利用CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)建擬南芥AtDGK5基因的缺失表達(dá)突變體研究

郭 賀，賈羊羊，范玉國(guó)，李 君，潘延云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

細(xì)胞的肌醇磷脂信號(hào)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)動(dòng)植物發(fā)育和應(yīng)答刺激的經(jīng)典信號(hào)途徑。細(xì)胞受到刺激時(shí)，肌醇磷脂依賴的磷脂酶C（PI-PLC）被激活，分解膜組分二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），形成二脂酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）雙信使分子。動(dòng)物細(xì)胞中DAG 進(jìn)一步激活蛋白激酶C（PKC），同時(shí)啟動(dòng)鈣離子信號(hào)，完成胞外信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)換［1］；而植物細(xì)胞中則是DAG 進(jìn)一步被甘油二酯激酶（DGK）磷酸化形成磷脂酸（PA）來發(fā)揮作用。PA 目前被認(rèn)為是植物特有的新型第二信使分子，對(duì)植物DGK的生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制的闡釋也成為重要的研究領(lǐng)域［2］。

DGKs 是獨(dú)特而保守的脂類激酶家族。動(dòng)物細(xì)胞中，有10 個(gè)不同的DGKs基因，歸為5 個(gè)不同的亞型［3］。目前在植物的多個(gè)物種中檢測(cè)到DGKs基因，它們的結(jié)構(gòu)均與動(dòng)物中最簡(jiǎn)單的一種類型DGKε 型相似，都包含保守的DGK 催化激酶域。植物DGKs 根據(jù)序列同源性分為3 個(gè)簇［3］。擬南芥AtDGKs基因家族中有7 個(gè)成員，其中AtDGK1/2屬于簇 I，結(jié)構(gòu)上除了有激酶域外還有2 個(gè)C1 結(jié)構(gòu)域，以及1 個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜螺旋區(qū)，推測(cè)屬于膜蛋白；AtDGK3/4/7屬于簇II，AtDGK5/6屬于簇III，簇II和簇III 都只有保守的激酶域［3-4］。研究顯示，不同植物多種亞型的DGK 不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，還參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答響應(yīng),但這些結(jié)果多是基于對(duì)DGK表達(dá)水平的檢測(cè)，如8 個(gè)蘋果MdDGKs基因中6 個(gè)受到干旱和鹽脅迫及ABA的誘導(dǎo)［5］；3 個(gè)ZmDGKs基因表達(dá)受到干旱和冷脅迫的誘導(dǎo)［6］。利用突變體提供體內(nèi)證據(jù)的研究仍然以擬南芥為主，如關(guān)于擬南芥AtDGK5，研究發(fā)現(xiàn)該基因與AtDGK2和AtDGK3共同通過平衡體內(nèi)TAG 和PA 來調(diào)控耐寒性［7］；AtDGK5還在鞭毛蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物及微生物互作中早期免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用［8］。但是擬南芥AtDGKs家族參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及在抵御干旱和鹽脅迫中的作用，還需要深入的研究。

利用基因缺失表達(dá)的突變體為材料的反向遺傳學(xué)研究策略是詮釋基因功能的有效方法，目前擬南芥T-DNA 插入目的基因突變體庫(kù)仍然是研究基因功能的主要材料來源。由于同源基因之間存在功能冗余，所以往往需要通過雜交的方法獲得多重突變體方能根據(jù)表型進(jìn)行功能研究，但當(dāng)所需要研究的基因在同一條染色體上且距離較近時(shí)，則無法通過雜交獲得多重突變體；另外，插入的片段是否對(duì)植物產(chǎn)生影響也需要給予考慮和檢測(cè)。CRISPR/Cas9 技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)，該技術(shù)在植物中得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，彌補(bǔ)了上述限制，并且該技術(shù)產(chǎn)生的靶位點(diǎn)突變可以穩(wěn)定遺傳給下一代，也避免了因傳代過多造成的插入片段丟失問題。因此CRISPR/Cas9 技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用到各種突變體創(chuàng)制中［9］。

