蒼術(shù)素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究

朱亞蘭 呂世文 曾晨欣 徐媛青

非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型，發(fā)病率與病死率較高，晚期NSCLC 患者多采取放療或化療的治療方式，但長(zhǎng)期使用化療藥物的患者易發(fā)生耐藥性，影響患者預(yù)后，因此進(jìn)一步尋找有效治療藥物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[1-2]。蒼術(shù)素（atractylodin，ATR）是從蒼術(shù)中提取的有效成分，具有降血糖、抗炎、促胃排空、利尿等作用，研究顯示，ATR 在肝癌、膽管癌中具有抗腫瘤活性，如通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR）通路和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信號(hào)通路抑制膽管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞自噬[3-4]。Janus 激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲及腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用，抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活可抑制肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲[5-6]。目前，關(guān)于ATR 影響NSCLC 細(xì)胞耐藥及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究探索ATR 對(duì)NSCLC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的影響及可能的作用機(jī)制，為其用于NSCLC 的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人NSCLC 細(xì)胞HCC827（批號(hào)：CTCC-400-0172）購(gòu)于浙江美森細(xì)胞科技有限公司；在含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%時(shí)，消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。每2 d更新培養(yǎng)液。

1.1.2 主要試劑 ATR（純度≥98%）粉劑購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PCS0115，用二甲基亞砜溶解，配制成400.0 μmol/L 的母液，備用；CCK-8試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：E1008-1000；STAT3 激活劑Colivelin 購(gòu)自MCE 公司，批號(hào)：HY-P1061A；兔抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Snail）1 購(gòu)自Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為sc-71008、sc-59987、sc-393172）；RIPA 裂解液、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠配置試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司，批號(hào)為P0013B 和P0012A；磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購(gòu)自碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為AF1486、AF1489、AF1495、AF1492 和AF5003。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96 孔板中。分別加入10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L 的ATR 處理24、48、72 h，根據(jù)CCK-8 檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，測(cè)定450 nm 處吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組、ATR 藥物低、中、高濃度組（ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組）、ATR+Colivelin 組，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組分別使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 處理24 h，ATR+Colivelin 組 使 用40.0 μmol/L 的ATR 與0.5 μmol/L 的Colivelin 共同處理24 h，對(duì)照組僅加入等量的二甲基亞砜。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞稀釋為1×105/ml的細(xì)胞懸液，取2 ml 加入6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，使用20 μl 移液槍頭在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕，PBS 洗去不貼壁的細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞使用無血清稀釋成2×105/ml 的細(xì)胞懸液，Transwell 小室鋪稀釋Matrigel 基質(zhì)膠，待膠干后，上室加入100 μl 細(xì)胞懸液，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。使用甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，觀察侵襲細(xì)胞，計(jì)算平均每個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Snail1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 和βactin 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影并拍照，以β-actin 為內(nèi)參，Imge J 軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ATR 處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響 隨ATR 濃度升高，細(xì)胞存活率呈逐漸降低趨勢(shì)；培養(yǎng)24 h，HCC827 細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)抑制濃度為（63.51±1.15）μmol/L。因此選擇濃度為10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 不同濃度ATR 處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.2 ATR 對(duì)細(xì)胞遷移與侵襲的影響 與對(duì)照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；隨ATR 濃度 升 高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組細(xì)胞劃痕愈合率逐漸降低，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 ATR 對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲的影響

2.3 ATR 對(duì)細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，N-cadherin、Snail1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；隨ATR 濃度升 高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高，Ncadherin、Snail1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，Ncadherin、Snail1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 ATR 對(duì)細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（A：電泳圖；B：EMT 相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平）

2.4 ATR 對(duì)細(xì)胞JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；隨ATR濃度 升高，ATR-L 組、ATR-M 組、ATR-H 組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）；與ATR-H 組比較，ATR+Colivelin 組 細(xì) 胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 ATR 對(duì)細(xì)胞JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（A：電泳圖；B：JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平）

