依達拉奉右莰醇通過抑制氧化應(yīng)激和提高自噬流促進周圍神經(jīng)損傷修復(fù)

諶靖豪，樓承浩，魏圣哲，盧穎楓，余方正，王健

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 創(chuàng)面修復(fù)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 手外科·周圍神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

周圍神經(jīng)是指腦、脊髓以外的所有神經(jīng)。由于周圍神經(jīng)自身再生修復(fù)過程漫長，大多數(shù)患者在周圍神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury, PNI）后往往遺留有部分運動及感覺功能障礙[1-2]。依達拉奉右莰醇（Edaravone Dexborneol, C-EDA）是由依達拉奉與右莰醇以4:1的配比組成的藥物合劑。有研 究[3]發(fā)現(xiàn)，依達拉奉可以通過氧化應(yīng)激傳感器核紅細胞因子2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）和人銅鋅超氧化物歧化酶抑制肌萎縮側(cè)索硬化模型小鼠的氧化應(yīng)激。右莰醇通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路在皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪/再灌注損傷中發(fā)揮抗氧化和抗炎癥的保護作用[4]。兩種成分發(fā)揮協(xié)同作用，清除自由基與抑制炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮更有效地調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[5-6]。然而C-EDA在PNI方面的治療作用和具體分子機制鮮有學者進行過深入研究。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化平衡作用失調(diào)的一種應(yīng)激狀態(tài)，是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用，被認為是導致衰老和機體疾病的一個重要因素[7-8]。在神經(jīng)損傷后，氧化激活過度激活的過程會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）并積累，從而導致神經(jīng)元死亡，這阻礙了神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)。有研究[9]發(fā)現(xiàn)外源性給予褪黑激素可以抑制PNI的氧化應(yīng)激來增強PNI的恢復(fù)。自噬參與多種細胞內(nèi)細胞器和蛋白質(zhì)降解，是維持細胞生存環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要過程[10]。有研究報道自噬的適度激活可以在順鉑誘導的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而自噬水平的增高并不完全代表自噬效應(yīng)的增強[11]。自噬是一個動態(tài)的循環(huán)，這個循環(huán)稱之為自噬流[12-14]。本研究聚焦于C-EDA對PNI后神經(jīng)的保護作用，以期探討C-EDA是否具有促進周圍神經(jīng)修復(fù)的作用，并試圖探究其潛在的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器大鼠神經(jīng)絲蛋白200（neurofilament-200, NF-200）抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab4680），髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）抗體購自美國Abcam公司（貨號：b4066），亞鐵血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：10701-1-AP），Nrf2 抗體購自美國Proteintech公司（貨號：16396-1-AP），SQSTM1（p62）抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責任公司（貨號：382862），微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3II/I）抗體購自武漢ABclonal公司（貨號：A5618），Bcl-2抗體購自美國Proteintech公司（貨號：26593-1-AP），Bax抗體購自美國Proteintech公司（貨號：50599-2-1g），磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）抗體購自美國Abcam公司（貨號：#2535），轉(zhuǎn)錄因子E3（transcription factor E3, TFE3）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：14480-1-AP），哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）抗體購自美國Proteintech公司（貨號：66888-1-Ig），GAPDH抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責任公司（貨號：10494-1-AP），DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)研究所（貨號：C1006），3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3MA）購自美國MCE公司（貨號：HY-19312）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥：40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法均分為4組：①假手術(shù)對照組（Sham組）：實施麻醉與切開皮膚，并注射等量0.9%氯化鈉溶液；②PNI組：在10%水合氯醛麻醉后，用血管夾造成坐骨神經(jīng)中度擠壓傷，并注射等量0.9%氯化鈉溶液；③C-EDA（C-EDA+PNI）組：麻醉后切開皮膚并使用血管夾夾閉坐骨神經(jīng)，之后的4周每天腹腔注射3.75 mg/kg的C-EDA；④3MA組（PNI+C-EDA+3MA）：在制作PNI模型前3 d，以腹腔注射的方式每天給予mTOR抑制劑3MA（2.5 mmol/L）15 mg/kg來抑制自噬，麻醉后切開皮膚并使用血管夾夾閉坐骨神經(jīng)，之后的4周每天腹腔注射3.75 mg/kg的C-EDA與15 mg/kg的3MA。術(shù)后4周處死所有大鼠，取右側(cè)坐骨神經(jīng)進行病理指標評價。SD大鼠均購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2021-0020。

