12 000 r/min離心5 min后去除上清，依次加入Buffer GL 180 μL，蛋白酶K 20 μL和核糖核酸酶A 10 μL，56 ℃溫育10 min，與Buffer GB和100%乙醇各200 mL充分混勻后以12 000 r/min離心5 min，去除濾液后加入無菌蒸餾水100 μL并室溫靜置5 min。采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)金黃色葡萄球菌van、erm、msr、aac（6＇）/aph（2″）、mec、fem、gyr、par以及emc等常見耐藥基因表達(dá)情況，所用引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。PCR 反應(yīng)體系包括Premix Taa 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板4.0 μL，dNTP 2.0 μL，然后補(bǔ)充雙蒸餾水至25 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，然后于94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次，最后72 ℃延伸10 min并于4 ℃保持。將PCR產(chǎn)物采用瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，參數(shù)設(shè)置為電壓110 V，電流100 mA，40 min后進(jìn)行拍照和分析，與GenBank比對(duì)后明確基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）形式表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IA 術(shù)后CNS 感染者腦脊液病原菌分布64 例CNS 感染患者中58 例腦脊液培養(yǎng)結(jié)果陽性，占90.63%，共分離出病原菌58 株，其中革蘭陽性菌35株（60.34%），革蘭陰性菌23株（39.66%）。見表2。

表2 IA術(shù)后CNS感染者腦脊液病原菌分布Table 2 Distribution of pathogenic bacteria in cerebrospinal fluid of patients with CNS infection after IA

2.2 革蘭陽性菌常見抗生素耐藥性分析藥敏試驗(yàn)顯示革蘭陽性菌中青霉素G、克林霉素、紅霉素、苯唑西林和頭孢西丁耐藥發(fā)生率較高，萬古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐藥發(fā)生率較低，且凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整體耐藥率高于金黃色葡萄球菌。見表3。

表3 革蘭陽性菌常見抗菌藥物耐藥性分析Table 3 Analysis of drug resistance of common antibacterial drugs to Gram-positive bacteria

2.3 革蘭陰性菌常見抗生素耐藥性分析藥敏試驗(yàn)顯示革蘭陰性菌中阿莫西林、頭孢類抗生素、氨曲南和慶大霉素耐藥發(fā)生率較高，環(huán)丙沙星、美羅培南和亞胺培南耐藥發(fā)生率較低，且肺炎克雷伯菌和鮑氏不動(dòng)桿菌整體耐藥率高于大腸埃希菌。見表4。

表4 革蘭陰性菌常見抗生素耐藥性分析Table 4 Analysis of drug resistance of common antibiotics to Gram-negative bacteria

2.4 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果20株金黃色葡萄球菌中ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 檢出率分別為30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，見表5。與耐藥性進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析顯示，mecA/femB 與青霉素G 符合率為75.00%，與苯唑西林符合率為85.00%；erm/msr與克林霉素符合率為70.00%，與紅霉素符合率為90.00%；aac（6＇）/aph（2″）與慶大霉素符合率為90.00%；gyrA 與左氧氟沙星符合率為85.00%，與環(huán)丙沙星符合率為75.00%；mecA與頭孢西丁符合率為80.00%。

表5 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detection results of drug resistance genes in staphylococcus aureus

3 討論

血管介入治療是現(xiàn)階段IA 的主要干預(yù)手段，可有效防止瘤體破裂，預(yù)防SAH 發(fā)生，并改善患者預(yù)后，治療效果已獲得學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可，但術(shù)后CNS感染近年來明顯增多［6］。腦脊液培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)是確診CNS 感染的重要參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)抗感染治療也具有良好指導(dǎo)意義，本研究對(duì)64例IA介入術(shù)后CNS感染患者腦脊液進(jìn)行培養(yǎng)分析，其中58例結(jié)果陽性，陽性率90.63%，共分離出病原菌58 株，革蘭陽性菌35 株，占60.34%，檢出率從高到低依次為金黃色葡萄球菌20 株（34.48%），凝固酶陰性葡萄球菌7 株（12.07%）和表皮葡萄球菌6 株（10.34%）；革蘭陰性菌23 株，占39.66%，包括大腸埃希菌9 株（15.52%），肺炎克雷伯菌7 株（12.07%），鮑曼不動(dòng)桿菌3 株（5.17%），可見CNS 感染病原菌以革蘭陽性菌更常見，與文獻(xiàn)［13］報(bào)道結(jié)果一致，因此經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療應(yīng)首選頭孢類抗生素或萬古霉素等對(duì)革蘭陽性菌作用較強(qiáng)的藥物。

