牛DSCAM 基因的基因組印記和DNA 甲基化狀態(tài)分析

靳蘭杰，霍浩楠，張銀蛟，李冬杰，陳瑋娜，張 萃，李世杰

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071000；2.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院, 河北石家莊 050018；3.河北大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

基因組印記是指哺乳動(dòng)物在發(fā)育過(guò)程中，一小部分基因表現(xiàn)為親本特異性的單等位基因表達(dá)的表觀遺傳過(guò)程［1］。印記基因在胚胎和胎盤的發(fā)育，以及出生后的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。印記基因的表達(dá)受表觀遺傳修飾的調(diào)控，大部分印記基因受DNA 甲基化的調(diào)控，即親本等位基因間形成一個(gè)差異甲基化區(qū)（Differentially methylated regions, DMRs），其發(fā)生在配子發(fā)生期并在整個(gè)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中穩(wěn)定遺傳［2］。

有一些印記基因參與調(diào)控神經(jīng)發(fā)育過(guò)程和行為［3］，其表達(dá)紊亂會(huì)導(dǎo)致語(yǔ)言、社會(huì)認(rèn)知和神經(jīng)行為障礙，例如：14q32 染色體的父系單父二體（UPD）的過(guò)度表達(dá)或表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致面部畸形；11q15.5染色體的母系等位基因過(guò)表達(dá)和父系等位基因的缺失同時(shí)發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致羅素銀綜合征（Russell-silversyndrome, RSS）［4］。唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子（Down syndrome cellular adhesion molecule,DSCAM）基因由于最早在人類染色體21q22 上的唐氏綜合征區(qū)域發(fā)現(xiàn)而得名［5］。DSCAM基因編碼1 種免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，參與樹突形態(tài)和神經(jīng)元的連接，在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立過(guò)程中起重要作用［6-7］。人DSCAM基因?yàn)槟冈从∮浕?。牛是一種重要的經(jīng)濟(jì)家畜物種，與人類和小鼠相比，在牛中被鑒定的印記基因數(shù)量相對(duì)較少。目前牛DSCAM基因的印記狀態(tài)和調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。本研究先應(yīng)用基于SNP 的方法分析DSCAM基因在成年牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦等組織以及胎盤中的印記狀態(tài)，進(jìn)而分析DSCAM基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化狀態(tài)，揭示DNA 甲基化在調(diào)控牛DSCAM基因印記表達(dá)中的作用，以期為進(jìn)一步研究牛DSCAM基因的功能和印記相關(guān)的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品的采集

印記狀態(tài)分析包括成年荷斯坦奶牛的組織和胎盤。成年荷斯坦奶牛的組織取自河北省保定徐水某屠宰場(chǎng)，包括32 頭成年荷斯坦奶牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦等8 個(gè)組織；15 個(gè)成年荷斯坦奶牛的胎盤取自保定滿城某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，同時(shí)采集每個(gè)胎盤對(duì)應(yīng)的母源血液，用于人工受精的精子樣本購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司。標(biāo)記樣本并液氮冷藏，隨后將供試樣本置于-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

用RNAios plus 試劑盒（TaKaRa，大連）提取供試組織（心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦）和胎盤的總RNA，無(wú)RNA 酶DNase Ⅰ除去基因組DNA 污染；用UEIris ⅡRT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis（with dsDNase，US Everbright Inc，美國(guó)）試劑盒將純化后的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃凍存待用。

1.3 RT-PCR 擴(kuò)增

通過(guò)NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站查找牛DSCAM基因的mRNA 序列（Accession No.: XM_010801644.3），用UCSC Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/）分析基因結(jié)構(gòu)，Oligo 7.0 軟件針對(duì)DSCAM基因cDNA 序列設(shè)計(jì)引物F1和R1（表1），對(duì)供試組織和胎盤的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用跨內(nèi)含子的1 對(duì)引物GAPDH-F 和GAPDH-R 擴(kuò)增一段長(zhǎng)度為375 bp 的GAPDH（Accession NO.: BTU85042）片 段 作 為 內(nèi) 參。25 μL PCR 反應(yīng)體系：2.5 μL 10×LA Tap Buffer，2 μL 2.5 mmol/L/dNTPs，0.1 μL LA Taq DNA 聚合酶，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL（50 ng），ddH2O 補(bǔ)足25 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 用于SNP 鑒定，等位基因分析和DNA 甲基化的引物信息Table 1 Primers used in SNP identification, allelic expression and DNA methylation analysis