1.2.2 步態(tài)印記分析：在術(shù)后第4 周對所有大鼠進行步態(tài)印跡分析[15]來評估運動功能的恢復(fù)。分別測量正常側(cè)后足（N）和損傷側(cè)后足（E）的3 個數(shù)據(jù)：足印長度、中間足趾寬度、足趾寬度。計算出的數(shù)值即為坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic nerve function index, SFI）[16]。

1.2.3 神經(jīng)電生理檢查：損傷后第4周使用神經(jīng)電生理監(jiān)測技術(shù)來評估坐骨神經(jīng)傳導功能的恢復(fù)。具體操作如下：將神經(jīng)電生理儀器的刺激電極放置于大鼠坐骨神經(jīng)損傷部位靠近端1 mm處，接收電極放置于腓腸肌的肌腹。將平衡電極置于大鼠皮下，給予30 mA電流的電刺激，在神經(jīng)電生理檢測儀上會得到相應(yīng)的肌肉收縮波形。之后刺激電極位置改為神經(jīng)損傷部位遠端1 mm處。同樣的刺激可以得到另一種波形。

1.2.4 免疫熒光染色：動物組織切片熒光：石蠟切片用二甲苯浸泡20 min。依次放入無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，用PBS洗5 min，重復(fù)3 遍。用高壓鍋加熱3 min后加入一抗：NF-200 （1:1000），MBP（1:2000），復(fù)溫1 h，加入二抗（1:1000），37 ℃孵育60 min，然后封片。使用DAPI標記細胞核。所有熒光圖像均使用激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測相關(guān)蛋白表達：提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。動物蛋白經(jīng)過凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和封閉后，加入一抗孵育：HO-1（1:2000）、Nrf2（1:200）、p62（1:100）、LC3II/LC3I（1:200）、GAPDH（1:100）、Bcl-2（1:200）、Bax（1:200）、p-AMPK（1:100）、TFE3（1:200）、mTOR（1:200）、GAPDH（1:800）。二抗（1:1000）孵育1 h。使用電化學發(fā)光液浸泡膜，置于成像系統(tǒng)內(nèi)進行圖像采集。Sham組的值默認為1進行比較。

1.2.6 脂質(zhì)氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測：組織使用裂解液進行勻漿，10000～12000 r/min 離心10 min后取上清液用于后續(xù)測定。在離心管內(nèi)加入0.1 mL PBS作為空白對照，加入0.1 mL不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1 mL樣品用于測定。隨后用酶標儀在532 nm波長下測定吸光度。

1.2.7 組織病理學觀察：將損傷側(cè)坐骨神經(jīng)與腓腸肌置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察拍攝。

1.3 統(tǒng)計學處理方法采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠后足足趾畸形程度比較從后爪伸展的足底視圖可以看出PNI組大鼠的損傷側(cè)后足與Sham組相比更加攣縮和畸形，C-EDA組大鼠后足的攣縮和畸形程度與PNI組大鼠相比更低，3MA組大鼠 后足的攣縮和畸形程度與C-EDA組大鼠相比更高，見圖1A。C-EDA治療4周后，PNI組的SFI值低于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的SFI值與PNI組相比增高（P＜0.001），3MA組的SFI值較C-EDA組降低（P＜0.001），見圖1B。

