3種植物揮發(fā)物緩釋劑的篩選

錢曉香，母 妮，楊六三，劉 航，陳 明，肖 春，董文霞

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201）

植物揮發(fā)物在植食性昆蟲的寄主定向、產(chǎn)卵、聚集等行為中發(fā)揮著重要的作用。不少植物揮發(fā)物成分對植食性昆蟲具有引誘作用，一些植物揮發(fā)物已經(jīng)在田間試驗中表現(xiàn)出對害蟲較高的引誘活性［1］。但是由于植物揮發(fā)物具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，持效期短，很難起到在較長時間內(nèi)控制害蟲的目的，因而其在田間的應(yīng)用受到了較大的限制。因此，迫切需要研制出良好的植物揮發(fā)物緩釋劑，控制植物揮發(fā)物的釋放速率，延長持效期，提高植物揮發(fā)物對害蟲的引誘效果。

一些研究發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)物組分中d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯對一些害蟲具有引誘活性。在室內(nèi)行為測定中，將d-檸檬烯放入味源瓶中，能夠引誘柑橘大實蠅(Bactrocera minax)的雄蟲［2］；將d-檸檬烯滴加在濾紙上，可以引誘花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)的雄蟲、朱紅毛斑蛾(Phauda flammans)的雌雄成蟲［3-4］；將d-檸檬烯加入橡膠塞中，對草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的雌蟲具有引誘作用［5］。室內(nèi)行為實驗結(jié)果表明：將β-石竹烯滴加在濾紙上，能夠引誘普通大薊馬(Megalurothrips usitatus)、斑翅果蠅(Drosophila suzukii)的雌蟲、朱紅毛斑蛾的雌雄成蟲［4,6-7］；將β-石竹烯放入味源瓶中，能夠引誘橘小實蠅(Bactrocera dorsalis)的雌蟲［8］。此外，將β-石竹烯加入棉芯中，在田間可以顯著引誘番石榴實蠅(Bactrocera correcta)的雄蟲［9］；將十四酸乙酯滴在棉花團(tuán)上，在棗園中能誘集到大量的棗實蠅(Carpomya vesuv-iana)，在沙棘林里能誘集到沙棘繞實蠅(Rhagoletis batava)［10-11］。這些研究均限于室內(nèi)行為測定或者田間初步實驗，還沒有真正將植物揮發(fā)物制成緩釋劑應(yīng)用于害蟲的田間防治，主要由于這幾種植物揮發(fā)物的揮發(fā)性太強(qiáng)，在濾紙片或者味源瓶中30 min之內(nèi)就完全釋放［12］。目前常用的緩釋材料有橡膠塞、液體石蠟+離心管、聚乙烯小瓶、微膠囊、迷向絲、蠟滴等［13-15］。其中，橡膠塞是一種傳統(tǒng)的緩釋材料［16］，已經(jīng)被廣泛用于蛾類昆蟲性信息素的研究，但其在自然條件下難以降解。大部分植物揮發(fā)物的分子量比信息素?fù)]發(fā)物的更小，揮發(fā)性更強(qiáng)，橡膠塞是否適合作為植物揮發(fā)物的緩釋材料應(yīng)用于田間害蟲防治，還不清楚。有研究將植物揮發(fā)物組分加到液體石蠟+離心管緩釋材料中，制成誘劑用于害蟲的田間引誘試驗［15,17-18］。但是這些研究均未涉及植物揮發(fā)物成分在液體石蠟+離心管中的釋放速率和持效期。2009年，Zada等［19］首次報道了一種新的緩釋材料溶膠—凝膠的合成方法。2014年，Bian等［20］將該方法用于10種茶樹揮發(fā)物組分（順-3-己烯醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、順-3-己烯乙酸酯、反-2-己烯丁酸酯、己酸葉醇酯、苯甲醛、水楊酸甲酯、反-肉桂醛、反-2-己烯醛）緩釋劑的制備，這些揮發(fā)物在溶膠—凝膠的持效期均長于14 d，其中順-3-己烯醇、反-2-己烯醛、β-芳樟醇緩釋劑對茶蚜(Toxoptera aurantii)具有良好的誘集效果，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。除了上述10種植物揮發(fā)物外，其他植物揮發(fā)物在溶膠—凝膠緩釋劑中持效期的研究還未見報道。