1.4 基因組DNA 提取及SNP 鑒定

用DNA 提取試劑盒（上海，生工）提取各種組織的基因組DNA。依據(jù)牛DSCAM基因的mRNA 序列（Accession No.: XM_010801644.3）在DSCAM基因第32 個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)引物F2 和F2（表1），PCR 擴(kuò)增一段長(zhǎng)為996 bp 的目的片段。PCR 反應(yīng)體系與RT-PCR 反應(yīng)體系基本相同，除將cDNA 模板換成基因組DNA，PCR 反應(yīng)程序同1.3（退火溫度50 ℃，延伸時(shí)間30 s），1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒（Omage，美國(guó)）回收，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。利用Chromas 2.1.3軟件查看測(cè)序結(jié)果，尋找重疊雙峰的SNP 位點(diǎn)確定雜合子個(gè)體。

1.5 印記狀態(tài)分析

利用跨內(nèi)含子31 的F1 和R1 引物對(duì)隨機(jī)選擇的3 頭雜合子牛的8 個(gè)組織以及3 個(gè)雜合子牛胎盤的RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物純化回收測(cè)序，確定印記狀態(tài)。若SNP 位點(diǎn)為雙峰，則基因?yàn)殡p等位基因表達(dá)；若SNP 位點(diǎn)為單峰，則基因?yàn)閱蔚任换虮磉_(dá)；需進(jìn)一步通過(guò)PCR 擴(kuò)增父本的精子和母本全血，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序確定親本的基因型。

1.6 等位基因特異性DNA 甲基化分析

用DNA 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒處理牛單等位基因表達(dá)的組織，胎盤和精子的DNA 模板。用MethPrimer 在線軟件預(yù)測(cè)牛DSCAM基因富含CpG 的啟動(dòng)子區(qū)并轉(zhuǎn)化序列，根據(jù)轉(zhuǎn)換后的序列設(shè)計(jì)甲基化特異性的半巢氏PCR 引物（表1）。將pMD19-T 載體（TAKARA）與二次擴(kuò)增的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，隨后向連接產(chǎn)物中加入20 μL 大腸桿菌DH5α 的感受態(tài)細(xì)胞和500 μL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床內(nèi)200 r/min 搖菌培養(yǎng)40 min。向培養(yǎng)好的菌液中按4∶25 的比例分別加入4 μL IPTG（200 ng/μL）和25 μL X-gal（20 mg/μL），混合均勻后涂到含有氨芐青霉素（100 mg/mL）的固體LB 培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10 h。次日挑取陽(yáng)性克隆于加有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。以培養(yǎng)好的菌液為模板，利用特異性甲基化內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將培養(yǎng)好的菌液測(cè)序后，分析CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，甲基化的CpG 位點(diǎn)的C 不發(fā)生變化，而非甲基化的CpG 位點(diǎn)的C 是則變成T。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛DSCAM 基因在組織中的表達(dá)分析

利用分別位于外顯子31 和32 的引物F1 和R1擴(kuò)增得到1 條長(zhǎng)度為385 bp 的條帶（圖1）；進(jìn)一步回收測(cè)序，確定為目的條帶，表明DSCAM基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦以及器官胎盤中均有表達(dá)。

圖1 牛DSCAM 基因在被檢測(cè)的組織和胎盤中表達(dá)Fig.1 The expression levels of DSCAM in different tissues and placenta of cattle

2.2 牛DSCAM 基因編碼區(qū)SNPs 的鑒定

用位于DSCAM基因第32 外顯子上的F2 和R2 引物擴(kuò)增成年牛肝臟和胎盤組織基因組DNA，在996 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物上發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)A/G 雜合位點(diǎn)（rs136908595）（圖2）。在個(gè)體與胎盤中鑒定出的雜合子與純合子的比例分別為2∶5 和2∶3。

