有氧運(yùn)動(dòng)通過抑制TAK1-MAPK信號(hào)通路改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)

陳巧瑩，蔣依娜，管璇，曾靜靜，吳連拼，李磊，胡云良

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325027；2.溫州市泛血管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325027；4.寧波市第二醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 寧波 315000

心肌重構(gòu)被認(rèn)為是心力衰竭臨床病理過程的決定性因素。心肌梗死、心肌炎、壓力負(fù)荷過重等均能導(dǎo)致心肌重構(gòu)的發(fā)生[1]。橫向主動(dòng)脈縮窄術(shù)（transverse aortic constriction, TAC）是研究心肌肥厚和心力衰竭的常用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可用于心血管疾病機(jī)制的研究和治療策略的開發(fā)[2-3]。長(zhǎng)期的壓力超負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)生病理性改變，最終可能導(dǎo)致心力衰竭和猝死[4-5]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可被各種病理性應(yīng)激激 活[6]，其活性增加會(huì)加劇壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)[7]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路響應(yīng)異常刺激而激活[8]。TAK1是MAPK信號(hào)通路的上游激活因子。TAK1激活后可促進(jìn)MAPK信號(hào)通路蛋白的過度磷酸化，加劇TAC誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚[9]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練已被證明能夠改善病理性心肌重構(gòu)[10-11]。在心臟缺血/再灌注損傷大鼠中，有氧運(yùn)動(dòng)可通過抑制MAPK信號(hào)通路來發(fā)揮心臟保護(hù)作用[12]。但有氧運(yùn)動(dòng)改善TAC小鼠的心肌重構(gòu)是否與TAK1-MAPK信號(hào)通路的活性有關(guān)，仍需進(jìn)一步的研究。本研究利用TAC手術(shù)構(gòu)建心肌肥厚模型，研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌重構(gòu)的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0017]。所有小鼠都飼養(yǎng)在一個(gè)屏障設(shè)施中，光照周期為12 h，溫度為23～26 ℃，相對(duì)濕度為50%～55%，自由進(jìn)食和飲水。隨機(jī)將小鼠分為4組：假手術(shù)+對(duì)照（Sham+ CON）組（n=10）、假手術(shù)+游泳（Sham+SWIM）組（n= 10）、TAC+對(duì)照（TAC+CON）組（n=15）、TAC+游泳（TAC+ SWIM）組（n=15）。

1.2 TAC模型建立將小鼠固定在恒溫支架上，接受1.5%異氟醚麻醉，氣管插管連接呼吸機(jī)，沿胸骨切開肋骨，在左頸動(dòng)脈與頭臂干之間開胸，暴露主動(dòng)脈弓。將6-0尼龍縫合線穿過主動(dòng)脈弓并與放置在動(dòng)脈上的27 G縮窄針結(jié)扎在一起，然后快速取出縮窄針，閉合并縫合胸腔。待小鼠能自主呼吸后關(guān)閉呼吸機(jī)，拔除氣管插管，將小鼠移動(dòng)到加熱墊上恢復(fù)。假手術(shù)（Sham）組不結(jié)扎主動(dòng)脈弓，其余操作同TAC組。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案Sham和TAC手術(shù)后1周，運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練。游泳訓(xùn)練的過程如下：第1天游泳時(shí)間為10 min，之后每天遞增10 min，直至達(dá)到90 min。隨后每周運(yùn)動(dòng)5 d，每天90 min，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練共持續(xù)4周。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢查4 周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后，1.5%異氟醚麻醉小鼠，使用30 MHz超聲探頭對(duì)小鼠主動(dòng)脈弓進(jìn)行超聲檢查。調(diào)整超聲探頭的位置以獲得主動(dòng)脈弓縮窄處的脈沖多普勒?qǐng)D像，測(cè)量峰值血流速度（Vmax：m/s），并計(jì)算壓力梯度[PW：mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）]。使用M型超聲探頭評(píng)估心臟幾何形狀和功能。將傳感器降低到平行于左側(cè)胸骨旁線的胸腔上，然后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)30°。使用B模式成像獲得心臟的長(zhǎng)軸“矢狀”視圖，調(diào)整換能器的角度以觀察心臟，切換到M模式，將M模式光標(biāo)垂直于乳頭肌水平的心室壁放置，保存圖像，測(cè)量收縮期左心室內(nèi)徑（left ventricular internal diameter during systole, LVIDs）、收縮期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness during systole, LVPWs）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）。

1.5 組織取材4周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后，稱量并記錄每只小鼠的體質(zhì)量。超聲檢查后處死小鼠，取出心臟組織，放入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液中，擠壓排出血液，濾紙吸干后稱量，比較各組的心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比（heart weight/body weight, HW/BW）。同時(shí)，分離雙肺組織，稱量雙肺質(zhì)量，比較各組肺質(zhì)量/體質(zhì)量比（lung weight/body weight, LW/BW）。部分心臟用于石蠟包埋，部分心臟用于冰凍包埋，部分心臟置于液氮中凍存。

