角茴香醇提顆粒對(duì)H1N1 亞型流感病毒的體內(nèi)抑制作用

陳召亮，張 誠(chéng)，崔 歡，蒲 劼，張 磊，郭振東，劉聚祥

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；4.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

A 型流感病毒又稱為甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV），是威脅人類健康的主要傳染病原之一，因其常導(dǎo)致季節(jié)性流感疫情的發(fā)生而受到廣泛研究［1-2］。自IAV 出現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)傳播，不僅造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還嚴(yán)重威脅到了全球公眾健康［3］。

中藥在預(yù)防和治療傳染性疾病上，有著悠久的歷史，許多經(jīng)典方劑，如麻杏石甘湯、銀翹散等，對(duì)于治療流感都有著良好的效果［4］。種類繁多的中藥被廣泛應(yīng)用于流感病毒及流感病毒性肺炎的基礎(chǔ)和臨床研究，是抗病毒藥物研發(fā)的重要資源［5］。在眾多研究成果中，許多中藥已顯示出一定的療效，但仍需要更多高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和臨床對(duì)照研究，從而進(jìn)一步開(kāi)發(fā)流感的治療藥物［6］。

中藥角茴香為罌粟科（Papaveraceae），角茴香屬（Hypecoum erectumL.）植物細(xì)果角茴香（Hypecoum leptocarpumHook.f.et Thoms.，HL）或直立角茴香（H.erectumL.）的干燥全草，是一種地區(qū)性習(xí)用藥材，常在少數(shù)民族地區(qū)作為藏藥和蒙藥使用，作為藏藥時(shí)，普遍以細(xì)果角茴香入藥，又稱巴爾巴達(dá)［7］。角茴香含有多種生物堿，其具備多種生物學(xué)活性，如抗炎作用［8］、鎮(zhèn)痛作用［9］、抗菌作用［10］。角茴香能夠作為流感治療藥物使用，這在我國(guó)多部中藥相關(guān)典籍中均有提示，如《西藏常用中草藥》中記載，其可治傷風(fēng)感冒、頭痛，可解食物中毒［11］；《中華本草》稱其能治感冒發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛［12］。有研究證實(shí)，角茴香水提物對(duì)MDCK 細(xì)胞中的H3N8 亞型流感病毒具有明顯的抑制作用，可以在體外顯著降低流感病毒的感染性［13］。然而，角茴香及其活性成分在體內(nèi)對(duì)流感病毒的影響作用鮮有報(bào)道。

因此，本研究使用A/PR/8/33（H1N1）流感病毒接種BALB/c 小鼠，建立流感病毒感染小鼠模型，并使用不同濃度的細(xì)果角茴香醇提顆粒劑藥液給藥治療，通過(guò)多種指標(biāo)評(píng)價(jià)角茴香醇提顆粒劑對(duì)小鼠體內(nèi)流感病毒的抑制作用及對(duì)流感病毒感染小鼠的治療效果，以期為新型抗流感藥物研發(fā)相關(guān)研究提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與病毒毒株 BALB/c 小鼠，雌性，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；9 日齡無(wú)特定病原體（SPF）雞胚，購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

甲型流感病毒，A/PR/8/33（H1N1），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所保存，并在9 日齡SPF雞胚中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增之后，測(cè)定其在MDCK 細(xì)胞中50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）和在BALB/c 小鼠中的半數(shù)致死量（LD50）。TCID50和LD50通過(guò)Reed-Muench 方法計(jì)算得到。

1.1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 角茴香醇提顆粒（HL），將細(xì)果角茴香原生藥材使用乙醇回流提取、濃縮，并經(jīng)流化床制粒制備得到，由保定厚棋生物科技有限公司制備完成。每1.0 g 顆粒相當(dāng)于原生藥材1.50 g。奧司他韋，購(gòu)自阿拉丁生化科技有限公司（中國(guó)上海）。

BioFlux Simply P 總RNA 提取試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司；Prime Script? RT 試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司（美國(guó)）；Elisa 試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度角茴香醇提顆粒藥液的制備 分別稱量1.665、0.832 和0.416 g 的醇提顆粒溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）后，加熱，攪拌直至完全溶解。使用0.22 μm 的1 次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，分別制備得到質(zhì)量濃度為16.65、8.32 和4.16 mg/mL 的高、中、低濃度角茴香醇提顆粒藥液。