圖2 牛DSCAM 基因SNP 的鑒定Fig.2 Identification of SNP in bovine DSCAM gene

2.3 DSCAM 基因在牛組織中的等位基因表達(dá)的分析

利用跨內(nèi)含子31 引物F1 和R1 對(duì)3 個(gè)雜合子牛的組織RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，回收長(zhǎng)度為385 bp 的目的片段并測(cè)序。結(jié)果表明在8 個(gè)組織的測(cè)序圖譜中，SNP 位點(diǎn)（rs136908595）處均為雙峰（圖3），說(shuō)明DSCAM基因在牛組織中為雙等位基因表達(dá)。

圖3 牛DSCAM 基因在不同組織中的等位基因表達(dá)Fig.3 Allelic expression of bovine DSCAM gene in different tissues

2.4 DSCAM 基因在牛胎盤中的印記狀態(tài)

利用F1 和R1 引物對(duì)3 個(gè)具有A/G 雜合位點(diǎn)胎盤（3501、1-12、3-7）的cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)3 個(gè)雜合子牛胎盤的SNP 位點(diǎn)（rs136908595）處均為單峰A，說(shuō)明DSCAM基因在胎盤中為單等位基因表達(dá)（圖4）。進(jìn)一步對(duì)3個(gè)雜合子胎盤所對(duì)應(yīng)的父源精子和母親血液的基因型進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)胎盤的母本基因型均為AA 純合，而父本基因型為GG 純合（圖4），說(shuō)明牛DSCAM基因在胎盤中為父源印記基因。

圖4 牛DSCAM 基因在胎盤中的母源等位基因表達(dá)Fig.4 Maternal expression of bovine DSCAM gene in placenta

2.5 牛DSCAM 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)

為分析牛DSCAM基因的胎盤特異性印記是否受DNA 甲基化的調(diào)控，對(duì)第一個(gè)外顯子的5'端上游3 000 bp 和3'端下游2 000 bp 進(jìn)行CpG 島預(yù)測(cè)，分析了包括第一個(gè)外顯子在內(nèi)的402 bp 片段中13個(gè)CpG 位點(diǎn)在腎、大腦、脾、胎盤、精子中的甲基化狀態(tài)（圖5A），將純化后產(chǎn)物部分用于直接測(cè)序，剩余部分用于克隆測(cè)序。在直接測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 個(gè)SNP （rs453315548，A/G）位點(diǎn)來(lái)區(qū)分親本（A 鏈和G 鏈）。根據(jù)克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胎盤1的G 鏈的甲基化水平為100%，A 鏈的甲基化水平為2.5%；胎盤2 中G 鏈的甲基化水平為100%，A鏈的甲基化水平為1.2%，2 個(gè)胎盤的G 鏈平均甲基化水平（100%）明顯高于A 鏈的平均甲基化水平（1.9%）。表明在單等位基因表達(dá)的胎盤1 和胎盤2 中，該區(qū)域存在明顯的差異甲基化區(qū)。在腎中A 鏈的甲基化水平為97%，G 鏈的甲基化水平為99%；在大腦中A 鏈的甲基化水平為99%，G 鏈的甲基化水平為100%，在脾中A 鏈的甲基化水平為97%，G 鏈的甲基化水平為100%。在所檢測(cè)的3 個(gè)組織中，A 鏈的平均甲基化水平接近于G 鏈的甲基化水平，表明在雙等位基因表達(dá)的腎臟、大腦中，該區(qū)域不存在明顯的差異甲基化區(qū)，同時(shí)精子中為完全重甲基化狀態(tài)（圖5B）。以上結(jié)果推斷，DNA 甲基化可能修飾參與調(diào)控牛DSCAM基因的胎盤特異性印記。

圖5 DSCAM 基因結(jié)構(gòu)及CpG 島甲基化狀態(tài)Fig.5 DSCAM gene structure and CpG island methylation status