為了明確適合應(yīng)用于田間害蟲防治的d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯緩釋劑型，筆者比較了室外條件下這3種植物揮發(fā)物在橡膠塞、液體石蠟+離心管、溶膠—凝膠中的釋放速率和持效期，從中篩選出了這3種揮發(fā)物的最適緩釋劑，以期為其田間應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試標(biāo)準(zhǔn)化合物的信息見表1。

表1 供試標(biāo)準(zhǔn)化合物的純度及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 不同溶劑中3種化合物含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 正己烷溶劑中3種化合物含量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：通過預(yù)實驗確定3種化合物在橡膠塞中的殘留量大概范圍以及從液體石蠟+離心管中釋放的大概劑量，將化合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成1、10、50、200、500、1000 μg/mL共6個濃度梯度的正己烷溶液，利用氣相色譜儀(Agilent Technologies，GC 7890 A)進(jìn)行定量分析，其升溫程序與Zhang等［21］的研究一致，進(jìn)樣量1 μL；每個濃度重復(fù)3次，繪制化合物的含量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2），用于測定揮發(fā)物在橡膠塞中殘留量及從液體石蠟+離心管中的釋放量。

表2 3種化合物含量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

甲醇溶劑中3種化合物含量-吸光率的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：通過預(yù)實驗確定3種化合物在溶膠—凝膠中殘留量的大概范圍，將化合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成1、10、100、500、800、1000 μg/mL共6個濃度梯度的甲醇溶液，采用紫外分光光度計(GE/Biochrom 80-2112-21，Ultrospec 2100)先對3種化合物的吸收波長進(jìn)行鑒定，再測定每種化合物對應(yīng)6個濃度的吸光率，每個濃度3個樣品，每個樣品檢測3次吸光率，最終建立3種化合物的含量-吸光率標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表3），用于3種揮發(fā)物在溶膠—凝膠中殘留量的測定。

表3 3種化合物含量-吸光率的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

1.2.2 緩釋劑型的制備 橡膠塞緩釋劑型的制備：將d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種化合物分別配制成濃度為20 mg/mL的正己烷溶液；各取配制的正己烷溶液100 μL分別置于橡膠塞凹槽內(nèi)，等待溶劑完全吸收后使用。

液體石蠟+離心管緩釋劑型的制備：將d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種化合物分別配制成濃度為4 mg/mL的液體石蠟溶液，取500μL置于1.5 mL離心管內(nèi)，蓋緊蓋子，管蓋上有1個直徑為1.5 mm的圓孔。

溶膠—凝膠緩釋劑型的制備：參照Zada等［19-20］的溶膠—凝膠合成方法，加入194 μL HCl（pH值為2）和776 μL蒸餾水，化合物用量為2 mg；以不加化合物制作的溶膠—凝膠作為空白對照。

分別將制備的橡膠塞、離心管以及溶膠—凝膠柱(直徑1.5 cm，高4.5 cm)放置在室外陽臺，四面通風(fēng)，每個處理之間間隔50 cm。

1.2.3 緩釋速率的測定 在放置后第0、1、2、3、4、5、6、7、10、13、16、19、22、25、28天，收集殘留的或者揮發(fā)到空氣中的揮發(fā)物；以溶劑剛好被橡膠塞完全吸收時視為第0天；離心管揮發(fā)物的收集從掛在陽臺1 d后開始；以溶膠—凝膠緩釋劑型制備完成時視為第0天。

橡膠塞緩釋劑的緩釋速率測定：采用有機(jī)溶劑浸提法。取下橡膠塞，用剪刀均勻剪成1～3 mm3的小方塊，放到5 mL容量的玻璃離心管內(nèi)，取2.0 mL正己烷溶液加入離心管，密封；浸提24 h后，利用氣相色譜儀進(jìn)行檢測，上樣量為1 μL，重復(fù)檢測3次，氣相色譜程序同1.2.1節(jié)。根據(jù)測定所得的3種化合物的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2）計算出化合物的殘留量，并通過下列公式計算得出包埋率、殘留率、釋放速率：