1.2.2 小鼠的感染與治療 參考BALB/c 小鼠的流感病毒感染模型［14-15］。建模前，將小鼠隨機(jī)進(jìn)行分組，分為空白對(duì)照組（NC）、病毒對(duì)照組（NC）、奧司他韋對(duì)照組（OS）、低劑量治療組（HL-L）、中劑量治療組（HL-M）和高劑量治療組（HL-H），共6 組。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，滴鼻接種H1N1 亞型流感病毒，50 μL/只（2 LD50/50 μL），由此建立得到流感病毒感染小鼠模型。

除空白對(duì)照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當(dāng)天開(kāi)始給藥治療。其中，HL-L、HL-M、HL-H 治療組小鼠分別使用低、中、高濃度的角茴香醇提顆粒藥液給藥治療，100 μL/只；奧司他韋對(duì)照組小鼠使用奧司他韋治療，治療劑量參考先前的報(bào)道，以5 mg/mL 的濃度在PBS 中進(jìn)行稀釋，以20 mg/kg 的劑量給藥治療［16］；病毒對(duì)照組小鼠使用PBS 作為對(duì)照，100 μL/只。給藥方式均為灌胃給藥，1 天1 次，并在每天的同一時(shí)間進(jìn)行給藥。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與樣品采集

1.3.1 體重變化率、發(fā)病率和小鼠存活率 將60 只雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分為6 組，分組方式如前所述，每組10 只。除空白對(duì)照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當(dāng)天開(kāi)始給藥治療，連續(xù)治療5 d。并于給藥治療后，每天對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重，記錄小鼠的發(fā)病率、體重、存活數(shù)，連續(xù)記錄14 d。

1.3.2 肺指數(shù)及肺臟中的病毒滴度變化 將120 只

BALB/c 小鼠隨機(jī)分為6 組，分組方式如前所述，每組20 只。除空白對(duì)照組以外，其余各組小鼠在建立流感病毒感染小鼠模型2 h 后，于感染當(dāng)天開(kāi)始給藥治療，連續(xù)治療5 d。各組分別于感染后第3、5、7 天隨機(jī)取5 只小鼠，記錄體重。采集小鼠肺臟，稱重，計(jì)算肺指數(shù)（肺指數(shù)=肺臟重量/小鼠體重）。之后，將采集得到的小鼠肺臟組織分成3 部分，第一部分用于研磨、勻漿后測(cè)定其病毒滴度（TCID50），病毒滴度（TCID50）采用Reed-Muench 法計(jì)算；第二部分用于觀察病理組織學(xué)變化；第三部分用于提取RNA，并進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定。

1.3.3 肺組織病理變化 將上述所采集到的小鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，至少24 h。之后，使用石蠟包埋組織樣品，并將樣品切成4 mm厚的切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織樣品的病理變化。

1.3.4 血液指標(biāo)的變化 各組分別于感染后第3、5、7 天隨機(jī)取5 只小鼠，在采集肺臟之前，于全麻狀態(tài)下采集小鼠EDTA 抗凝血液。EDTA 抗凝血液用于血常規(guī)檢測(cè)，按照全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的說(shuō)明書，對(duì)采集的小鼠血液進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析不同組小鼠的血細(xì)胞差異。

1.3.5 肺臟中細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 表達(dá)水平變化

對(duì)于細(xì)胞因子的檢測(cè)，同樣使用上述所采集得到的小鼠肺組織。根據(jù)Simply P 總RNA 提取試劑盒提供的方法提取小鼠肺組織的總RNA，之后使用Prime ScriptTMRT試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。然后使用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix 試劑盒，利用染料法qPCR 測(cè)定小鼠肺組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的mRNA表達(dá)水平，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。目標(biāo)基因所需的引物均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成，各特異性引物的序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

qPCR 在ABI 7500 快速實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。肺組織中各細(xì)胞因子的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算得到。

1.3.6 血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平變化 各組分別于感染后第3、5、7 天隨機(jī)取5 只小鼠，在采集肺臟之前，全麻狀態(tài)下采集小鼠普通非抗凝血液。普通非抗凝血液用于收集血清。根據(jù)試劑盒的操作要求，測(cè)定各血清樣本中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。組間比較通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）。差異顯著性標(biāo)志按照如下方式表示。

與空白對(duì)照組相比：###P＜0.001，##P＜0.01；與病毒對(duì)照組相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 角茴香對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用

連續(xù)14 d 觀察和記錄6 組小鼠（NC 組、VC 組、OS 組、HL-L 組、HL-M 組和HL-H 組）的發(fā)病率、存活率和體重變化情況，以確定HL 對(duì)IAV 感染小鼠的保護(hù)作用（圖1）。

圖1 角茴香對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用Fig.1 Protective effect of HL on influenza virus-infected mice