本實(shí)驗(yàn)室前期獲得了多種T-DNA 插入不同AtDGK基因的突變體，并且借助雜交獲得了不同組合的多重突變體。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AtDGK5基因的T-DNA插入突變體（SAIL_1212_E10）中，該基因仍有轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，推測(cè)可能是由于該突變體的T-DNA插入到內(nèi)含子區(qū)域所致。本研究擬通過CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得AtDGK5基因編輯的敲除突變體，以期為深入研究AtDGKs基因家族的生物學(xué)功能提供突變體材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，生態(tài)型為Columbia，Col）、農(nóng) 桿 菌（GV3101）、大 腸桿菌（Trans1-T1）、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)雙元載體pHEE401 和中間載體pCBC-DT1T2 質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存；Taq酶、限制性內(nèi)切酶和dNTP 為TaKaRa公司產(chǎn)品；引物合成和測(cè)序委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 雙靶點(diǎn)pHEE401-AtDGK5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在AtDGK5（基因號(hào)：At2g20900）第1 和第3個(gè)外顯子區(qū)域選擇2 段帶有PAM 區(qū)的序列作為靶位點(diǎn)，命名為sgRNA1 和sgRNA2；sgRNA2 靶位點(diǎn)處帶有PstI 酶切位點(diǎn)，供編輯效果的檢測(cè)（圖1）；利用四引物法構(gòu)建雙靶點(diǎn)基因敲除載體，參考文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行。引物序列見表1。以AtDGK5-2-F0、AtDGK5-2-BsF、AtDGK5-1-BsR 和AtDGK5-1-R0 為引物，pCBC-DT1T2 質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有雙靶位點(diǎn)的目的片段，同時(shí)也引入BsaI 酶切位點(diǎn)序列，PCR 條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s（38 個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 10 min; 12 ℃ 10 min。將目的片段和pHEE401均用BsaⅠ 酶切后連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得抗性菌落后用引物U626F 和AtDGK5-1-BsR（表1）進(jìn)行菌落PCR 鑒定，將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序鑒定，將驗(yàn)證無誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101 中，待轉(zhuǎn)化擬南芥。

圖1 AtDGK5 基因靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和pHEE401-AtDGK5 敲除載體的構(gòu)建Fig.1 Target site design for the AtDGK5 gene construction of pHEE401-AtDGK5 gene knockout vector

表1 載體構(gòu)建及鑒定引物Table 1 Primers used in this study

1.3 擬南芥的種植和遺傳轉(zhuǎn)化

擬南芥種子消毒及播種，參考文獻(xiàn)［11］方法進(jìn)行；擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，參照文獻(xiàn)［12］方法進(jìn)行，將含有重組質(zhì)粒的GV3101 分別轉(zhuǎn)化Col 和不同雜交組合的T-DNA 插入AtDGKs基因多重突變體中。

將獲得的目的編輯植株atdgk5分別播種于分別含有120 mmol/L NaCl、10% PEG 和0.5 μmol/L ABA 的1/2MS 固體培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率和幼苗生長(zhǎng)情況，分析編輯植株的表型和脅迫環(huán)境中的生長(zhǎng)變化。

1.4 轉(zhuǎn)基因編輯陽性苗的篩選和編輯基因的檢測(cè)

利用潮霉素抗性篩選收獲的T0代種子，10 d后選取潮霉素抗性幼苗，移栽后培養(yǎng)即T1代苗，繼續(xù)培養(yǎng)21 d，剪取幼苗葉片，以基因組DNA 為模板。以AtDGK5(CRISPR)-F/R（表1）為引物擴(kuò)增AtDGK5基因片段，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行PstI 酶切后電泳檢測(cè)，有未切開片段的陽性苗即為擬編輯植株，進(jìn)一步將未被切開的片段回收連接T 載體轉(zhuǎn)化Trans1-T1，選擇克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證基因被編輯情況。

1.5 外源DNA free 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

獲得AtDGK5基因被編輯的陽性苗后，進(jìn)一步通過自交獲得T2代植株，提取基因組DNA，以Cas9-F 和M13R 為引物（表1）進(jìn)行擴(kuò)增，未擴(kuò)增出條帶的陽性苗即為Cas9-free 編輯植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtDGK5 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和CRISPR/Cas9 基因編輯載體構(gòu)建

從TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥AtDGK5(At2g20900) 基因組DNA 序列和CDS 序列。根據(jù)CRISPR/Cas9 原理，設(shè)計(jì)了2 個(gè)19 bp 的序列作為靶位點(diǎn)，分別是第1 外顯子上的sgRNA1: 5'-CGCAGAATCTATCTTAACCTGG-3'和第3外顯子上的sgRNA2: 5'-GGAACAGATAGGACTGCAGTGG-3'（圖1a）。按照方法1.2，構(gòu)建的雙靶點(diǎn)基因敲除重組質(zhì)粒pHEE401-AtDGK5的結(jié)構(gòu)如圖1b 所示，四引物法擴(kuò)增獲得的目的片段與預(yù)期相符（圖1c），隨機(jī)挑取5 個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增片段與預(yù)期長(zhǎng)度吻合（圖1d）；之后挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，分別與2 個(gè)靶序列進(jìn)行比對(duì)，確定AtDGK5的敲除載體構(gòu)建成功。

2.2 AtDGK5 基因編輯敲除突變體atdgk5 的獲得

2.2.1 T1代陽性苗的獲得 將pHEE401-AtDGK5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥（Col），獲得T0代種子，經(jīng)潮霉素抗性篩選后共獲得22 株陽性苗。按照方法1.4 檢測(cè)AtDGK5是否被編輯，結(jié)果獲得16 株被編輯的陽性苗，如圖2a 所示，WT泳道為正常的基因擴(kuò)增片段經(jīng)PstI 酶切后的條帶，顯示該片段被完全切開。由于擴(kuò)增的AtDGK5片段為1 284 bp，而PstI 酶切位點(diǎn)該片段的中間位置，被切割片段分別為615 bp 和669 bp，2 個(gè)片段長(zhǎng)度相似，因此電泳只顯示出1 條帶；而有15 株陽性苗除了有1 條與正常AtDGK5同樣的酶切條帶，還有1 條1 284 bp 的條帶，說明這15 株苗的1 條同源染色體上sgRNA2靶位點(diǎn)因被編輯而破壞了酶切位點(diǎn)，是雜合突變體；而第11 株只有1 284 bp 的條帶，說明該株系為sgRNA2 靶位點(diǎn)編輯的純合突變體。

圖2 AtDGK5 基因編輯敲除突變體atdgk5 的獲得Fig.2 Acquisition of the AtDGK5 gene editing knockout mutant atdgk5

2.2.2 基因編輯效果分析 進(jìn)一步選擇第11 株和另外隨機(jī)2 株（第7、15 株）陽性苗進(jìn)行靶序列分析，測(cè)序結(jié)果顯示，第7 株的sgRNA1 靶位點(diǎn)未被編輯，sgRNA2 靶位點(diǎn)處缺失了1 個(gè)堿基（G）；第15 株的sgRNA1 靶位點(diǎn)未被編輯，sgRNA2 靶位點(diǎn)缺失2 個(gè)堿基（TG）。這2 株苗不僅因PstI 位點(diǎn)被編輯而失效，還造成了基因閱讀框的移碼，使得AtDGK5基因在第510 或531 個(gè)堿基處出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致原本能夠編碼509 個(gè)氨基酸的AtDGK5僅能編碼170 或176 個(gè)氨基酸；第11 株的sgRNA1靶位點(diǎn)插入了1 個(gè)堿基（A），在sgRNA2 靶位點(diǎn)處缺失了3 個(gè)堿基（圖2b），最終造成編碼閱讀框發(fā)生變化，在第282 堿基處出現(xiàn)終止密碼子，只能編碼94 個(gè)氨基酸。因此，后續(xù)試驗(yàn)以第11 株為材料，命名為atdgk5。

2.2.3 Cas9-free 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定 單株收獲atdgk5的T1代種子，播種T2代苗44 株，按照方法1.4 篩選，獲得了8 株Cas9-free 的植株，圖2d 顯示未擴(kuò)出Cas9 條帶的第2 株；進(jìn)一步從這8 株中選取6 株，擴(kuò)增目的基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到2 株靶位點(diǎn)均為編輯純合的植株，即AtDGK5基因編輯突變純合體植株（圖2c）。