1.6 TUNEL染色將小鼠心臟組織包埋在OCT冰凍切片包埋機(jī)中，使用冰凍切片機(jī)將組織切成5 μm厚的切片。切片室溫放置20 min后，用PBS洗滌。將組織用4%多聚甲醛固定30 min并用PBS洗滌，按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）說明書進(jìn)行染色。

1.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)從心臟組織中提取和純化總蛋白，隨后通過BCA蛋白定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）測(cè)定濃度。通過SDS-PAGE分離40 μg總蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜（美國(guó)Thermo Fisher公司）。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，與相應(yīng)的一抗于4 ℃孵育過夜。抗膠原蛋白（Collagen）I抗體（1:1000，ab260043）、抗Collagen III抗體（1:1000，ab184993）、抗Bax抗體（1:1000，ab32503）、抗Bcl-2抗體（1:1000，ab59348）、抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide, ANP）抗體（1:1000，ab189921）、抗腦鈉肽（brain natriuretic peptide, BNP）抗體（1:1000，ab236101）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司?？筩-Jun N-末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinases 1/2, JNK1/2）抗體（1:1000，9258）、抗TAK1 抗體（1:1000，5206）、抗p-TAK1抗體（1:1000，9339）、抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2, ERK1/2）抗體（1:1000，4695）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司?？筽-JNK1/2抗體（1:1000，AP0276）、抗P38抗體（1:1000，A14401）、抗p-P38抗體（1:1000，AP0526）均購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司?？筽-ERK1/2抗體（1:1000，28733-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。TBST洗滌后，加入二抗（1:5000）室溫孵育 2 h，再次洗滌。使用帶有Image LabTM軟件的系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化。

1.8 HE染色摘取的小鼠心臟用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，4%多聚甲醛固定過夜，隨后石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。切片脫蠟后，蘇木素染色7 min，自來水洗去多余的染液后，分化液分化3 s，自來水沖洗，伊紅染色2 min，洗去多余染液。隨后脫水、透明、封片，最后在顯微鏡下觀察。

1.9 Masson染色選取石蠟切片，常規(guī)脫蠟后，麗春紅品紅染液染色7 min，弱酸工作液清洗1 min，磷鉬酸染液1 min，弱酸工作液清洗1 min，苯胺藍(lán)染色5 min，弱酸工作液清洗1 min，隨后脫水、透明、封片，最后在顯微鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS22 軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，以±s表示。多組間比較使用單因素方差分析，然后進(jìn)行Dunnett’s多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)改善壓力超負(fù)荷小鼠的心功能 Sham+CON組和Sham+SWIM組小鼠主動(dòng)脈弓結(jié)構(gòu)及壓力梯度正常，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sham+CON組相比，TAC+CON組和TAC+SWIM組主動(dòng)脈弓明顯狹窄，壓力梯度明顯增加（均P＜0.05），且兩組之間縮窄處血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。心臟M型超聲檢查結(jié)果顯示，與Sham+CON組相比，TAC+CON組LVEF和LVFS顯著降低，LVIDs和LVPWs顯著升高（均P＜0.05）。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，TAC+ SWIM組LVEF、LVFS與TAC+CON組相比顯著升高，LVIDs、LVPWs與TAC+CON組相比顯著降低（均P＜0.05）。見圖2、圖3。與Sham+CON組相比，TAC+CON組HW/BW比值、LW/BW比值顯著升高；有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，TAC+SWIM組HW/BW、LW/BW的比值顯著低于TAC+ CON組（均P＜0.05）。見圖4。

圖1 TAC手術(shù)對(duì)小鼠主動(dòng)脈弓的影響

圖2 各組小鼠M型超聲心動(dòng)圖

圖3 各組小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

圖4 有氧運(yùn)動(dòng)后各組小鼠心肺體質(zhì)量比變化

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)改善TAC小鼠的心肌重構(gòu)HE染色與Masson染色結(jié)果顯示，與Sham+CON組相比，TAC+ CON組心肌細(xì)胞橫截面積、心肌間質(zhì)纖維化程度明顯增加（均P＜0.05），心臟發(fā)生顯著重構(gòu)；有氧運(yùn)動(dòng)治療后，TAC+SWIM組心肌細(xì)胞橫截面積和心肌間質(zhì)纖維化程度與TAC+CON組相比均減少（均P＜0.05）。見圖5。

圖5 有氧運(yùn)動(dòng)減輕TAC小鼠的心肌重構(gòu)

Western blot結(jié)果顯示，與Sham+CON組相比，TAC+CON組ANP、BNP、Collagen I和Collagen III蛋白表達(dá)水平顯著增加（均P＜0.05）；有氧運(yùn)動(dòng)后，TAC+SWIM組ANP、BNP、Collagen I和Collagen III蛋白表達(dá)水平較TAC+CON組降低（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠ANP、BNP、Collagen I、Collagen III蛋白表達(dá)水平