包埋率(%)=第0天的殘留量/揮發(fā)物理論含量×100%

殘留率(%)=當(dāng)天的殘留量/揮發(fā)物理論含量×100%

前7 d的釋放速率(%)=（前1 d的殘留量-當(dāng)天的殘留量）/前1 d的殘留量×100%

7 d后的釋放速率(%)=（前3 d的殘留量-當(dāng)天的殘留量）/3/前3 d的殘留量×100%

溶膠—凝膠緩釋劑的緩釋速率測定：采用有機(jī)溶劑浸提法。將溶膠—凝膠搗碎，放入5 mL容量的玻璃離心管內(nèi)，取2.0 mL甲醇溶液放入離心管，密封。參照Zada等［19］的方法進(jìn)行提取，將上清液在7500 r/min下離心5 min，然后利用紫外分光光度計檢測上清液的吸光率，以空白處理為對照，各重復(fù)測定3次；將測定得到的吸光率減去空白對照的吸光率后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表3）計算出3種化合物的殘留量，再利用上述公式計算包埋率、殘留率、釋放速率。

液體石蠟+離心管緩釋劑的緩釋速率測定：采用動態(tài)頂空吸附法。將離心管放在直徑為1.5 cm、高為4.5 cm的玻璃管中，再將玻璃管放入250 mL清潔、干燥的玻璃提取瓶中。參照謝興偉等［22］的方法進(jìn)行提取，將大氣采樣儀改為真空泵（GAST Manufacturing Inc，DOA-P604-BN）。在收集時，真空泵氣流量為200 mL/min，連續(xù)吸附12 h（9:00~21:00），保持環(huán)境通風(fēng)、無異味。收集完成后，用1.5 mL正己烷將吸附柱吸附的物質(zhì)洗脫至2 mL棕色樣品瓶中，放入冰箱備用。將樣品濃縮至20 μL，利用氣相色譜儀進(jìn)行檢測，上樣量1 μL，重復(fù)檢測3次，氣相色譜程序同1.2.1節(jié)。根據(jù)測定所得的3種化合物的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2）計算其12 h的釋放量，并計算平均釋放速率。緩釋劑中揮發(fā)性化合物的釋放動力學(xué)規(guī)律符合一級動力學(xué)指數(shù)方程Ct=C0e-kt，其中Ct為緩釋劑中揮發(fā)物在時間t時的剩余量，e為自然對數(shù)，C0為緩釋劑中揮發(fā)物開始釋放時的理論初始總量，k為常數(shù)［23-24］。通過該方程可將揮發(fā)物的平均釋放速率轉(zhuǎn)換為緩釋材料中揮發(fā)物的殘留量。參照邊磊［25］的方法，將平均釋放速率轉(zhuǎn)化為Ct，相關(guān)計算公式為：

上式中：F(0, t)為時間t時揮發(fā)物的總釋放量；C0為整個釋放期間緩釋劑中揮發(fā)物的理論釋放總量；Ct為固定時間內(nèi)緩釋劑中揮發(fā)物的理論殘留量；a、b為常數(shù)。

根據(jù)上述公式計算緩釋材料中揮發(fā)物的殘留量，再計算出殘留率和釋放速率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用配對樣本t檢驗比較化合物在橡膠塞、溶膠—凝膠兩種緩釋材料中包埋率的差異；用Tukey法對3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率、緩釋速率、最終殘留率進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率

從表4可以看出：d-檸檬烯、β-石竹烯在溶膠—凝膠中的包埋率極顯著高于在橡膠塞中的，而十四酸乙酯在2種緩釋材料中的包埋率差異不顯著；在橡膠塞中，十四酸乙酯的包埋率最高，d-檸檬烯的包埋率最低；在溶膠—凝膠中，d-檸檬烯的包埋率最高，十四酸乙酯的包埋率最低。

表4 3種化合物在不同緩釋材料中的包埋率 %

2.2 3種化合物在不同緩釋材料中的時間-殘留率關(guān)系

d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯在3種緩釋材料中的殘留率均隨著時間的增加而下降；除d-檸檬烯和β-石竹烯在橡膠塞中的時間-殘留率關(guān)系呈指數(shù)趨勢線外，其他3種化合物在不同緩釋材料中的時間-殘留率關(guān)系均呈線性趨勢線。除了d-檸檬烯在橡膠塞中、β-石竹烯在液體石蠟+離心管中、d-檸檬烯和β-石竹烯在溶膠—凝膠中的時間-殘留率公式的相關(guān)系數(shù)低于0.95外，其他校準(zhǔn)公式的相關(guān)系數(shù)均大于0.95（表5）。

