下呼吸道諾卡菌病諾卡菌菌種分布和耐藥情況分析*

胡晏寧,王利君,魯炳懷△

1.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院,北京 100029;2.中日友好醫(yī)院臨床微生物感染實驗室,北京 100029;3.清華大學臨床醫(yī)學院北京清華長庚醫(yī)院檢驗科,北京102218

諾卡菌為革蘭陽性需氧放線菌,多個諾卡菌菌種可引起臨床患者感染[1]。臨床相關的諾卡菌感染主要是通過吸入獲得的,所以多表現為肺諾卡菌病。目前肺諾卡菌病的診斷仍然有挑戰(zhàn)性,這使得肺諾卡菌的真實感染率很可能被大大低估。此外,由于諾卡菌有生長緩慢的特點,加之缺乏可快速、準確鑒別臨床標本中諾卡菌的分子生物學檢測的方法,諾卡菌的微生物學診斷率較低[1-2]。諾卡菌生長時間多為3～14 d,因此如果臨床醫(yī)生診斷為疑似諾卡菌病但未告知微生物實驗室,實驗室可能會遺漏該種病原體。諾卡菌菌屬的分類仍在持續(xù)更新[3]?；|輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)和測序等新技術有助于諾卡菌菌種級別的鑒定。甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMZ)在肺諾卡菌感染患者的治療中有至關重要的作用。如果感染較為嚴重擴散到了肺外其他組織器官,建議臨床醫(yī)生應在藥敏試驗結果的指導下進行不同抗菌藥物的聯合治療,初始治療方案中應包括TMP-SMZ,聯合治療方案可以選擇利奈唑胺、阿米卡星或β-內酰胺類藥物等。目前已批準的可用于需氧放線菌體外藥敏試驗的微量肉湯稀釋法為12種抗菌藥物提供了判讀折點[4]。既往研究表明,大多數諾卡菌菌株對TMP-SMZ、利奈唑胺和阿米卡星的耐藥率較低,對大環(huán)內酯類、阿莫西林-克拉維酸、第三代頭孢菌素、碳青霉烯類和其他藥物的耐藥藥物性特征則具有種屬特異性[5-7]。

近年來本研究團隊持續(xù)關注諾卡菌感染的情況[8-9]。諾卡菌菌種的分布和敏感性特征可能在不同地域之間有較大差異,以及隨著時間的推移有顯著的變化[5,7,10],因此應進行持續(xù)監(jiān)測。本回顧性研究納入了在中日友好醫(yī)院收集的106例患者分離的108株引起肺諾卡菌病的諾卡菌菌株,并分析了其菌種分布和抗菌藥物耐藥譜。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究收集了2019年10月至2022年11月中日友好醫(yī)院從下呼吸道感染的肺諾卡菌病標本中檢出的108株非重復性諾卡菌臨床菌株(106例諾卡菌病患者),這些菌株未被納入以往的研究中[8-9]。本研究方案已得到中日友好醫(yī)院的倫理審查委員會的批準(2020-102-K66)。

1.2菌種鑒定 采用菌落形態(tài)、涂片鏡檢、MALDI-TOF MS和 Sanger 測序方法對諾卡菌菌種進行鑒定[8]。同時將-80 ℃凍存的諾卡菌菌株在哥倫比亞血平皿(英國OXOID公司)上于35～37 ℃下傳代培養(yǎng)48～72 h,直至菌落生長良好,形態(tài)典型。根據標準化革蘭和(或)改良抗酸染色、菌落形態(tài)辨別及MALDI-TOF MS鑒定以確認新鮮培養(yǎng)菌落的種屬。如果MALDI-TOF MS未能將其鑒定至種,則將使用 ABI 3730 DNA 分析儀通過 16S rRNA 基因測序進行鑒定。根據CONVILLE等[3]指定的諾卡菌種屬和種屬復合群定義諾卡菌種屬的分類。

1.3抗菌藥物敏感性試驗 根據生產商說明書,使用微量肉湯稀釋法(Sensititre Rapmyco微量稀釋板,美國賽默飛世爾科技公司)進行最小抑菌濃度(MIC)的測量。受試藥物包括15種抗菌藥物,即TMP-SMZ、亞胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、克拉霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、莫西沙星、替加環(huán)素、妥布霉素。使用星形諾卡菌ATCC19247作為質量控制菌株。結果將根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會[4]對諾卡菌的藥敏試驗的判讀標準進行解釋。部分抗菌藥物無耐藥折點,不進行敏感與耐藥率的分析。

