發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的研究

蔣曉蕊 許 巖 李 婷 曹寶帥 張李莉 范桂強(qiáng) 孫金旭

（1 衡水市質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化研究院 河北 衡水 053000；2 衡水市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心 河北 衡水 053000； 3 衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，2015 年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委把覆盆子列為藥食同源食品。藥用覆盆子為覆盆子未成熟果實(shí)，經(jīng)采摘熱燙后，干燥而成。覆盆子具有多種功能性成分，如黃酮類化合物、多酚類物質(zhì)、鞣花酸、生物堿、有機(jī)酸、甾醇等[1，2]。研究證明，覆盆子入膀胱經(jīng)，覆盆子提取物和活性成分具有抗氧化、防癌抗癌、抗老化、溫腎補(bǔ)腎、預(yù)防心腦血管疾病等功效[3～5]。黃酮類化合物為覆盆子中的主要功能成分，具有重要的作用。藥物中提取黃酮的方法很多，發(fā)酵法提取功能成分，微生物在發(fā)酵生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生很多種酶如纖維素酶、蛋白酶等，這些酶對(duì)植物細(xì)胞破壁起到關(guān)鍵性作用，有利于提高提取率。本研究旨在以覆盆子為原料，利用發(fā)酵法提取覆盆子中的黃酮類物質(zhì)，為工業(yè)提取提供支持，有利于覆盆子黃酮的藥物應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料。覆盆子(北京同仁堂衡水分店)經(jīng)清洗后，烘干，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80 目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng))，菌種(衡水學(xué)院生命科學(xué)系菌種室保藏)。

1.2 儀器設(shè)備。破壁機(jī)(深圳市凈品環(huán)?？萍加邢薰?；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；分光光度計(jì)(722G 可見分光光度計(jì)廣州廣一科學(xué)儀器有限公司)；發(fā)酵桶8 L(特百惠食品級(jí))。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確的稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用60%的乙醇溶解后轉(zhuǎn)入100 ml 的容量瓶中定容，搖勻，得到100 mg/L 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用移液槍準(zhǔn)確的量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，加入到比色管中，依次添加濃度為5%的NaNO21 ml，搖勻后，靜置10 min，添加10%的硝酸鋁1 ml，搖勻后靜置10 min，添加10%的氫氧化鈉溶液10 ml，搖勻后用60%的乙醇溶液添加至刻度線，搖勻后，510 nm 測(cè)定吸光度值。以測(cè)定的吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析得到回歸方程：A=0.0137C-0.052，R2=0.997。

1.3.3 覆盆子黃酮測(cè)定。取經(jīng)發(fā)酵提取過(guò)濾后的覆盆子黃酮提取液20 ml，用濃度為60%的乙醇溶液稀釋至50 ml 后，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液處理方法處理后測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種對(duì)發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的影響。菌種不同，代謝途徑不同，產(chǎn)生的酶不同，對(duì)粉碎后的覆盆子細(xì)胞壁破壞程度不同，提取效果也不同。根據(jù)參考文獻(xiàn)資料報(bào)道，分別選取枯草芽孢桿菌、黑曲霉、安琪酵母、木醋桿菌、乳酸菌作為發(fā)酵菌，普通提取作為對(duì)照，研究菌種對(duì)發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的影響，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 分析可知，發(fā)酵法提取較普通提取，雖然使用的菌種不同，但都能提高覆盆子黃酮的提取率，菌種不同產(chǎn)生的酶系不同，破壁提取的效果不同。相比之下，使用安琪酵母作為菌種，覆盆子黃酮的提取量達(dá)到29.65 mg/g，相對(duì)普通水提，提取率提高最大，其它雖然也有提高，但提取率增加不大，因此，安琪酵母作為發(fā)酵提取菌種較為適宜。

圖1 菌種對(duì)發(fā)酵提取的影響

2.2 料液比例對(duì)發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的影響研究。根據(jù)報(bào)道，料液比例對(duì)提取活性成分也會(huì)產(chǎn)生很大的影響，適宜的料液比例會(huì)有利于破壁提取，分別設(shè)定料液比例為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，經(jīng)處理后，安琪酵母按照1.0%的接種量接種，培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)間為24 h，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾殺菌后測(cè)定黃酮含量，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，料液比例對(duì)發(fā)酵法提取覆盆子黃酮影響較大，隨著料液比例的增大(溶液濃度的降低)，覆盆子黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)料液比例為1∶20時(shí)，發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的提取量最大，之后隨料液比例的增加，覆盆子黃酮提取量有所降低，表明料液比例1∶20 較為適宜，具體原因有待于進(jìn)一步分析。

圖2 料液比例對(duì)發(fā)酵提取的影響

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵法提取覆盆子黃酮的影響。處理后的覆盆子，按照1∶20 的料液比例，經(jīng)煮沸滅菌，降溫后按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的接種量接種安琪酵母，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)24 h 后測(cè)定覆盆子黃酮提取量，結(jié)果如圖3 所示。接種量不同，也就是發(fā)酵初始的發(fā)酵液中菌種數(shù)量不同，覆盆子黃酮提取量不同。低接種量，菌量增加較慢，高接種量，菌之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，所以需要尋找適宜的接種量。經(jīng)測(cè)定分析，安琪酵母接種量為2%時(shí)，覆盆子黃酮提取量最高，確定2%為安琪酵母適宜接種量。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵提取的影響

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵法黃酮提取量的影響。經(jīng)處理后的覆盆子，按1∶20 的料液比例，經(jīng)煮沸滅菌，自然降溫至28 ℃，安琪酵母接種量2%，發(fā)酵液每8 h 取樣測(cè)定1 次，結(jié)果如圖4 所示。發(fā)酵時(shí)間不同，菌種的代謝產(chǎn)物差別較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，覆盆子黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h 時(shí)，覆盆子黃酮提取量最大，因此確定發(fā)酵時(shí)間以36 h 較為適宜。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵提取的影響

2.5 普通提取與發(fā)酵提取覆盆子黃酮對(duì)比分析。優(yōu)化后的發(fā)酵法提取覆盆子黃酮與普通熱浸提覆盆子黃酮對(duì)比分析如圖5 所示。對(duì)比分析可知，優(yōu)化后發(fā)酵法提取覆盆子黃酮提取量達(dá)到42.36 mg/g，普通熱水浸提覆盆子黃酮提取量為17.30 mg/g，優(yōu)化后的發(fā)酵法提取覆盆子黃酮相對(duì)普通提取提高144.86%，表明發(fā)酵法提取覆盆子黃酮是非常行之有效的提取方法。

圖5 發(fā)酵法與普通法對(duì)比分析

3 結(jié)論與討論

利用發(fā)酵法和普通法對(duì)比提取覆盆子黃酮，對(duì)發(fā)酵法提取從菌種選擇、料液比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化研究，優(yōu)化后的發(fā)酵法提取覆盆子黃酮提取工藝為：菌種選擇安琪酵母，料液比例1∶20，接種量2%，發(fā)酵時(shí)間36 h，此條件下覆盆子黃酮提取量為42.36 mg/g，相對(duì)于普通熱浸提提高144.86%，菌在發(fā)酵生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生大量多種多樣的酶，這些酶對(duì)植物細(xì)胞壁破壁作用效果明顯。表明發(fā)酵法提取覆盆子黃酮是行之有效的提取方法。