響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助超高壓改善牛肉質(zhì)構(gòu)的研究

楊寧寧，鄧源喜，武 杰，馬 龍

（蚌埠學(xué)院 食品與生物學(xué)院，安徽蚌埠 233030）

超高壓技術(shù)（Ultra-high pressure） 是在密閉的高壓容器中，用液態(tài)水作為介質(zhì)，通過加壓產(chǎn)生高壓（100～1 000 MPa），使食品物料的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、淀粉糊化，能夠?qū)κ称返馁|(zhì)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整的一種新型食品加工技術(shù)[1-3]。作為一種綠色安全的食品加工技術(shù)，超高壓技術(shù)在肉制品加工領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛[4-6]。鮮肉經(jīng)超高壓處理后能夠改善肉品嫩度[7-8]、延長貨架期，過高的靜壓力也會導(dǎo)致肉品pH 值的改變及脂肪氧化加劇[9]等理化性質(zhì)的變化。超聲波（Ultrasonic） 是一種綠色的能源，是通過波的形式穿透物體，其空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)可引起肉中組織蛋白酶和Ca2+的釋放，破壞肌原纖維和結(jié)締組織，從而起到嫩化作用[10-13]。

隨著食品工業(yè)的發(fā)展及對牛肉制品需求的提高，消費者對原料牛肉的品質(zhì)要求也進(jìn)一步提升[14]。嫩度是決定牛肉食用品質(zhì)的最重要指標(biāo)之一，影響肉嫩度的重要因素是肌原纖維的結(jié)構(gòu)和結(jié)締組織中膠原蛋白的含量、結(jié)構(gòu)、溶解性和分子之間的交聯(lián)程度等。關(guān)于超聲波和超高壓技術(shù)單獨對肉的嫩化處理已有較多研究報道[15-18]，主要探討超高壓技術(shù)與超聲波的協(xié)同作用對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響，為牛肉質(zhì)構(gòu)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛半腱肌肉，購自蚌埠大潤發(fā)超市，其生理成熟度和背膘厚度等指標(biāo)基本相似，真空包裝-18 ℃下凍存，試驗前進(jìn)行解凍。

試 劑：CaC12、NaCl、KCl、NaHCO3、碘 乙 酸，均為分析純；L(-)- 羥脯氨酸，法國Sigma-Aldrich（FlukaAnalytica1） 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UHPF-750MPa 型超高壓食品處理裝置，包頭科發(fā)新型高技術(shù)食品機(jī)械有限公司產(chǎn)品；HN-15AL 型超聲波設(shè)備，上海汗諾儀器有限公司產(chǎn)品；TA-XT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems 公司產(chǎn)品；HH 型恒溫水浴鍋，江蘇中大儀器廠產(chǎn)品；FA214 型電子天平，上海?？惦娮觾x器廠產(chǎn)品；C-LM3B 型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院產(chǎn)品；FJ-200 型高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本儀器廠產(chǎn)品；TGL-20M 型臺式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 超高壓處理

將牛半腱肌肉從冰箱中取出至室溫解凍，清洗修整，然后把肉塊切成6 cm×4 cm×2 cm，形狀相同、厚薄均勻的肉條，分組真空包裝。在室溫條件下（25 ℃），用水作為超高壓處理的介質(zhì)，將其他組牛肉樣品分別放入超高壓儀器中，設(shè)置不同的壓力進(jìn)行保壓15 min。未進(jìn)行超高壓處理的試驗組作為空白對照。取出牛肉樣品，擦干表面水分，真空包裝后放入5 ℃冰箱中待測定。

1.3.2 超聲波處理

將牛半腱肌肉從冰箱中取出至室溫解凍，洗去血污，然后把肉塊切成大小6 cm×4 cm×2 cm，形狀相同、厚薄均勻的肉條，分組真空包裝。未進(jìn)行超聲波處理的試驗組作為空白對照，其他組分別放入超聲波設(shè)備中進(jìn)行不同溫度和時間的超聲處理。處理完畢之后，放入5 ℃冰箱中待測定。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)測定

采用TA-XT plus 質(zhì)構(gòu)儀對樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測定，探頭型號為P/25。測定條件為：測前速度2 mm/s，測試速度2 mm/s，測后速度1 mm/s，壓縮樣品高度為40%，探頭2 次測定間隔時間5 s，觸發(fā)類型為自動，觸發(fā)力為7 g[19]。

1.3.4 剪切力測定

采用C-LM3B 數(shù)顯式肌肉嫩度儀對樣品進(jìn)行剪切力測定，用空心取樣器將處理好的牛肉剪成直徑為12.7 mm 的標(biāo)準(zhǔn)肌肉條，用肌肉嫩度儀沿肌纖維垂直方向剪切肉柱，記錄讀數(shù)，做3 組平行試驗，取平均值即為最終牛肉的剪切力[20]。

