Box-Benhnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化大花紫薇中科羅索酸的提取工藝

林艾和 朱培芳 李蓉 夏宗霄 龍小妹 郭爽 范源

【摘 要】 目的：優(yōu)選大花紫薇中三萜類化合物科羅索酸的最佳提取工藝。方法：采用 HPLC 建立大花紫薇中CA含量測(cè)定方法，以CA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)CA提取效果的影響。結(jié)果：CA分離度良好，在0.480～2.880 μg （r＝0.9999）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為 99.97%（RSD＝0.58%）。最佳提取工藝條件為采用 95%乙醇、料液比為1∶20 g/mL、回流提取 60 min，提取 2 次。結(jié)論：本研究建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于合理優(yōu)化大花紫薇中CA的提取工藝。

【關(guān)鍵詞】 大花紫薇；Box-Benhnken；提取工藝；科羅索酸

【中圖分類號(hào)】R284.2?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）01-0037-06

Box-Behnken Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Process of Corosolic Acid from Lagerstroemia speciosa

LIN Aihe1 ZHU Peifang1 LI Rong1 XIA Zongxiao1 LONG Xiaomei1 GUO Shuang1 FAN Yuan1，2*

1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2.Yunnan University of Chinese Medicine/Second Affiliated Hospital of Yunnan College of

Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Corosoic acid from Crape Myrcus macrophylla. Methods HPLC was used to establish a method for the determination of Ca content in Cryptophylla grandiflorum. With Ca content as the evaluation index， response surface methodology was used to optimize the process. The effects of ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on the extraction efficiency of Ca were investigated. Results The Ca separation was linear in the range of 0.480-2.880 μg （r=0.9999）.The average recovery was 99.97% （RSD = 0.58%）. The optimal extraction conditions were as follows： 95% ethanol， liquid to solid ratio of 1∶20 g/mL， reflux extraction for 60 min， extraction twice.Conclusion The method established in this study was accurate and reproducible， and could be used to optimize the extraction process of CA from Crape Myrrh macrophylla.

Keywords：Lagerstroemia speciosa; Box-Behnken; Extraction Process; Corosolic Acid

大花紫薇（Lagerstroemia specious L.），又名大葉紫薇（Lagerstroemia flos-reginae Retz），是千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia）的落葉喬木［1］。其原產(chǎn)于亞洲熱帶，分布于斯里蘭卡、印度、馬來西亞、菲律賓等地區(qū)［2］，在我國廣東、廣西地區(qū)有較豐富的資源。

上世紀(jì)90年代起，日本、美國以及菲律賓學(xué)者開始系統(tǒng)研究大花紫薇化學(xué)成分及功能［3］，其廣泛用于治療糖尿病及腎?。?］，在多個(gè)國家已經(jīng)被開發(fā)為茶飲料，廣泛用于治療和預(yù)防糖尿病，被譽(yù)為“天然植物胰島素”［5］，此外，其還具有減脂、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等作用［6］。近年來，隨著對(duì)大花紫薇的研究深入，發(fā)現(xiàn)其降血糖的活性成分主要是鞣質(zhì)類［5，7-8］和三萜類成分［9-10］，其中三萜類主要活性成為科羅索酸［11］，其具有胰島素樣作用且可抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶活性［12-14］。

科羅索酸（corosolic acid，CA），又名 2α-羥基熊果酸［15］，具有降血糖、改善糖尿病性腎損傷、抗腫瘤、抗炎、降血壓、抗菌等藥理作用［16-19］。其主要存在于大花紫薇、枇杷、北五味子等植物中［20］，現(xiàn)關(guān)于在大花紫薇中提取CA相關(guān)報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)研究建立大花紫薇中CA HPLC 定量分析方法，同時(shí)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其提取工藝，為在大花紫薇中提取CA的工藝研究和對(duì)大花紫薇的后續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 YL-040S 語路超聲波清洗機(jī)，深圳市即潔超聲科技有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，AcclaimC30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），美國 Agilent 公司；DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機(jī)，永康式速鋒工貿(mào)有限公司；D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋，上海量壹科學(xué)儀器有限公司；T-1000 型電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；AB265-S 十萬分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade（Shanghai）Co.LTD；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司。

試劑：科羅索酸（CA 批號(hào)：wkq20042404，純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

藥材：大花紫薇Lagerstroemia specious L.（批號(hào)：P20200819，安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司）經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟副教授鑒定為千屈菜科Lythraceae紫薇屬Lagerstroemia植物大花紫薇的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：AcclaimC30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫：0 ～10 min 75% B，12.5% C，12.5% D；10～20 min 70% B，15% C，15% D；流速：0.1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按科羅索酸計(jì)算應(yīng)不低于 5000，分離度大于1.5。色譜圖如圖1所示。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取CA對(duì)照品2.40 mg，置 10 mL 量瓶中，用甲醇配制成CA濃度分別為0.240 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，低溫避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備 取干燥的大花紫薇，粉碎，過 40 目篩，精密稱定約 2.0 g，置于圓底燒瓶中，加熱回流，提取溫度90℃，設(shè)置不同料液比、加熱回流時(shí)間、回流次數(shù)及乙醇體積分?jǐn)?shù)，合并提取液，過濾。濾液于 60 ℃減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙夂笠浦?10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜膜過濾，依次精密吸取2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL， 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。 CA的回歸方程為y=604.24x+1.1333（R2=0.9999），線性范圍為 0.480～2.880 μg。