表5 3種化合物在不同緩釋材料中時間-殘留率的校準(zhǔn)公式

2.3 3種化合物在不同緩釋材料中的最終殘留率

釋放28 d后，在橡膠塞中，十四酸乙酯的最終殘留率最高，d-檸檬烯和β-石竹烯的最終殘留率均低于1%；在液體石蠟+離心管中，β-石竹烯的最終殘留率最高，d-檸檬烯的最終殘留率最低；在溶膠—凝膠中，β-石竹烯的最終殘留率最高，d-檸檬烯和十四酸乙酯的殘留率較低，均小于6%（表6）。

表6 3種化合物在不同緩釋材料中的最終殘留率 %

2.4 3種化合物在不同緩釋材料中的釋放速率

2.4.1 d-檸檬烯在不同緩釋材料中的釋放速率 由表7可知：第1天，橡膠塞和液體石蠟+離心管中d-檸檬烯的釋放速率出現(xiàn)最大值，分別達(dá)189.32、249.35 μg/d；第2天，溶膠—凝膠中d-檸檬烯的釋放速率最大，達(dá)318.29 μg/d；在橡膠塞中，d-檸檬烯前5 d的釋放較快，釋放量逐漸降低，直到第19天時釋放速率為（0.00±0.02） μg/d，此時可以認(rèn)為d-檸檬烯基本上不再釋放；在液體石蠟+離心管中，d-檸檬烯的釋放速率由大變小，第28天的釋放速率仍有31.66 μg/d；在溶膠—凝膠中，d-檸檬烯前5 d的釋放速率較大，之后釋放緩慢，第28天的釋放速率最小。

表7 3種緩釋材料中d-檸檬烯的釋放速率 μg/d

2.4.2β-石竹烯在不同緩釋材料中的釋放速率 如表8所示：第1天，溶膠—凝膠和橡膠塞中β-石竹烯的釋放速率較大，顯著高于在液體石蠟+離心管中的釋放速率（6.90 μg/d）；在橡膠塞中，β-石竹烯在前2 d快速釋放，此后逐漸緩慢釋放，第22天出現(xiàn)最小的釋放速率（0.55 μg/d）；在液體石蠟+離心管中，β-石竹烯在28 d內(nèi)的釋放速率均較低，釋放速率在1.56~7.05 μg/d之間波動；在溶膠—凝膠中，隨著時間的延長β-石竹烯的釋放速率逐漸變小。

表8 3種緩釋材料中β-石竹烯的釋放速率 μg/d

2.4.3 十四酸乙酯在不同緩釋材料中的釋放速率 從表9可以看出：第1天，溶膠—凝膠中十四酸乙酯的釋放速率最大（197.04 μg/d），顯著高于在橡膠塞和液體石蠟+離心管中的；在橡膠塞中，十四酸乙酯隨時間的延長而穩(wěn)定釋放，釋放速率在14.81~82.72 μg/d之間波動；在液體石蠟+離心管中，十四酸乙酯在28 d內(nèi)的釋放速率均較低，釋放速率在2.54~7.94 μg/d之間波動；在溶膠—凝膠中，十四酸乙酯的釋放速率總體呈現(xiàn)從快到慢的趨勢，在第2天的釋放速率最大（262.22 μg/d），第13天的釋放速率最小，僅8.40 μg/d。