在整個(gè)研究觀察期間，HL-H 組小鼠的表現(xiàn)反映出了良好的保護(hù)作用。在感染后第1 天，病毒對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，如活動(dòng)量減少，皮毛豎起，呼吸急促。而奧司他韋對(duì)照組和HL-H 組分別在病毒對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀的2 d 和3 d 后才出現(xiàn)臨床癥狀。相比于病毒對(duì)照組，HL-L 組和HL-M 組也延遲了臨床癥狀的出現(xiàn)時(shí)間。

病毒對(duì)照組小鼠在感染后第4天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，到第10 天全部死亡。而奧司他韋對(duì)照組和HL-H 組分別在感染后第5 天和第6 天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，直到觀察期結(jié)束，小鼠仍有存活，保護(hù)率為60%。HL-M組和HL-L 組也減少了流感病毒感染小鼠的死亡數(shù)量，保護(hù)率分別為50%和30%。

空白對(duì)照組小鼠在整個(gè)試驗(yàn)期間，體重呈上升趨勢(shì)。病毒對(duì)照組小鼠在存活期間，體重持續(xù)下降，下降幅度約為20%。奧司他韋對(duì)照組和3 個(gè)治療組（HL-L 組、HL-M 組和HL-H 組）的小鼠體重呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，體重?fù)p失均小于病毒對(duì)照組。

2.2 小鼠肺臟中的病毒滴度及肺指數(shù)的變化

測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺部的病毒滴度和肺指數(shù)，以研究HL 對(duì)IAV 感染小鼠肺部的保護(hù)作用，結(jié)果如下（圖2 和圖3）。在感染后第5 天，病毒對(duì)照組的病毒滴度和肺指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組。與病毒對(duì)照組相比，奧司他韋對(duì)照組和3 個(gè)治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的肺指數(shù)和病毒滴度均有不同程度的降低，其中，奧司他韋對(duì)照組和HL-H組的降低程度最為明顯。這說(shuō)明HL-H 和奧司他韋對(duì)IAV 感染小鼠肺部的保護(hù)作用較為突出。

圖2 感染后不同時(shí)間的小鼠肺部病毒滴度Fig.2 Lung virus titers in mice at different times after infection

圖3 感染后不同時(shí)間的小鼠肺指數(shù)Fig.3 Lung indiex of mice at different times after infection

在感染后的第3 天和第7 天，各組變化趨勢(shì)與感染后第5 天大致相同，但變化程度均沒(méi)有感染后第5 天明顯。

2.3 HL 對(duì)IAV 感染小鼠肺部炎癥的抑制作用

由小鼠感染后不同時(shí)間點(diǎn)的肺臟中病毒滴度及肺指數(shù)變化可知，在小鼠感染后第5 天，HL 各治療組有著最佳的治療效果。對(duì)感染后第5 天的各組小鼠肺部進(jìn)行HE 染色，其組織學(xué)變化如下（圖4）。

圖4 對(duì)小鼠肺部的病理觀察（200×）Fig.4 Pathological observation of the lung in mice

空白對(duì)照組小鼠肺部無(wú)明顯病理變化，而病毒對(duì)照組小鼠肺部出現(xiàn)明顯的肺泡壁增厚（綠色箭頭）、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭）、上皮細(xì)胞壞死（黑色箭頭）等病理?yè)p傷現(xiàn)象。而奧司他韋和HL 可以顯著改善這些組織損傷。HL-H 組和奧司他韋對(duì)照組的肺部損傷減少最為明顯，對(duì)肺部炎癥反應(yīng)的抑制作用最強(qiáng)。

2.4 HL 對(duì)IAV 感染小鼠血液指標(biāo)的改善

對(duì)感染后第5 天的各組小鼠進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果如下（圖5）。與空白對(duì)照組相比，病毒對(duì)照組的4 種血細(xì)胞水平均顯著下降。相較于病毒對(duì)照組，奧司他韋對(duì)照組和3 個(gè)治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的4 種血細(xì)胞均有所上升，其中，奧司他韋對(duì)照組和HL-H 組的上升最為顯著。

圖5 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Routine blood results of mice

2.5 細(xì)胞因子的表達(dá)水平

2.5.1 肺組織中細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 表達(dá)水平 本研究對(duì)感染后第5 天的小鼠肺組織中細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 的表達(dá)水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）進(jìn)行了檢測(cè)。