1.4統(tǒng)計學處理 使用WHONET5.6軟件記錄并分析上述抗菌藥物的MIC結果,并分析MIC50和MIC90的分布情況。

2 結 果

2.1106例諾卡菌患者的人口統(tǒng)計學特征和諾卡菌菌種分布 從106例肺諾卡菌病患者中共分離出108株諾卡菌菌株,入組患者的年齡在15～86歲,平均為56.4歲,其中有50.0%(53/106)的患者年齡在65～86歲,只有1.9%(2/106)的患者年齡在15～18歲。男性患者占44.3%(47/106)。此外,在108株分離株中,從痰液中檢測出諾卡菌67株(62.0%),從支氣管肺泡灌洗液(BALF)中檢測出32株(29.6%),從肺組織中檢測出6株(5.6%),從胸腔積液中檢測出3株(2.8%)。

如圖1所示,108株諾卡菌分離株鑒定出10種菌種。排名前3位的諾卡菌菌種分別是皮疽諾卡菌38株(35.2%)、蓋爾森基興諾卡菌35株(32.4%)和膿腫諾卡菌12株(11.1%)。這些最常被分離出的諾卡菌種占總株數的78.7%(85/108)。

圖1 中日友好醫(yī)院諾卡菌病患者的諾卡菌菌屬的菌種分布

2.2合并兩種諾卡菌感染患者的臨床特征 106例患者中有2例患者同時檢出兩種諾卡菌菌種。病例1:65歲男性,有20年吸煙史,患小細胞肺癌4個月,于2021年4月入住中日友好醫(yī)院。患者在接受了4個周期的化療后咳黃色膿痰。采集患者的痰標本和BALF,痰標本在血平板上培養(yǎng)出了蓋爾森基興諾卡菌和皮疽諾卡菌,BALF標本僅檢出蓋爾森基興諾卡菌。病例2:72歲女性,因支氣管擴張和肺部感染而就診。其BALF的革蘭染色和改良抗酸染色的鏡檢結果均顯示為分支狀、串珠狀桿菌。常規(guī)血平板培養(yǎng)也有銅綠假單胞菌的生長。痰標本與BALF標本通過BACTEC MGIT BD 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)均鑒定出膿腫諾卡菌和蓋爾森基興諾卡菌。為進行比較,將這兩例諾卡菌合并感染患者與以往研究中[11-12]的兩例合并感染患者的人口統(tǒng)計學特征列于表1中。

表1 4例合并兩種諾卡菌感染患者的臨床特征

2.33例肺移植患者的臨床特征 肺移植患者的臨床特征列于表2中。其中有兩例感染皮疽諾卡菌,另1例合并感染結核分枝桿菌和新諾卡菌。在本研究期間,本院肺移植受者共有303例,其諾卡菌病感染率為1.0%(3/303)。

表2 3例肺移植患者的臨床特征

2.4抗菌藥物敏感性特征 所有諾卡菌菌株均對利奈唑胺呈現100.0%敏感,僅有2.6%(1/38)的皮疽諾卡菌對TMP-SMZ耐藥。但60.0%(3/5)南非諾卡菌、2.7%(1/37)皮疽諾卡菌和80.0%(4/5)華萊士諾卡菌顯示對阿米卡星耐藥。108株諾卡菌對常用的磺胺類藥物替代品阿莫西林/克拉維酸和米諾環(huán)素的敏感率分別為33.9%、42.6%。本研究中的諾卡菌菌株對大環(huán)內酯類藥物,例如對克拉霉素的耐藥率則高達67.6%;而對β-內酰胺類抗菌藥物例如碳青霉烯類藥物和第3代頭孢菌素的敏感率和耐藥率則有高度的種屬特異性。

皮疽諾卡菌作為呼吸道標本中最常被檢測到的諾卡菌菌種,其對克拉霉素和頭孢曲松的耐藥率分別為94.7%、65.8%。但其對氟喹諾酮類藥物的耐藥率較低,對環(huán)丙沙星的耐藥率為15.8%,對莫西沙星的耐藥率則為0.0%。見表3。