2.3 atdgk5 的表型分析

在1/2 MS 培養(yǎng)基和分別含有120 mmol/L NaCl、10% PEG 的培養(yǎng)基中播種atdgk5和野生型擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)基中，atdgk5種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)與野生型擬南芥均相同，但在含120 mmol/L NaCl 的培養(yǎng)基中，播種2 d 后，atdgk5的種子萌發(fā)率較野生型高20.1%（P＜0.05）；在10 % PEG 下，播種1 d 后，種子萌發(fā)率較野生型低50.8%（P＜0.05），但幼苗生長(zhǎng)受抑制的程度與野生型相似（圖3a 和b）。這些結(jié)果表明AtDGK5參與植物應(yīng)答干旱和鹽脅迫反應(yīng)的生理過程。

圖3 atdgk5 單突在脅迫下的表型分析Fig.3 Phenotypic analysis of atdgk5 under stress

ABA 是參與滲透脅迫反應(yīng)的主要激素，對(duì)種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育都有抑制作用。檢測(cè)atdgk5在0.5 μmol/L ABA 下的種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)和四葉率的結(jié)果顯示（圖3），種子萌發(fā)率無顯著差異（P＞0.05），但幼苗生長(zhǎng)優(yōu)先出現(xiàn)和四葉率較野生型高43.7%（P＜0.05）且對(duì)ABA 不敏感（圖3c和d），該結(jié)果暗示了AtDGK5參與擬南芥對(duì)脅迫的應(yīng)答可能是依賴ABA 途徑的。

2.4 atdgk3457 多重突變體的獲得和生長(zhǎng)表型觀察

AtDGKs家族有7 個(gè)成員，同源基因之間的互補(bǔ)作用為反向遺傳學(xué)研究基因功能的方法帶來障礙，因此需要獲得多基因突變體材料。前期實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得了T-DNA 分別插入AtDGK3/4/7基因的純合突變體，本試驗(yàn)首先通過雜交獲得了3 個(gè)基因的多重突變體atdgk347，檢測(cè)顯示該突變體的3 個(gè)基因均缺失表達(dá)。在該三突變體材料中，用同樣的方法編輯了AtDGK5基因，按照前述實(shí)驗(yàn)步驟，目前獲得了1 株atdgk3457四突變體，在AtDGK5的sgRNA2靶位點(diǎn)處缺少1 個(gè)堿基（G）（圖4a），導(dǎo)致AtDGK5基因的移碼，造成提前終止翻譯。生長(zhǎng)表型觀察結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)條件下，atdgk5單突變體與野生型無差異，而atdgk347三突和atdgk3457四突無論是幼苗還是成熟期的蓮座葉片，都顯著小于野生型和單突變體，四突的蓮座葉較三突更?。▓D4b 和c）。表示該家族的基因在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著作用。

圖4 atdgk3/4/5/7 的表型分析Fig.4 Phenotypic analysis of atdgk3/4/5/7

3 結(jié)論與討論

3.1 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得atdgk5 突變體

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，能夠特異編輯各種生物體DNA 中的靶序列，在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域被越來越廣泛地應(yīng)用［13］。本試驗(yàn)研究擬南芥AtDGK5家族基因的功能，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得該基因的缺失表達(dá)突變體，在AtDGK5的第1 和第3 個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)1 個(gè)靶位點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建到基因編輯載體pHEE401 中。預(yù)期被編輯的情況有以下幾種：2 個(gè)靶位點(diǎn)單獨(dú)被編輯，會(huì)造成閱讀框移碼，提前產(chǎn)生終止密碼子；如果2個(gè)編輯靶位點(diǎn)都有活性即可能造成移碼，也可能會(huì)發(fā)生DNA 雙鏈斷裂，刪除370 bp。最終經(jīng)過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)選擇的2 個(gè)靶位點(diǎn)都有編輯活性，但并未造成斷裂，檢測(cè)結(jié)果顯示選擇的靶位點(diǎn)編輯效率很高，如帶有酶切位點(diǎn)的sgRNA2 編輯效率達(dá)到72%，且T1代即獲得了純合突變體。本試驗(yàn)最終選擇做后續(xù)功能研究的atdgk5突變體，AtDGK5基因在264 bp 處因增加1 個(gè)堿基而發(fā)生了移碼，在283 bp 處出現(xiàn)了終止密碼子，理論上表達(dá)蛋白的氨基酸數(shù)僅是完整蛋白的18.47%，達(dá)到了破壞該基因的效果。另外，由于AtDGK5與AtDGK3在同一條染色體上，利用雜交的方法很難獲得多基因的突變體，因此采用相同的方法在atdgk347（分別為T-DNA插入突變體雜交而成）三突變體背景下導(dǎo)入針對(duì)AtDGK5的基因編輯載體，獲得了atdgk3457四突變體，目前正將pHEE401-AtDGK5載體轉(zhuǎn)入不同組合的基因突變體中，試圖為研究該基因功能提供更多的材料。