1.3.5 膠原蛋白提取及含量測定

稱取50 g 牛肉樣品，切成約為1 cm 的肉丁，加入濃度為50 mmol/L 的預(yù)冷后的CaC12溶液50 mL，用高速分 散均質(zhì)機(jī)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 處理30 s，經(jīng)尼龍網(wǎng)（100 目） 過濾，濾渣用預(yù)冷的50 mmol/L CaC12溶液50 mL，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 處理30 s，再過濾，上述過程再重復(fù)2 次。最終得到的濾渣為結(jié)締組織膠原蛋白[21]。

采用Ringer'S試劑溶解法提取可溶性膠原蛋白[22-23]?？扇苄阅z原蛋白含量[24]=羥脯氨酸含量×7.25.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每試驗處理組重復(fù)測定5 次，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗數(shù)據(jù)用（X±S） 的形式表示；用單因素方差分析各處理組之間的差異顯著性。

1.3.7 單因素試驗

（1） 不同壓力水平對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響。在室溫條件下，將處理好的牛肉樣品放入超高壓食品處理裝置內(nèi)，分別設(shè)置100，200，300，400，500 MPa壓力進(jìn)行保壓試驗15 min，取出置于5 ℃冰箱內(nèi)待測定。

（2） 不同超聲時間對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響。確定最佳的超高壓壓力后，在室溫條件下（25 ℃），把樣品放入超聲波處理裝置內(nèi)，超聲功率為160 W，分別經(jīng)過30，40，50，60，70 min 超聲處理，取出置于5 ℃冰箱內(nèi)待測定。

（3） 不同超聲溫度對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響。確定最佳的壓力和超聲時間后，把樣品放入超聲波處理裝置內(nèi)，設(shè)置超聲功率為160 W，分別經(jīng)過10，20，30，40，50 ℃超聲處理，取出置于5 ℃冰箱內(nèi)待測定。

1.3.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以超高壓壓力水平（A）、超聲時間（B） 和超聲溫度（C） 為3 個因素，以牛肉剪切力值為響應(yīng)值（Y） 進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，探討改善牛肉嫩度最佳的超高壓壓力，超聲時間和超聲溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓壓力對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

當(dāng)保壓溫度為25 ℃，保壓時間15 min 時，隨著超高壓處理壓力的增大，牛肉樣品的硬度、彈性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且在300～400 MPa 時取得最低值。樣品經(jīng)過超高壓處理后，由于壓力作用使牛肉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體等結(jié)構(gòu)遭到破壞，Ca2+被釋放出來，鈣激活酶被激活，促進(jìn)了肌肉蛋白水解，加速了牛肉成熟，導(dǎo)致牛肉硬度降低，嫩度得到有效改善。當(dāng)處理壓力為200～400 MPa時，高靜壓力使牛肉肌原纖維斷裂，肌肉的結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，硬度有所下降，相應(yīng)的彈性和咀嚼性也降低；當(dāng)壓力大于400 MPa 時，過高的靜壓力導(dǎo)致牛肉結(jié)締組織膠原蛋白發(fā)生變性，其機(jī)械強(qiáng)度有所增加，牛肉的硬度、彈性和咀嚼性都有所上升。這說明200～400 MPa 的壓力可以有效改善牛肉的質(zhì)構(gòu)特性，而且在處理壓力300 MPa 時效果最好。

不同超高壓壓力水平對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響見表1。

表1 不同超高壓壓力水平對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

2.2 超聲時間對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

不同超聲時間對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響見表2。

表2 不同超聲時間對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

當(dāng)超聲時間為30～40 min 時，牛肉的硬度下降較為明顯，這在一定程度上說明了超聲處理具有肌肉嫩化的作用。對于彈性而言，當(dāng)超聲時間30～40 min時，與對照組相比牛肉彈性顯著降低，因為超聲處理會改變肌肉纖維收縮、肌纖維骨架蛋白和結(jié)締組織的含量[25]，在一定時間內(nèi)對牛肉進(jìn)行超聲波處理可以有效降低肌肉剪切力，從而使彈性降低。由上述分析可知，牛肉在40 min 的超聲處理后可以更好地改善其質(zhì)構(gòu)特性。

2.3 超聲溫度對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

不同超聲溫度對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響見表3。

表3 不同超聲溫度對牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

由表3 可知，隨著超聲溫度逐漸升高，牛肉硬度和咀嚼性呈現(xiàn)先緩慢下降后快速下降的趨勢。因為超聲溫度過高，會引起蛋白質(zhì)和脂肪分解，蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，牛肉汁液流失加劇，導(dǎo)致牛肉硬度和咀嚼性變化較大。牛肉樣品經(jīng)過超聲處理后，牛肉的彈性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)超聲溫度處于20 ℃時，牛肉彈性達(dá)到最高值?？傮w來看，當(dāng)超聲溫度處于20～30 ℃時，牛肉的硬度會有所下降，牛肉的彈性增加，能夠有效地改善牛肉的質(zhì)構(gòu)特性。

2.4 超聲波輔助超高壓處理過程中牛肉肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白含量的變化

當(dāng)超聲時間15 min，超聲功率為160 W，超聲溫度20 ℃，超聲時間40 min 時，探討不同超高壓壓力對牛肉肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白含量的變化。