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液 10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，結(jié)果CA的峰面積RSD 為1.13% ，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，以峰面積為指標(biāo)進(jìn)樣分析，結(jié)果CA面積 RSD 為1.44%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示CA平均含量為2.3246 mg/g， RSD 為 1.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品（每 1.0 g 大花紫薇含CA 2.3246mg）粉末 6份，每份精密稱取 1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加入CA對(duì)照品適量（約相當(dāng)于 1.0 g 樣品中所含CA的量），再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率。結(jié)果見表 1。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用加熱回流法提取大花紫薇中的科羅索酸，將料液比、加熱回流時(shí)間、回流次數(shù)及乙醇體積分?jǐn)?shù)作為影響因素，固定其中3個(gè)因素，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)另一個(gè)因素進(jìn)行單一因素實(shí)驗(yàn)。固定提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為1次，料液比為1∶10 g/mL，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（75%、80%、85%、95%、100%）對(duì)提取率的影響，優(yōu)選最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)，按所優(yōu)選條件依次向下考察料液比（1∶10 g/mL、1∶15g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL），提取時(shí)間（40 min、60 min、80 min、100 min、120 min），提取次數(shù)（1次、2次、3次）對(duì)醇提的影響。

結(jié)果圖2表明，CA含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而增加，由于CA是脂溶性物質(zhì)，不溶于水，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加其含量增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%和100%時(shí)，CA含量相差不明顯，考慮實(shí)驗(yàn)成本，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為 95%［21］；CA含量隨料液比從1∶10 g/mL到1∶25 g/mL先增加后減少，可能因?yàn)闉槿軇w積過小，CA無法徹底溶解，但溶劑體積過大，更易溶出其他的雜質(zhì)達(dá)到飽和［22］，繼續(xù)增大料液比不會(huì)增加溶出率，故選擇料液比 1∶20 g/mL；CA含量隨提取時(shí)間從40～120 min先增加后減少，CA溶出率一定時(shí)間內(nèi)隨著提取時(shí)間增加增加，但提取時(shí)間過長(zhǎng)，料液長(zhǎng)時(shí)間處于受熱狀態(tài)，更容易造成CA損失，固選擇提取時(shí)間60 min［23］；CA含量在提取次數(shù)2次時(shí)最大，故選擇提取次數(shù)兩次。最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2次。

活性物質(zhì)含量（mg/g）計(jì)算公式：

含量=M供×C標(biāo)/M對(duì)

式中M供為供試品峰面積；

C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（mg/mL）

M對(duì)為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述醇提單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

2.3.2 醇提模型擬合及方差分析 采用Design-expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程為

Y=-51.15554+0.94402A+0.40383B+0.13185C+0.72244D-6.7×10-4AB-1.17133×10-3AC+4×10-3AD-3.17333×10-4BC-0.0197BD+2.25917×10-4CD-4.58348×10-3A2-6.60648×10-3B2-1.2384×10-4C2-0.15528D2 R2=0.9158。由表3可知，模型F＝10.87（P＜0.0001），表明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)F＝2.03，P＝0.2584＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，可用于分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。以Y為響應(yīng)值時(shí)，模型的一次項(xiàng)影響順序是D＞B＞C＞A，和二次項(xiàng)B2、D2有極顯著影響（P＜0.001），一次項(xiàng)D和二次項(xiàng)A2、C2有高度顯著影響（P＜0.01），一次項(xiàng)B、C有顯著影響（P＜0.05）表明所得回歸方程能較好地預(yù)測(cè)Y隨各影響因子的變化。見表4。

2.3.3 醇提響應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測(cè) 經(jīng)Design-expert 8.0.6軟件分析得響應(yīng)面圖（如圖3所示），由圖可見提取次數(shù)對(duì)Y值影響較大，交互項(xiàng)對(duì)Y值無顯著影響，忽略交互作用，以Y值的回歸模型的極值分析得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)94.77%，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2.27次，料液比1∶20.93 g/mL，Y預(yù)測(cè)值為2.5783 μg/g，綜合實(shí)際情況考慮，調(diào)整最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。如圖3所示。

2.4 醇提優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 平行稱取大花紫薇3份，每份2.0 g，按所優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示Y平均值為2.5613 mg/g（RSD=1.33％，n＝3），與預(yù)測(cè)值2.5783 mg/g相比較，相對(duì)誤差為1.20％，說明該模型預(yù)測(cè)性擬合度良好，所得數(shù)據(jù)有效可靠。見表5。

3 討論

3.1 色譜條件 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，調(diào)整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最終選用流動(dòng)相甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D），梯度洗脫，分離度＞1.5，達(dá)到了檢測(cè)要求。大花紫薇中科羅索酸的加熱回流提取最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取方法所得科羅索酸含量為2.5613 mg/g，擬合的模型能較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)總含量，同時(shí)也說明響應(yīng)面分析法精確度高、模型預(yù)測(cè)性好。

3.2 結(jié)果分析 本試驗(yàn)以科羅索酸為指標(biāo)成分，用Box-Benhnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化大花紫薇中CA的提取工藝，經(jīng)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，該提取工藝操作簡(jiǎn)單，CA的提取率高，節(jié)省溶劑且穩(wěn)定性好，是應(yīng)用前景較好的提取方法之一，可為后續(xù)CA的應(yīng)用提供參考。

3.2 展望 科羅索酸具有顯著的降血糖作用，且對(duì)身體毒副作用較小，是一種較為理想的降糖化合物，數(shù)據(jù)表明大花紫薇是一種科羅索酸的含量較高的天然藥用植物，尋找在其中有效提取CA的方法是很有必要的，后續(xù)的研究可以在此文章的基礎(chǔ)上，從藥效、作用機(jī)制的角度來探討中藥資源的合理開發(fā)。

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（收稿日期：2022-05-07 編輯：陶希睿）