3 討論

肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變陽(yáng)性率較高[7-8]，吉非替尼為治療EGFR 基因突變肺癌的一線藥物，但患者易產(chǎn)生耐藥性，從而影響治療效果[9-10]。耐藥已成為NSCLC治療的主要難題，因此尋找新的治療藥物對(duì)于改善NSCLC 患者預(yù)后具有重要意義[11-12]。研究顯示NSCLC的耐藥與細(xì)胞EMT 有關(guān)，抑制EMT 可逆轉(zhuǎn)NSCLC 耐藥性[13-14]。

ATR 具有抗炎、抗菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[15-17]。研究顯示，ATR 可通過抑制P13K/Akt/mTOR 通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬[18]。在肺癌中，ATR 通過調(diào)節(jié)活性氧介導(dǎo)的信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯與細(xì)胞凋亡[19]。以上研究表明ATR 對(duì)肺癌有一定抗腫瘤活性。本研究顯示，10.0～160.0 μmol/L的ATR 均可顯著抑制NSCLC HCC827 細(xì)胞增殖，與報(bào)道結(jié)果類似。NSCLC 細(xì)胞遷移和侵襲能力增加是腫瘤轉(zhuǎn)移及病情惡化的重要原因之一[20-21]，本研究顯示使用10.0、20.0、40.0 μmol/L 的ATR 處理HCC827 可顯著抑制細(xì)胞遷移與侵襲，且呈藥物濃度依賴性，表明ATR 在NSCLC 中表現(xiàn)為抗腫瘤性，與先前報(bào)道結(jié)果類似。E-cadherin、N-cadherin、Snail1 是EMT 標(biāo)志物，Ecadherin 可維持細(xì)胞間黏附作用，N-cadherin 可促進(jìn)細(xì)胞的遷移，發(fā)生EMT 時(shí)N-cadherin、Snail1 上調(diào)表達(dá)，E-cadherin 下調(diào)表達(dá)[22-23]。抑制NSCLC 細(xì)胞EMT 可顯著抑制腫瘤惡性進(jìn)展與耐藥性[24]。本研究結(jié)果顯示，使用ATR 可顯著上調(diào)E-cadherin 表達(dá)，下調(diào)N-cadherin、Snail1 蛋白表達(dá)，提示ATR 可抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。

為進(jìn)一步闡明ATR 抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)JAK2/STAT3 通路相關(guān)蛋白磷酸化水平。JAK2/STAT3 信號(hào)通路在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡方面發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)該通路還參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)過程[25-26]。JAK2 的 活 化 可 促 進(jìn)STAT3 磷 酸 化，JAK2/STAT3 通路的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲與EMT[27-28]。JAK2/STAT3 通路還與腫瘤耐藥性有關(guān)，在肺癌中，β-欖香烯可能通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路激活，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，降低肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性[29]。Chae 等[30]發(fā)現(xiàn)，ATR 可抑制JAK2、STAT3 的磷酸化，降低佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯誘導(dǎo)的人肥大細(xì)胞中的IL-6 水平。另有研究顯示，在膽管癌細(xì)胞系CL-6 中，ATR 以劑量依賴性和時(shí)間依賴性方式抑制STAT3 蛋白磷酸化，從而抑制CL-6 細(xì)胞的增殖和遷移[31]。本研究結(jié)果表明，ATR 可抑制NSCLC 細(xì)胞JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平，且呈藥物濃度依賴性，提示ATR 具有抑制JAK2/STAT3 通路激活的作用；給予STAT3 激活劑Colivelin 后，ATR 對(duì)JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平的抑制作用減弱，同時(shí)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，證實(shí)ATR 對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與EMT 的抑制作用可能是通過抑制JAK2/STAT3 通路活化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，ATR 通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移與EMT，ATR 在NSCLC 中的抗腫瘤活性仍需結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)行更深入的研究。