3 結(jié)論與討論

在哺乳動(dòng)物中，由表觀遺傳修飾決定的親本特異性的單等位基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為基因組印記，這種具有親本特異性單等位表達(dá)的基因稱為印記基因［8］。迄今為止，在人類和小鼠中分別鑒定出112［9］和186［10-11］個(gè)印記基因，而在牛中，被發(fā)現(xiàn)的印記基因僅為49 個(gè)［12］。牛作為一種重要的經(jīng)濟(jì)家畜物種，因其發(fā)育模式與人類植入前胚胎發(fā)育相似，繼而成為一種潛在的研究模型［13］。印記基因的表達(dá)異常不僅會(huì)引起胚胎和胎盤的發(fā)育異常，還與家畜的一些經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)，例如母系印記基因callipyge調(diào)控綿羊的后群肌肉肥大［14］，數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）的印記調(diào)控豬背膘厚度，眼肌高度和肌內(nèi)脂肪含量［15］。

DSCAM基因位于人類唐氏綜合征的相關(guān)區(qū)域［16］，是導(dǎo)致唐氏綜合征病因的1 個(gè)候選基因［17］。DSCAM蛋白是免疫球蛋白超家族中最大的成員之一，在哺乳動(dòng)物中高度保守［18］。本試驗(yàn)利用RTPCR 法揭示了DSCAM基因在成年牛組織以及胎盤廣泛表達(dá)。DSCAM基因在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)［17］，其過(guò)度表達(dá)和表達(dá)不足都會(huì)使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成異常。Agarwala 等人［19］利用Northern blot 印記雜交技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DSCAM基因在心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟和肌肉等非神經(jīng)元組織的表達(dá)僅僅發(fā)生在成年小鼠早期發(fā)育過(guò)程中；然而，在成年小鼠中其表達(dá)僅限于大腦［19］。

Khattabi 等人［20］采用高通量基因陣列對(duì)人類胎盤中新的印記基因進(jìn)行全基因組搜索，確定了DSCAM基因?yàn)槿祟?1 號(hào)染色體上的第一個(gè)印記基因，其表現(xiàn)為母源印記基因。然而，Dscam基因在小鼠的大腦和胎盤中為雙等位基因表達(dá)［20］。本研究中發(fā)現(xiàn)DSCAM基因在牛中表現(xiàn)為胎盤特異性的父源印記基因。由此可見，DSCAM基因在物種間的印記狀態(tài)存在差異。胎盤是哺乳動(dòng)物在妊娠期間母體和胎兒之間聯(lián)系的樞紐，胎盤功能障礙將導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限，甚至引起胎兒死亡［21］。許多印記基因表現(xiàn)為胎盤特異性，胎盤印記基因的表達(dá)紊亂，會(huì)破壞由胎盤介導(dǎo)的母體與胎兒的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，最終導(dǎo)致妊娠失敗［22］。

DNA 甲基化是一種研究廣泛且可穩(wěn)定遺傳的表觀遺傳修飾，是基因組印記建立和維持過(guò)程中重要的分子機(jī)制［23-24］。DNA 甲基化主要發(fā)生在富含CpG 二核苷酸的區(qū)域，該區(qū)域又稱之為CpG島。CpG 島通常位于基因的啟動(dòng)子、第一個(gè)外顯子以及第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。CpG 島是印記基因的重要標(biāo)記［25-26］。印記基因通常在CpG 島區(qū)域形成差異甲基化區(qū)（DMRs）來(lái)調(diào)控其表達(dá)［27-28］。有研究表明，在人DSCAM基因內(nèi)含子1 上存在1 個(gè)DMR 區(qū)，該DMR 區(qū)在母源等位基因上表現(xiàn)為重甲基化，調(diào)控該基因的印記狀態(tài)［20］。本研究中采用亞硫酸鹽測(cè)序法發(fā)現(xiàn)牛DSCAM基因啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)域含有1 個(gè)CpG 島，在DSCAM基因印記的胎盤中，該區(qū)域中存在1 個(gè)DMR 區(qū)，表明DNA 甲基化可能參與調(diào)控了牛DSCAM基因的胎盤特異性印記的發(fā)生。

DSCAM基因在牛中為父源印記基因，DSCAM基因啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)外顯子處的DMR 調(diào)控該基因在胎盤的特異性印記，可為深入探討牛DSCAM基因的功能和印記相關(guān)的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。