表9 3種緩釋材料中十四酸乙酯的釋放速率 μg/d

3 討論

筆者首次制備了d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯這3種植物揮發(fā)物的凝膠—溶膠緩釋劑，并與橡膠塞、液體石蠟+離心管緩釋劑進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：3種植物揮發(fā)物在液體石蠟+離心管和溶膠—凝膠中的持效期均大于或等于28 d，在橡膠塞中的持效期分別為d-檸檬烯19 d、β-石竹烯25 d、十四酸乙酯大于28 d。其中，包埋率高、釋放速率穩(wěn)定、持效期長的劑型有：橡膠塞中的十四酸乙酯，液體石蠟+離心管內(nèi)3種化合物，溶膠—凝膠中的β-石竹烯。但是，液體石蠟+離心管中的十四酸乙酯和β-石竹烯的釋放速率較低。

d-檸檬烯在橡膠塞中持效期最短，主要原因是包埋率太低（僅14.56%）和揮發(fā)太快。將d-檸檬烯溶液注入到橡膠塞凹槽后，由于其揮發(fā)性強(qiáng)，可被橡膠塞吸收的較少。有研究表明，在沒有緩釋載體的情況下，d-檸檬烯的釋放速率高達(dá)260 μg/min［12］。在本研究中，被橡膠塞吸收的d-檸檬烯在前5 d便釋放了94%，因此橡膠塞不適合作為d-檸檬烯的緩釋材料。在液體石蠟+離心管和溶膠—凝膠中，d-檸檬烯的包埋率較高，持效期較長，釋放也較穩(wěn)定，這2種材料均適合作為d-檸檬烯的緩釋材料。但是，與溶膠—凝膠相比，d-檸檬烯在液體石蠟+離心管中的最終殘留率更高，釋放速率也更穩(wěn)定。因此，我們認(rèn)為d-檸檬烯的最適緩釋材料為液體石蠟+離心管。

β-石竹烯和d-檸檬烯均為萜烯類化合物，同樣出現(xiàn)了在橡膠塞中包埋率較低（僅44.60%）和揮發(fā)性較強(qiáng)的情況，因此橡膠塞不合適作為β-石竹烯的緩釋材料。β-石竹烯在液體石蠟+離心管中的釋放速率太低，可能是由于受濕度影響過大。總之，液體石蠟+離心管也不適合作為β-石竹烯的緩釋材料。本研究中的溶膠—凝膠材料由低于10%的硅氧化物和高于90%的空氣構(gòu)成，這種特殊的多空材質(zhì)可以包埋更多的β-石竹烯，使其能保持更長的時間，且被包埋的β-石竹烯隨著溶膠—凝膠材料的降解可以緩慢而穩(wěn)定地釋放，因此β-石竹烯的最適緩釋材料為溶膠—凝膠；另外，溶膠—凝膠的降解產(chǎn)物主要是水和二氧化硅，對環(huán)境友好和安全。

本研究結(jié)果表明，十四酸乙酯在橡膠塞中的包埋率較高（68.31%），并且釋放速率較穩(wěn)定。這可能是因為十四酸乙酯的分子量和功能團(tuán)與一些蛾類昆蟲性信息素組分十四醇乙酸酯的相同，橡膠塞一直是蛾類昆蟲性信息素的最適緩釋材料。因此，橡膠塞適合作為十四酸乙酯的緩釋材料。十四酸乙酯在溶膠—凝膠中的包埋率雖然高（77.83%），但釋放速率較橡膠塞而言更不穩(wěn)定。因此，我們認(rèn)為溶膠—凝膠不適合作為十四酸乙酯的緩釋材料。

植物揮發(fā)物在緩釋材料中的持效期和釋放速率除受揮發(fā)物本身性質(zhì)和緩釋材料特性的影響外，還會受到溫度、濕度、光照、風(fēng)速等諸多外界因素的影響［26］。本研究將緩釋劑放置在室外，處于變溫條件下，白天（6：00~18：00）的氣溫為21.5~39.4 ℃，晚上（18：00~次日6：00）的氣溫為17.0~23.2 ℃，實驗過程也受到了日照、降雨、刮風(fēng)等因素的影響，這些因素對研究結(jié)果也有一定的影響。本研究初步篩選出了適合d-檸檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯田間應(yīng)用的緩釋材料，但其在田間的應(yīng)用效果還需要通過田間害蟲誘捕試驗進(jìn)行驗證。

4 結(jié)論

用于植物揮發(fā)物的良好緩釋材料必須具有包埋率高、持效期長、釋放緩慢而穩(wěn)定的特點。本研究結(jié)果表明：十四酸乙酯的最適緩釋材料是橡膠塞，d-檸檬烯的最適緩釋材料是液體石蠟+離心管，β-石竹烯的最適緩釋材料是溶膠—凝膠。