小鼠肺組織中的細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 表達(dá)水平如圖6 所示，病毒對(duì)照組的TNF-α、IL-1β 和IL-6均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。而奧司他韋對(duì)照組和3 個(gè)治療組（HL-L、HL-M、HL-H）能有效抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 的升高，其中奧司他韋對(duì)照組和HL-H 組的效果最為明顯。

圖6 角茴香醇提顆粒對(duì)小鼠肺部細(xì)胞因子相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effect of HL on cytokine-related mRNA expression in mouse lung

2.5.2 血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平 血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6）如圖7所示。病毒對(duì)照組小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組。而與病毒對(duì)照組相比，奧司他韋對(duì)照組和3 個(gè)治療組（HL-L、HL-M、HL-H）的小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)都受到了不同程度的抑制，其中奧司他韋對(duì)照組和HL-H 組對(duì)血清中細(xì)胞因子的抑制作用最為明顯。

圖7 角茴香對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.7 Effect of HL on cytokine expression in mouse serum

3 結(jié)論與討論

甲型流感病毒（IAV）可在人和動(dòng)物中引起季節(jié)性或大流行性流感，始終威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全［2］。IAV 可以通過(guò)抗原漂移、基因重組等方式不斷進(jìn)化和變異，進(jìn)而形成新的耐藥毒株［17］。目前針對(duì)IAV 的藥物治療，主要包括美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的兩類抗流感藥物：神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAIs）如奧司他韋和M2 通道阻斷劑，但后者卻已經(jīng)因普遍耐藥而停止使用［18-19］。同時(shí)，病毒表面抗原的不斷變化也常常是造成大流行的主要原因［20］。因此，新型抗流感藥物的研發(fā)及抗病毒相關(guān)機(jī)制的研究是十分必要的。

角茴香作為一種傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等多種功能，可用于治療多種疾病如感冒、肺炎、肝炎、膽囊炎等［21］。本研究中，角茴香醇提顆粒表現(xiàn)出了對(duì)小鼠體內(nèi)IAV 的明顯抑制作用，并對(duì)流感病毒感染小鼠有著顯著的保護(hù)作用。流感病毒感染小鼠在經(jīng)過(guò)角茴香醇提顆粒劑的治療后，發(fā)病時(shí)間推遲，存活率升高，體重?fù)p失減少。同時(shí)，角茴香醇提顆粒對(duì)小鼠的保護(hù)作用與濃度有關(guān)。分析結(jié)果可知，隨著角茴香醇提顆粒治療劑量的增加，小鼠的保護(hù)率隨之增加。高濃度角茴香醇提顆粒劑對(duì)流感病毒感染小鼠的治療效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物奧司他韋相當(dāng)。角茴香醇提顆粒劑在降低小鼠肺部病毒滴度的同時(shí)，也減輕了IAV 對(duì)小鼠肺臟的病理?yè)p害和IAV導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，在急性肺損傷的治療中發(fā)揮了作用。

動(dòng)物機(jī)體在受到IAV 感染后，體內(nèi)的細(xì)胞因子水平會(huì)產(chǎn)生一定的變化，當(dāng)細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)時(shí)，過(guò)多的促炎細(xì)胞因子則會(huì)導(dǎo)致形成不受機(jī)體控制的細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致肺臟及其他器官的損傷、全身炎癥，甚至死亡［22］。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)水平是治療流感病毒感染的重要手段［5］。細(xì)胞因子的過(guò)度釋放——細(xì)胞因子風(fēng)暴與病毒性肺炎常常是引起重癥流感患者呼吸系統(tǒng)損傷與死亡的重要原因［23］。盡管細(xì)胞因子在抑制病毒復(fù)制方面是必不可少的，但某些促炎細(xì)胞因子不受控制的表達(dá)，會(huì)加劇疾病的發(fā)展和機(jī)體的損傷［5,24］。機(jī)體感染IAV后，TNF-α、IL-1β 和IL-6 是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度的關(guān)鍵細(xì)胞因子［1］。TNF-α 的過(guò)度表達(dá)常常是流感病毒導(dǎo)致肺部病理?yè)p害的原因之一［25］。在本研究中，通過(guò)RT-qPCR 及ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)了各組小鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)角茴香醇提顆粒劑的治療后，流感病毒感染小鼠肺臟及血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)水平明顯下降。角茴香醇提顆?？梢灶A(yù)防IAV 感染引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴。

綜上所述，角茴香醇提顆粒能明顯抑制小鼠體內(nèi)H1N1 亞型IAV 的活性，減輕IAV 引起的肺部病理?yè)p傷，緩解肺部的炎癥反應(yīng)。中藥角茴香是一種潛在的新型抗流感病毒藥物。