表3 下呼吸道感染主要諾卡菌菌種對15種抗菌藥物的藥敏譜及MIC值

3 討 論

諾卡菌病是一種由諾卡菌感染引起的機會性感染性疾病[1]。諾卡菌可感染免疫力低下人群,也可以感染免疫功能正常的人群,不同諾卡菌菌種感染可表現為不同的臨床特征[1,13]。但諾卡菌病最常累及人體的部位是肺部,通常是由呼吸道吸入諾卡菌而獲得感染[1,14]。目前關于從中國肺諾卡菌病患者中分離出的諾卡菌菌種分布及其對抗菌藥物敏感性情況的實驗室和臨床數據較少[8,15]。

同時,由于缺乏高效、便捷的診斷方法,諾卡菌臨床微生物學檢測與診斷仍然是一個挑戰(zhàn)。諾卡菌在常規(guī)培養(yǎng)基上生長通常需要3～14 d,一般可在3～5 d后觀察到形態(tài)典型的菌落。諾卡菌生長緩慢的特點使得常規(guī)實驗室檢測方法檢測效果不佳,因此諾卡菌病有很大可能會被漏診甚至誤診[2]。在諾卡菌病患者中不同細菌的混合感染是很常見的,諾卡菌可以與其他細菌或真菌同時感染宿主,而這會進一步拉低諾卡菌的檢出率[2,11]。而在過去的十幾年中,因為免疫抑制狀態(tài)人群的增加與對該菌認識的加深,諾卡菌病病例數大幅增加[16]。

目前的研究已證實超過50種諾卡菌菌種可導致人類諾卡菌病[3,17]。本研究結果表明皮疽諾卡菌、蓋爾森基興諾卡菌和膿腫諾卡菌是最常分離的3種菌種,這也與之前的研究結果一致[9]。其中皮疽諾卡菌是主要的致病性菌種,可引起播散性諾卡菌病[2]。

實體器官移植受者(SOTR)由于其自身T細胞介導地對外來微生物的免疫應答反應被削弱,因此往往更易感染諾卡菌[16-17]。在SOTR中,諾卡菌感染率最高的是肺移植受者,其部分原因可能為呼吸道吸入是諾卡菌感染的主要途徑,因此與其他器官移植受者相比,肺移植受者的免疫抑制情況更嚴重。本研究所在的中日友好醫(yī)院是我國最大的肺移植中心之一,與之前的數據一致的是,肺移植受者的諾卡菌在3年內的感染率為1.0%。相比之下,其他國家的大型回顧性研究顯示肺移植受試者中諾卡菌感染率為3.5%[18]、1.9%[19]和1.78%[20]。

在抗菌藥物治療方面,由于缺乏隨機試驗使得最佳方案尚不明確,但應根據所鑒定的諾卡菌菌種和藥敏結果給予最合適的抗菌藥物治療方案。既往研究觀察到抗菌藥物敏感性在一些諾卡菌菌種或復合群中具有種屬特異性[6,21]?？芍虏≈Z卡菌菌種的抗菌藥物敏感性因其固有的或獲得性的耐藥機制不同而存在很大差異[2,10]。即使無法得知抗菌藥物敏感性試驗結果,諾卡菌菌種的準確鑒定結果也有助于臨床決策。目前已明確 TMP-SMZ是諾卡菌病的最佳抗菌治療用藥[2,17,22],而如果患者存在磺胺類藥物過敏或耐藥的情況,也可考慮使用其他抗菌藥物[23]。在本研究中,皮疸諾卡菌仍然對TMP-SMZ(97.4%)、利奈唑胺(100.0%)和阿米卡星(97.3%)高度敏感。目前已證實利奈唑胺對諾卡菌病治療有效,且與其他一線治療藥物一樣安全,在單獨用藥或與TMP-SMZ等其他抗菌藥物聯合用藥治療播散性諾卡菌病的經驗治療方案中可作為首選藥物[24]。在本研究中,皮疸諾卡菌對利奈唑胺的藥物敏感性為100.0%,與之前的描述相似[6,21]。阿米卡星對大多數諾卡菌菌種表現出優(yōu)異的體外活性,已成功用于患有播散性諾卡菌病的老年或免疫抑制患者,但由于其對感染部位的滲透性相對較低,很少單獨應用。本研究中僅有8株阿米卡星耐藥分離諾卡菌株(7.5%),與之前報道的結果相對一致[1,7,12]。

綜上所述,本文介紹了中日友好醫(yī)院肺部諾卡菌感染的流行病學和諾卡菌菌株的抗菌藥物敏感特征。本研究可以幫助臨床醫(yī)生了解下呼吸道感染中諾卡菌菌種分布的多樣性和抗菌藥物耐藥性特征,并有助于醫(yī)生在經驗性治療的背景下做出正確決策。