3.2 AtDGK5 基因在鹽和干旱脅迫下的生物功能

DGK 是一類保守的脂類激酶，可以將細(xì)胞膜上的脂類信號(hào)分子DAG 磷酸化為PA，PA 作為植物特有的新型第二信使近年來受到越來越多的關(guān)注，因此DGK 被認(rèn)為是肌醇磷脂信號(hào)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一［14］。目前已在擬南芥、煙草、小麥、番茄、水稻、玉米等物種中檢測(cè)出DGK 激酶活性［6,15-21］。擬南芥DGK基因家族中共有7 個(gè)成員。根據(jù)脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)以及利用T-DNA 插入AtDGKS基因的擬南芥突變體的研究顯示，AtDGK4可能作為NO的結(jié)合物，介導(dǎo)NO 信號(hào)對(duì)花粉管定向生長(zhǎng)的調(diào)控［22］；AtDGK2和4 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生磷脂酸，用于花粉生長(zhǎng)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葉片中磷脂酰甘油的生物合成［23］；AtDGK1/2/3/5/6均參與冷脅迫的應(yīng)答［7,18,24］；AtDGK7在整個(gè)擬南芥植株中均有表達(dá)，主要表達(dá)在幼苗和花器官中，且qRT-PCR 結(jié)果顯示該基因受到干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)［25］；AtDGK5在鞭毛蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物及微生物互作中早期免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用［8］。其他如水稻、玉米、小麥等農(nóng)作物中，也根據(jù)各自DGK在不同組織和脅迫條件下的表達(dá)數(shù)據(jù)，推論其參與了多種發(fā)育和應(yīng)答環(huán)境刺激的調(diào)節(jié)作用［6,14,26］。

鹽和干旱脅迫是影響農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要脅迫因子，研究植物對(duì)該脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制是生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題［27］。肌醇磷脂信號(hào)系統(tǒng)參與滲透脅迫反應(yīng)有諸多證據(jù)，但作用機(jī)理需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)獲得Cas9-free 且AtDGK5基因表達(dá)缺陷的atdgk5純合突變體后，首先檢測(cè)了正常條件下的生長(zhǎng)表型，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥無明顯差異。但給予高鹽或干旱的脅迫條件后，該突變體的種子萌發(fā)過程與野生型相比都發(fā)生了變化；進(jìn)一步檢測(cè)脅迫激素ABA 對(duì)atdgk5的影響，發(fā)現(xiàn)ABA嚴(yán)重影響了atdgk5的幼苗生長(zhǎng)過程。這些結(jié)果為AtDGK5基因參與擬南芥對(duì)鹽和干旱的脅迫應(yīng)答反應(yīng)提供了證據(jù)。同源基因之間往往存在著功能互補(bǔ)，擬南芥AtDGK5家族有7 個(gè)成員，因此，明確各成員的功能，需要不同組合的多重突變體為材料。本研究獲得atdgk3457四突后，初步檢測(cè)了生長(zhǎng)表型，發(fā)現(xiàn)多重突變體的生長(zhǎng)較減緩，無論是幼苗還是成熟的蓮座葉，都比野生型小，說明植物的正常發(fā)育過程是需要DGK基因的參與。

總之，本研究為初步解析AtDGK5基因及其同源基因的生物學(xué)功能提供了材料，也對(duì)探索植物響應(yīng)鹽和干旱脅迫的生物學(xué)過程具有重要意義。