圖1 術(shù)后4周各組大鼠的后足足趾形態(tài)變化及SFI比較

2.2 各組大鼠腓腸肌萎縮程度比較C-EDA治療4周后，雙側(cè)腓腸肌濕重（損傷側(cè)/健側(cè)）之比統(tǒng)計結(jié)果顯示，PNI組的腓腸肌濕重比值要遠低于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的腓腸肌濕重比值較PNI組增高（P＜0.001），3MA組的腓腸肌濕重比值較C-EDA組減低（P＜0.001），見圖2A。腓腸肌HE染色結(jié)果顯示，PNI組的腓腸肌肌纖維面積要小于Sham組（P＜0.001），C-EDA組的腓腸肌肌纖維面積較PNI組增大（P＜0.001），3MA組的腓腸肌肌纖維面積較C-EDA組減少（P＜0.001），見圖2B。

圖2 術(shù)后4周大鼠腓腸肌萎縮程度比較

2.3 各組大鼠神經(jīng)傳導速度比較神經(jīng)電生理檢測結(jié)果顯示，PNI組的神經(jīng)沖動潛伏期較Sham組明顯延長（P＜0.001），C-EDA組的神經(jīng)沖動潛伏期與PNI組相比明顯縮短（P＜0.001），3MA組神經(jīng)沖動潛伏期較C-EDA組延長（P＜0.001），見圖3。

圖3 術(shù)后4周各組大鼠神經(jīng)電生理檢測結(jié)果與神經(jīng)沖動潛伏期比較

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE染色結(jié)果比較為評價PNI組及C-EDA干預(yù)后神經(jīng)纖維和髓鞘的組織學改變，在損傷后4周對各組神經(jīng)縱、橫切片進行HE染色。縱切面染色顯示PNI組的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)疏松、無序。C-EDA組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)比PNI組更致密、均勻，3MA組的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)與C-EDA組相比更加疏松、無序。橫切切片染色結(jié)果顯示，與PNI組相比，C-EDA組髓鞘形態(tài)完整，排列規(guī)則均勻，而3MA組與C-EDA組相比髓鞘形態(tài)破碎，排列紊亂。見圖4。

圖4 各組大鼠坐骨神經(jīng)HE染色結(jié)果

2.5 各組大鼠坐骨神經(jīng)免疫熒光染色結(jié)果比較坐骨神經(jīng)橫縱切面NF-200和MBP免疫熒光共染色結(jié)果顯示，PNI組的NF-200的熒光面積明顯小于Sham組（P＜0.01），C-EDA組的NF-200的熒光面積明顯大于PNI組（P＜0.01），3MA組的NF-200的熒光面積明顯小于C-EDA組（P＜0.01）。C-EDA組的MBP的熒光面積明顯高于PNI組（P＜0.01），3MA組的MBP的熒光面積與C-EDA組相比降低（P＜0.01）。見圖5A、圖5B。

圖5 大鼠坐骨神經(jīng)橫縱切面免疫熒光共染色圖像（刻度尺長度均為10 μm）

2.6 各組大鼠坐骨神經(jīng)自噬相關(guān)蛋白表達的比較為了探究體內(nèi)自噬和上述效應(yīng)之間的關(guān)系，采用Western blot法檢測大鼠體內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3II/LC3I和p62的表達水平。結(jié)果顯示，PNI組的LC3II/LC3I的比值高于Sham組（P＜0.01），與C-EDA組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），3MA組的LC3II/LC3I的比值較C-EDA組降低（P＜0.01）。PNI組的p62表達水平高于Sham組（P＜0.01），C-EDA組的p62表達水平低于PNI組（P＜0.001），3MA組的p62表達水平較C-EDA組顯著增高（P＜0.01），見圖6。

圖6 Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白表達情況

2.7 各組大鼠坐骨神經(jīng)氧化與凋亡相關(guān)蛋白表達的比較PNI組氧化應(yīng)激的激活可能不利于神經(jīng)纖維和髓鞘再生[17-18]。采用Western blot法檢測HO-1、核內(nèi)Nrf2、Bax和Bcl-2的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與Sham組相比，PNI后HO-1和Nrf2水平略有升高（P＜0.05，P＜0.01）。而在使用C-EDA治療后，這一趨勢明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），見圖7A。PNI組的促凋亡蛋白Bax水平高于Sham組（P＜0.001），而C-EDA組的促凋亡蛋白Bax水平較PNI組有所降低（P＜0.05）。PNI組抗凋亡蛋白Bcl-2的水平較Sham組降低（P＜0.001），使用C-EDA治療后Bcl-2的水平與PNI組相比有所升高（P＜0.01），見圖7A。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與Sham組相比，PNI組的Bax/Bcl-2 的比值顯著升高（P＜0.001），使用C-EDA治療后，Bax/Bcl-2的比值顯著降低（P＜0.001），見圖7B。MDA檢測結(jié)果顯示，PNI組的MDA水平較Sham組顯著升高（P＜0.001），而在使用C-EDA治療后，體內(nèi)MDA的水平顯著降低（P＜0.001），見圖7C。