不同超高壓壓力對牛肉結(jié)締組織膠原蛋白含量的影響見表4。

表4 不同超高壓壓力對牛肉結(jié)締組織膠原蛋白含量的影響

由表4 可知，超高壓壓力對牛肉結(jié)締組織中總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白的含量具有一定的影響，隨著壓力的升高，兩者的含量也逐漸增加。牛肉經(jīng)高壓及超聲波空化協(xié)同作用后，肌原纖維部分?jǐn)嗔?，提高了部分膠原蛋白的溶解性[26]。研究表明膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化能夠影響肉的嫩度[27]，隨著可溶性膠原蛋白含量的增加，牛肉的質(zhì)構(gòu)特性也會發(fā)生改變，硬度和彈性不斷下降，牛肉的嫩度得到有效改善。

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.5.1 Box- behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計

采用Box-behnken Design（BBD） 進(jìn)行試驗設(shè)計，以超高壓壓力、超聲時間、超聲溫度為自變量，分別用A，B，C 表示，以編碼值-1，0，1 代表因素A，B，C 的相應(yīng)水平。利用Design Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗安排，以牛肉的剪切力值為響應(yīng)值。

響應(yīng)面試驗因素水平編碼表見表5，響應(yīng)面試驗及結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗因素水平編碼表

表6 響應(yīng)面試驗及結(jié)果

2.5.2 主效應(yīng)分析

回歸模型方差分析見表7。

表7 回歸模型方差分析

對上述試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到牛肉剪切力和編碼自變量的二次回歸模型方程：

由表7 可知，模型的F=30.34，p＜0.000 1，證明試驗所選用的二次模型具有極顯著性。失擬項F=3.18，p=0.146 7＞0.05，失擬不顯著，結(jié)果表明該回歸方程與實測值的擬合度較好。模型中一次項超聲波處理溫度（C） 則顯著的（p＜0.05），超高壓壓力（A） 和超聲時間（B） 的影響均是不顯著的（p＞0.05）。在交互項中，因素A×C 是極顯著的（p＜0.01）。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序為C＞A＞B，即超聲溫度＞超高壓壓力＞超聲時間。回歸模型參數(shù)見表8。

表8 回歸模型參數(shù)

表8 中模型的決定系數(shù)R2（校正后） 為94.29%，說明該模型可以解釋94.29%響應(yīng)值的變化，方程擬合較好，并且變異系數(shù)為3.00%，表明試驗的精確度高、可靠性強(qiáng)。所以，該回歸方程可用來對牛肉質(zhì)構(gòu)中的嫩度進(jìn)行優(yōu)化。

2.5.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對牛肉剪切力影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖1。

圖1 各因素交互作用對牛肉剪切力影響的響應(yīng)面和等高線圖

在圖1（b） 中，超高壓壓力（A） 和超聲溫度（C） 交互作用的響應(yīng)曲面較為陡峭，等高線圖呈橢圓狀，表明這2 組因素間的交互作用較強(qiáng)，這與上述模型方差分析因素A×C 是極顯著的（p＜0.01） 是相符合的；超高壓壓力（A） 和超聲時間（B）、超聲時間（B） 和超聲溫度（C） 響應(yīng)曲面較為平緩，等高線圖中心圓趨近圓形，說明因素間交互作用相對較弱。

通過回歸模型的預(yù)測，得到牛肉質(zhì)構(gòu)剪切力最小的條件為超高壓壓力302.52 MPa，超聲時間41.37 min，超聲溫度23.31 ℃，模型預(yù)測剪切力值為36.32 N。利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行多次驗證試驗，實際測得的平均剪切力值為36.89，與模型預(yù)測值進(jìn)行對比，相對誤差僅為1.57%，說明響應(yīng)面試驗的精確度高，可靠性強(qiáng)。一般市售新鮮牛肉的剪切力值為50～60 N，試驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助超高壓處理的牛肉其質(zhì)構(gòu)得到改善，剪切力值下降了30%～40%，嫩度得到了有效提升，具有一定的實用價值。

3 結(jié)論

超高壓技術(shù)與超聲波協(xié)同處理可以改善牛肉的質(zhì)構(gòu)特性，起到一定的嫩化作用。超聲波輔助超高壓處理后的牛肉結(jié)締組織總膠原蛋白和可溶性膠原蛋白的含量隨著處理壓力的升高而增加。隨著可溶性膠原蛋白含量的增加，牛肉的質(zhì)構(gòu)特性也會發(fā)生改變，硬度和彈性不斷下降，牛肉的嫩度得到有效改善。通過響應(yīng)面法對回歸模型進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，對于牛肉的嫩度值各因素影響程度大小順序為超聲溫度＞超高壓壓力＞超聲時間。通過優(yōu)化驗證，牛肉質(zhì)構(gòu)剪切力最小的條件為超高壓壓力302.52 MPa，超聲時間41.37 min，超聲溫度23.31 ℃，模型預(yù)測剪切力值為36.32 N。與一般市售新鮮牛肉相比，其剪切力值下降了30%～40%，具有一定的生產(chǎn)應(yīng)用價值。