近年來由于抗菌藥物不合理應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性明顯增加，常用抗菌藥物殺菌效果逐漸降低，而CNS感染病情進(jìn)展迅速，易引起神經(jīng)功能損傷，造成后遺癥，甚至威脅患者生命安全，及時(shí)進(jìn)行病原學(xué)檢查和藥敏分析可為針對(duì)性應(yīng)用抗菌藥物和快速控制感染提供依據(jù)［14-16］。本研究藥敏試驗(yàn)顯示革蘭陽性菌中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌對(duì)青霉素G、對(duì)克林霉素、紅霉素、苯唑西林和頭孢西丁等均表現(xiàn)出較高耐藥性，原因可能與術(shù)前預(yù)防性應(yīng)用抗感染藥物有關(guān)，導(dǎo)致CNS 感染的病原菌多為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。本研究中革蘭陽性菌對(duì)萬古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐藥發(fā)生率較低，因此可作為首選抗感染治療方案。革蘭陰性菌中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)阿莫西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松分、氨曲南和慶大霉素耐藥性較高，而對(duì)環(huán)丙沙星、美羅培南和亞胺培南耐藥率相對(duì)較低，可見碳青霉烯類抗生素可作為現(xiàn)階段抗革蘭陰性菌感染的首選藥物。本研究顯示凝固酶陰性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整體耐藥率高于金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌和鮑氏不動(dòng)桿菌整體耐藥率高于大腸埃希菌，更易表現(xiàn)出多藥耐藥，與文獻(xiàn)［4，17］報(bào)道結(jié)果相近。因此，可采用多藥聯(lián)合治療以增強(qiáng)抗感染效果并縮短用藥時(shí)間，同時(shí)嚴(yán)密隨訪病情并及時(shí)調(diào)整治療方案。

攜帶耐藥基因是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。本研究以金黃色葡萄球菌為樣本進(jìn)行分析，顯示耐藥基因ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 檢出率分別為30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，這與本研究中金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素G、克林霉素、紅霉素、苯唑西林、頭孢西丁以及環(huán)丙沙星等多種抗生素均具有較高耐藥性結(jié)果一致，可見金黃色葡萄球菌通常攜帶多種耐藥基因，從而造成多種耐藥性。erm基因包括ermA、ermB 和ermC 3種類型，廣泛分布于質(zhì)?；蛉旧w，通過編碼核糖體甲基化酶并誘導(dǎo)23S rRNA 甲基化導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗生與核糖體結(jié)合障礙，從而造成克林霉素和紅霉素等相應(yīng)藥物耐藥；此外，質(zhì)?；騧sr可編碼外排蛋白并引起對(duì)紅霉素等14 或15 環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥［18～20］。本研究中erm/msr與克林霉素耐藥符合率為70.00%，與紅霉素耐藥符合率為90.00%，證實(shí)攜帶erm/msr可能是造成金黃色葡萄球菌克林霉素和紅霉素耐藥的主要原因。金黃色葡萄球菌aac（6＇）/aph（2″）基因檢出率較高，是造成氨基糖苷類抗生素耐藥的重要原因。本研究中檢出率30.00%，與無萬古霉素耐藥菌株的檢測(cè)結(jié)果一致，較CHEN 等［21］報(bào)道結(jié)果更高，原因可能與不同地區(qū)抗生素應(yīng)用差異有關(guān)。mecA 為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經(jīng)典耐藥基因，通過編碼青霉素結(jié)合球蛋白2a（PBP2a）競(jìng)爭(zhēng)性抑制β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的殺菌活性，femB 為金黃色葡萄球菌特異性表達(dá)的高度保守性基因，可與mecA 協(xié)同作用并引起多種耐藥性［22-23］。本研究顯示mecA/femB 與青霉素G 符合率為75.00%，與苯唑西林符合率為85.00%，與頭孢西丁符合率為80.00%，證實(shí)mecA/femB可引起多種抗生素耐藥。gyrA基因突變是喹諾酮類抗生素耐藥的常見原因，其機(jī)制與DNA 促旋酶結(jié)構(gòu)改變有關(guān)［24］。本研究中g(shù)yrA 與左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥符合率為85.00%和75.00%，但gyrA 檢出率僅為20.00%，低于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，可見左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥還與其他因素有關(guān)。SHENG等［25］研究認(rèn)為編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC 基因與左氧氟沙星、莫西沙星以及耐諾沙星均存在密切聯(lián)系。本研究表明各種抗生素耐藥性均與一種或多種耐藥基因緊密相關(guān)，但由于樣本量偏小，且金黃色葡萄球菌與耐藥性相關(guān)的基因突變較多，因此無法詳細(xì)闡明各種抗菌藥物耐藥的所有機(jī)制，有待后續(xù)研究擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更為深入和細(xì)致的分析。

IA 術(shù)后CNS 感染病原菌以革蘭陽性菌更為常見，且細(xì)菌耐藥率較高，明確細(xì)菌耐藥性及相應(yīng)基因型可為合理選用抗菌藥物提供依據(jù)，從而提升抗感染治療效果。