圖7 各組氧化相關(guān)蛋白和凋亡蛋白表達水平和MDA檢測結(jié)果

3 討論

C-EDA是一種已在臨床上廣泛應(yīng)用的處方藥物，由依達拉奉和右坎醇配比組成，依達拉奉具有抗氧化作用，而右莰醇具有抗炎作用，兩種組分協(xié)同增效，進而發(fā)揮更有效的神經(jīng)保護作用。目前，大部分學者仍在深入探討C-EDA對腦缺血再灌注損傷等腦卒中疾病的治療機制，C-EDA所調(diào)控的的分子信號網(wǎng)絡(luò)逐漸清晰[19]。然而，在周圍神經(jīng)相關(guān)疾病 中，鮮有研究報道C-EDA是否具有同樣的治療作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中，已有學者通過研究證實C-EDA具有神經(jīng)保護作用。ZHANG等[19]研究證實，C-EDA能夠通過激動絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1介導的絲裂原活化蛋白激酶抑制和激動Nrf2，抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以維持微環(huán)境穩(wěn)定，促進腦功能修復(fù)。目前，已有部分學者發(fā)現(xiàn)C-EDA對周圍神經(jīng)也具有保護作用[20]。有研究[21]證實，大鼠周圍神經(jīng)遭受缺血再灌注損傷時，C-EDA能夠抑制周圍神經(jīng)缺血再灌注損傷慢性期活性氧的產(chǎn)生以及抑制炎癥反應(yīng)，從而在缺血再灌注損傷后發(fā)揮周圍神經(jīng)保護作用。

在本研究中，筆者在大鼠PNI模型中通過腹腔注射C-EDA來探討C-EDA對PNI修復(fù)的影響。研究中發(fā)現(xiàn)，C-EDA組的SFI值較PNI組降低，后足形態(tài)與PNI組相比也更為舒展。神經(jīng)電生理檢測結(jié)果中，C-EDA組的動作電位潛伏期較PNI組有所縮短。C-EDA組的腓腸肌濕重比和HE染色肌纖維面積較PNI組顯著增高。表明C-EDA改善了神經(jīng)支配肌肉的失神經(jīng)營養(yǎng)狀態(tài)，從而改善了大鼠后足的攣縮程度以及改善了PNI后的神經(jīng)傳導功能，減輕了PNI后腓腸肌的萎縮。此外，神經(jīng)的HE染色結(jié)果顯示，與PNI組相比，C-EDA組的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)更加緊密，排列更加有序，髓鞘形態(tài)更為完整。神經(jīng)橫縱切片的NF200+MBP免疫熒光共染色結(jié)果顯示，C-EDA組的NF200以及MBP的熒光面積與PNI組相比增高，表明C-EDA治療可以促進PNI后髓鞘和神經(jīng)纖維的修復(fù)。