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)抑制TAC術(shù)后誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Sham+CON組相比，TAC+ CON組細(xì)胞凋亡水平明顯增加（P＜0.05）；有氧運(yùn)動(dòng)后，TAC+SWIM組細(xì)胞凋亡水平與TAC+CON組相比明顯降低（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與Sham+CON相比，TAC+CON組Bax表達(dá)增加，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值降低（均P＜0.05）；而有氧運(yùn)動(dòng)后，TAC+SWIM組Bax表達(dá)水平較TAC+CON組降低，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值增加（均P＜0.05）。見圖7、圖8。

圖7 有氧運(yùn)動(dòng)抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

圖8 各組小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)抑制TAK1-MAPK信號(hào)通路與Sham+ CON組相比，TAC+CON組p-TAK1、p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白水平顯著增加（均P＜0.05）；有氧運(yùn)動(dòng)后，TAC+SWIM組TAK1、JNK1/2、ERK1/2和P38蛋白磷酸化水平較TAC+CON組顯著降低（均P＜0.05）。見圖9。

圖9 各組小鼠TAK1、ERK1/2、JNK、P38蛋白磷酸化水平變化

3 討論

適當(dāng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心血管系統(tǒng)有積極作用，包括增強(qiáng)心肌收縮力、減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)等。研究表明，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以通過減少氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖而產(chǎn)生保護(hù)作用[13]。 例如，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過逆轉(zhuǎn)小鼠心臟中沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（silent information regulator of transcription 1, SIRT1）的下調(diào)，提高心肌的抗氧化能力來對(duì)抗心肌缺血/再灌注損傷引起的心室重構(gòu)和心肌纖維化[14]。本研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以有效減輕TAC誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)，并可能通過抑制TAK1-MAPK信號(hào)通路激活，減輕心肌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與Sham+CON組相比，TAC+CON組小鼠LVEF和LVFS顯著降低，心肌細(xì)胞橫截面積和心肌間質(zhì)纖維化增加，HW/BW和LW/BW增加，提示壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心臟發(fā)生重構(gòu)。而有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著增加TAC小鼠的LVEF和LVFS，降低HW/BW和LW/BW比值，減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大。同時(shí)，Sham+CON組和Sham+SWIM組心臟功能無顯著差異，表明適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)不會(huì)對(duì)心臟造成損害。

心臟肥大刺激導(dǎo)致復(fù)雜但協(xié)調(diào)的信號(hào)通路被激活，例如MAPK、蛋白激酶C等重要信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路在介導(dǎo)心臟肥大的發(fā)展過程中起著重要作 用[15]。據(jù)報(bào)道，MAPK磷酸酶1（MAPK phosphatase-1, MKP-1）是MAPK信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)和體外過表達(dá)MKP-1會(huì)抑制MAPK信號(hào)通路的三個(gè)主要分支，阻斷壓力過載誘導(dǎo)的體內(nèi)肥厚和激動(dòng)劑誘導(dǎo)的體外肥大，證明MAPK信號(hào)通路在心臟肥大中具有重要作用[16]。TAK1是MAPK家族的上游成員，在各種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。TAK1激活后，激活心肌細(xì)胞中的多個(gè)信號(hào)通路，包括MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路[17]。研究表明，抑制TAK1-MAPK信號(hào)通路激活能夠改善心肌重構(gòu)。例如，含有F-box/WD重復(fù)序列的蛋白5（F-box/WD repeatcontaining protein 5, FBXW5）通過抑制TAK1和阻斷MAPK信號(hào)通路改善病理性心臟肥大[18]。此外，在老年心肌梗死大鼠中，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠抑制MAPK信號(hào)通路改善心功能及冠脈微循環(huán)障礙[19]。本研究中，p-TAK1、p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白表達(dá)水平在TAC手術(shù)后明顯升高；有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，TAC+SWIM組TAK1、JNK1/2、ERK1/2和P38蛋白磷酸化水平明顯低于TAC+CON組，表明有氧運(yùn)動(dòng)能夠顯著抑制TAK1-MAPK信號(hào)通路的激活。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌重塑和心力衰竭的重要致病特征[20]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞基質(zhì)取代壞死細(xì)胞，增加心肌間質(zhì)纖維化，損害心肌收縮力，促進(jìn)心肌肥大，最終導(dǎo)致心力衰竭[21-23]。有研究報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的miR-342-5p，通過靶向JNK2抑制心肌細(xì)胞凋亡來保護(hù)心臟免受心肌缺血/再灌注損傷[24]。我們檢測(cè)了Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水 平，發(fā)現(xiàn)TAC手術(shù)后Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)降低；有氧運(yùn)動(dòng)后TAC+SWIM組Bax蛋白表達(dá)水平較TAC+CON組降低，Bcl-2表達(dá)增加，表明有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在TAC小鼠中增加，在有氧運(yùn)動(dòng)后降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了有氧運(yùn)動(dòng)可以減少TAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟功能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)作為一種有益的非藥物療法，在一定程度上可以阻斷TAK1-MAPK信號(hào)通路的激活，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。