自噬是體內(nèi)主要的降解系統(tǒng)，它發(fā)生在細胞內(nèi)，細胞內(nèi)物質(zhì)和異常細胞器由該系統(tǒng)被遞送至溶酶體并在溶酶體中降解[12]。有研究發(fā)現(xiàn)海藻糖通過不依賴mTOR的途徑增強自噬體募集，增強神經(jīng)元中的自噬。增強的自噬通過內(nèi)在的線粒體依賴性途徑抑制細胞凋亡，減少病變腔擴張和神經(jīng)元死亡，并最終改善SCI后的功能恢復(fù)[22]。在PNI的早期階段，受損或功能失調(diào)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細胞器積聚在病變部位，產(chǎn)生局部應(yīng)激，阻礙施旺細胞（Schwann cell, SCs）刺激神經(jīng)修復(fù)的能力。調(diào)節(jié)PNI后的自噬，能夠清除病變部位積聚的功能失調(diào)的蛋白和細胞器等，從而促進SCs修復(fù)受損的神 經(jīng)[23]。在本研究中，通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)損傷后明顯增強的自噬，在給予C-EDA后沒有明顯的改變。然而，C-EDA促進PNI后大鼠的后足形態(tài)、腓腸肌萎縮程度和神經(jīng)傳導功能等運動功能恢復(fù)和神經(jīng)、髓鞘的再生和修復(fù)以及下調(diào)體內(nèi)外的凋亡水平，上述的治療效果在使用3MA抑制自噬后被逆轉(zhuǎn)。說明該自噬水平的升高可能是有利于神經(jīng)的再生和修復(fù)的。然而相對于PNI組而言，C-EDA組的自噬水平?jīng)]有明顯的變化。有研究[24]發(fā)現(xiàn)增加自噬流可能是PNI的潛在治療靶點。自噬的目的不是簡單地消除物質(zhì)，而是作為一個動態(tài)循環(huán)系統(tǒng)，這個動態(tài)循環(huán)稱為自噬流[12-14]。ISSA等[25]發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白可以上調(diào)自噬流，抑制帕金森病腦內(nèi)過度的氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用和預(yù)防突觸核蛋白α誘發(fā)的帕金森病樣癥狀。故推測本研究中C-EDA的治療作用可能不只是來源于自噬活性的升高，更多的可能是因為通暢了自噬流。為了驗證這一推測，筆者檢測了體內(nèi)外各組的自噬底物蛋白p62的表達水平。當自噬通暢時，作為自噬底物的p62會被消耗而水平降低。反之，自噬受阻時，p62的水平會升高，可以反映自噬的通暢性。結(jié)果顯示損傷刺激后p62水平顯著增高，在使用C-EDA治療后p62水平顯著降低，使用3MA抑制自噬后，C-EDA對下調(diào)p62水平的效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明損傷刺激會抑制自噬流，而C-EDA治療能夠恢復(fù)損傷刺激抑制的自噬流。

氧化應(yīng)激被認為是損傷后導致神經(jīng)損傷的主要原因之一，不利于PNI后的神經(jīng)功能恢復(fù)。氧化應(yīng)激介導的神經(jīng)元變性可以通過抗氧化防御的耗盡、微管破壞、脫髓鞘、神經(jīng)炎癥、線粒體自噬損傷和細胞凋亡引起的神經(jīng)元死亡來執(zhí)行[26-28]。筆者猜?測C-EDA對于PNI后的保護和促恢復(fù)作用可能與其抑制過度的氧化應(yīng)激有關(guān)。通過檢測抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2（核內(nèi)）、抗氧化酶HO-1以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。結(jié)果顯示，與PNI組相比，C-EDA組的Nrf2和HO-1表達水平增高，Bax水平降低，Bcl-2水平增高，Bax/Bcl-2比值降低。表明在PNI后，C-EDA能進一步提高體內(nèi)的抗氧化水平和降低體內(nèi)的凋亡水平來促進損傷神經(jīng)的修復(fù)。

綜上所述，本研究首先證明C-EDA能夠促進PNI后神經(jīng)纖維和髓鞘修復(fù)以及運動功能恢復(fù)，且C-EDA對于PNI后的治療作用與其能夠恢復(fù)損傷后受抑制的自噬流以及對抗過度的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。此外，C-EDA作為一種抗氧化活性物質(zhì)可以抑制過度激活的氧化應(yīng)激，為PNI的治療提供了一種新的可能。然而，本研究還未對C-EDA的抗氧化作用與增強自噬通量作用之間的聯(lián)系進行詳細研究，下一步研究重點為討論C-EDA的抗氧化應(yīng)激作用與增強自噬通量作用之間的相互作用及其分子機制。